趙董麗，朱影，黃常新

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，浙江杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，浙江杭州 310000；3.杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，浙江杭州 310000

腫瘤細(xì)胞基因組突變可轉(zhuǎn)錄、翻譯產(chǎn)生異常蛋白質(zhì)，異常蛋白質(zhì)酶解生成的異源性肽與正常細(xì)胞表達(dá)的氨基酸序列并不一致，其可被抗原提呈細(xì)胞中的主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）所識別，MHC可將抗原肽提呈至抗原提呈細(xì)胞表面，供T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）所識別和活化，最終激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）發(fā)揮特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)。自腫瘤特異性抗原、腫瘤相關(guān)抗原等相關(guān)研究開展至今，抗原的發(fā)現(xiàn)與抗原改造便如影隨形，成為基于抗原肽抗腫瘤免疫治療中最主要的兩大問題。

1 腫瘤新抗原的鑒定篩選技術(shù)

腫瘤新抗原的體外篩選是將腫瘤組織全外顯子測序、轉(zhuǎn)錄組測序、蛋白質(zhì)譜、T細(xì)胞組庫測序、計(jì)算機(jī)機(jī)器學(xué)習(xí)預(yù)測新抗原與體外實(shí)驗(yàn)等技術(shù)聯(lián)合，鑒定具有抗腫瘤免疫效應(yīng)的高效腫瘤新抗原，見圖1。

圖1 腫瘤新抗原的體外篩選技術(shù)

1.1 外顯子測序技術(shù)

研究人員使用高通量測序技術(shù)，將腫瘤細(xì)胞中的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）與正常健康組織進(jìn)行比較，找到腫瘤患者個體化的非同義突變，以預(yù)測腫瘤特異性新抗原。2017年，Sahin等[1]首次將個體化突變體疫苗應(yīng)用于人體，通過外顯子測序技術(shù)全面識別個體突變，設(shè)計(jì)和合成針對黑色素瘤患者的個體化腫瘤疫苗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有接種該疫苗的受試者體內(nèi)均產(chǎn)生強(qiáng)大且高效的特異性抗腫瘤T細(xì)胞應(yīng)答，5例轉(zhuǎn)移瘤患者中的2例患者表現(xiàn)出與疫苗相關(guān)的客觀緩解，此研究開辟新抗原免疫治療道路。

外顯子測序技術(shù)的測序數(shù)據(jù)量大、測序深度高，測序技術(shù)已較為成熟，檢測到的突變基因較可靠，已在臨床和科研中廣泛應(yīng)用。但RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯修飾及后續(xù)酶解等一系列“黑箱”過程中的不可預(yù)知性也極大地制約其應(yīng)用。

1.2 蛋白質(zhì)譜技術(shù)

基于蛋白質(zhì)譜技術(shù)從腫瘤細(xì)胞表面分離人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）結(jié)合的肽段是鑒定HLA限制性新抗原的可靠方法。Bassani-Sternberg等[2]率先應(yīng)用先進(jìn)的質(zhì)譜技術(shù)直接從黑色素瘤患者的原始腫瘤組織中找到突變的肽配體，這些肽段被認(rèn)為是與腫瘤免疫治療策略高度相關(guān)的真正新表位。Chong等[3]利用基于質(zhì)譜技術(shù)的分析方法表征非常規(guī)的HLA肽庫，該方法可準(zhǔn)確鑒定數(shù)百種共享的腫瘤特異性非常規(guī)HLA肽。

質(zhì)譜技術(shù)可鑒定數(shù)以千計(jì)的非典型多肽，大多數(shù)非典型多肽來自于蛋白質(zhì)編碼區(qū)域以外序列或由非典型抗原加工產(chǎn)生[4-6]。這反映從基因表達(dá)到蛋白質(zhì)翻譯，再到蛋白酶體酶解為抗原肽等過程需經(jīng)歷漫長“幕后”操作，但因大多數(shù)抗原表位與HLA結(jié)合時間較短，洗脫時易發(fā)生分離，質(zhì)譜技術(shù)檢測突變多肽的敏感度較低、假陰率較高，且質(zhì)譜技術(shù)對樣本要求較高，單純依靠質(zhì)譜技術(shù)鑒定與HLA結(jié)合的肽段，很難全面獲取真實(shí)表達(dá)的新抗原。

1.3 T細(xì)胞測序技術(shù)

鑒于程序性死亡蛋白1單抗抗腫瘤免疫治療的顯著獲益，TCR等表面分子已成為有發(fā)展前景的生物標(biāo)志物[7]。TCR表達(dá)的豐度差異可部分解決新抗原篩選、肽加工和MHC呈遞候選表位靶標(biāo)的臨床實(shí)用性考量等問題，從而輔助疫苗設(shè)計(jì)[8]。

作為基于新抗原等多種免疫治療的生物標(biāo)志物，TCR可間接反映新抗原能否引起特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答及應(yīng)答的程度，其具有敏感度高且所需樣本較少等特點(diǎn)，并可應(yīng)用于新型TCR或嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）的工程化免疫細(xì)胞治療等領(lǐng)域。TCR應(yīng)用的主要問題是其在免疫應(yīng)答過程中的動態(tài)變化，僅靠瞬時檢測結(jié)果缺乏客觀準(zhǔn)確性，且現(xiàn)階段無法僅靠TCR準(zhǔn)確預(yù)測新抗原表位，測序費(fèi)用較高，故其尚未在臨床得到廣泛應(yīng)用。

1.4 計(jì)算機(jī)新抗原預(yù)測技術(shù)

隨著生物信息學(xué)、人工智能和機(jī)器學(xué)習(xí)的日益發(fā)展，計(jì)算機(jī)預(yù)測新抗原成為可能。目前，常用的數(shù)據(jù)庫是將HLA-配體組數(shù)據(jù)整合到機(jī)器學(xué)習(xí)算法（如線性回歸和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)）中，采用大量的訓(xùn)練集和測試集以提高HLA等位基因型限制性新抗原預(yù)測能力，主流的預(yù)測數(shù)據(jù)庫包括NetCTL和NetCTLpan[9]。pMHC復(fù)合物能否被TCR識別是至關(guān)重要的預(yù)測因素，T-Scan作為一種TCR表位掃描方法，可系統(tǒng)鑒定T細(xì)胞有效識別的抗原，高通量發(fā)現(xiàn)和分析CTL的靶標(biāo)，這非常有助于研究候選新抗原的免疫原性，為免疫治療提供新靶點(diǎn)[10]。

數(shù)據(jù)庫預(yù)測簡單便捷，但僅靠數(shù)據(jù)庫預(yù)測新抗原存在著大量與體外實(shí)驗(yàn)不一致的結(jié)果，仍需更全面的肽表位信息及體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果提高計(jì)算機(jī)預(yù)測的精度。

2 有效抗原表位的特征

免疫系統(tǒng)不僅能通過免疫監(jiān)視消除腫瘤，也能通過免疫編輯促使腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移?；诖?，腫瘤細(xì)胞會掩蓋其免疫原性特征，并誘導(dǎo)出利于免疫抑制的腫瘤微環(huán)境[11]。因此，鑒定并應(yīng)用高免疫原性的特異性腫瘤抗原表位，才能有效預(yù)防腫瘤逃逸的發(fā)生，見圖2。

圖2 有效抗原表位的特征

2.1 MHC限制性肽表位的殘基特征

2.1.1 抗原表位的HLA錨定殘基特征 Robbins等[12]將黑色素瘤細(xì)胞系2098上表達(dá)的3種突變抗原鑒定為TIL2098的3個靶標(biāo)，對應(yīng)的特異性過繼細(xì)胞治療使得腫瘤發(fā)生消退，并在這一過程中發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)之一的酪蛋白激酶1α1中作為主要錨定位點(diǎn)之一的第2位殘基由絲氨酸突變?yōu)榱涟彼岷?，酪蛋白激?α1肽與HLA-A * 0201結(jié)合親和力提高近10倍。另有研究發(fā)現(xiàn)，HLA配體的氨基端或羧基端特定位置上常存在某些氨基酸的顯著富集和（或）耗盡現(xiàn)象。如在HLA-Ⅱ配體中，酪氨酸常在配體兩端的序列中顯著富集，而組氨酸和脯氨酸通常在這些區(qū)域中缺失[13]。在HLA-Ⅰ配體中，丙氨酸、賴氨酸、絲氨酸和精氨酸常在配體羧基端顯著富集，而脯氨酸在配體兩端耗盡，同時酸性殘基和某些疏水殘基在HLA相關(guān)肽下游表達(dá)不足[14]。研究者們所觀察到的肽側(cè)翼特征可反映蛋白酶的切割偏好，有利于腫瘤疫苗的研制。

2.1.2 殘基特定表達(dá)與免疫原性的關(guān)系 MHC結(jié)合預(yù)測工具對25%的含半胱氨酸表位的抗原肽預(yù)測親和力均低估至1/3甚至更多[15]，另有研究發(fā)現(xiàn)，色氨酸耗竭所導(dǎo)致的色氨酸-苯丙氨酸替代物可擴(kuò)大細(xì)胞表面呈遞的抗原表位，以激活T細(xì)胞反應(yīng)[16]。這些特定氨基酸殘基的特征可有效應(yīng)用于抗原肽的改造。

2.1.3 抗原表位殘基修飾的特征 Bassani-Sternberg等[17]在利用質(zhì)譜洗脫的免疫肽段中檢測到大量的磷酸化HLA多肽，發(fā)現(xiàn)78%的磷酸化發(fā)生在絲氨酸上，且這種修飾在HLA-Ⅰ配體的9-11肽第4位最為突出，同時發(fā)現(xiàn)檢測到的磷酸化HLA多肽中有一個非常保守的基序，其第1位氨基酸殘基（P1）首選精氨酸和賴氨酸，第4位氨基酸殘基（P4）為磷酸化位點(diǎn)，該基序可增加低親和力肽HLA結(jié)合力，并通過P4的磷酸化向TCR直接呈遞磷酸化位點(diǎn)提高免疫原性。

在基于人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）腫瘤疫苗研究中發(fā)現(xiàn)，自身免疫耐受可阻止HER2疫苗誘導(dǎo)更持久高效的抗腫瘤免疫；但在通用T細(xì)胞表位中引入對硝基苯丙氨酸可打破HER2的自我耐受，誘導(dǎo)強(qiáng)烈的HER2特異性體液免疫和細(xì)胞免疫，顯著抑制HER2+B16F10腫瘤細(xì)胞的生長[18]。這對開發(fā)治療性癌癥疫苗具有重要意義。

2.2 肽表位的固有特性與HLA相互作用

研究發(fā)現(xiàn)，HLA等位基因偏好于九肽的肽配體，這些HLA等位基因結(jié)合位點(diǎn)更優(yōu)先允許這些短肽嵌入到其“口袋”中；同時，同源肽的高表達(dá)豐度可提高M(jìn)HC-肽的結(jié)合穩(wěn)定性[14]。另有研究表明，TCR接觸殘基的疏水性是免疫原性表位的標(biāo)志，暴露疏水結(jié)構(gòu)域可顯著提高蛋白酶體降解和MHC呈遞的速度[19]。以上這些特點(diǎn)可為腫瘤疫苗的研發(fā)改進(jìn)提供重要的可行性依據(jù)。

2.3 復(fù)雜的變異結(jié)構(gòu)

融合蛋白、剪接異構(gòu)體、突變基因的異常表達(dá)內(nèi)含子等復(fù)雜的變異結(jié)構(gòu)可能是高免疫原性抗原肽的主要來源。相當(dāng)大比例的HLA結(jié)合肽可通過剪接/融合來自一個或兩個不同蛋白質(zhì)的不連續(xù)肽片段而產(chǎn)生[20-21]。在剪接肽中，半胱氨酸殘基常在剪接肽的裂解位點(diǎn)富集，對抗原肽的制備意義重大[22]。

多項(xiàng)研究證實(shí)，復(fù)雜變構(gòu)對新抗原的制備具有重大意義和應(yīng)用價值。Yang等[23]在一位頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者中發(fā)現(xiàn)DEK-AFF2融合衍生的九肽，其在免疫治療反應(yīng)期間出現(xiàn)DEK-AFF2特異性T細(xì)胞反應(yīng)。Hoyos等[24]研究發(fā)現(xiàn)，異常剪接衍生的外顯子-外顯子連接產(chǎn)生的抗原肽具有MHC-I結(jié)合潛力，有望作為腫瘤新抗原。

3 基于免疫原性的肽表位改造

3.1 抗原表位的殘基替換

將位于黑色素細(xì)胞上的酪氨酸酶相關(guān)蛋白2抗原表位與HLA-A*0201分子作用的位點(diǎn)進(jìn)行殘基替換，替換后肽段的親和力和穩(wěn)定性有所提升，其對T細(xì)胞的刺激活化能力及對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力均優(yōu)于野生型酪氨酸酶相關(guān)蛋白2表位[25]。Uchtenhagen等[26]研究發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤相關(guān)表位gp10025-33的第3位置（p3）P修飾（將肽位置3替換為脯氨酸）可直接提高該表位與TCR的親和力。抗原肽結(jié)合基序的氨基端錨定位點(diǎn)（主要是p2和p3）對穩(wěn)定pMHC-I復(fù)合物起關(guān)鍵作用[27]?？乖膒2以酪氨酸代替天冬氨酸，或在氨基端用亮氨酸代替脯氨酸/精氨酸可加固肽的構(gòu)象穩(wěn)定性以利于MHC結(jié)合的肽[28]。依據(jù)殘基間的pi-pi堆砌相互作用對單殘基進(jìn)行替換，特別是p9（如p9F和p9W）被替換后，提高弱抗原的免疫原性、抗原與HLA之間的結(jié)合自由能及CTL活化水平[29]。

3.2 抗原殘基結(jié)構(gòu)的修飾

較小的多肽具有化學(xué)合成優(yōu)勢，但易受內(nèi)源性蛋白酶的快速降解。系列研究發(fā)現(xiàn)，引入足夠數(shù)量和分布的α螺旋骨架修飾來阻礙蛋白酶作用，可解決小分子肽易被降解的不足[30-31]。糖尿病研究發(fā)現(xiàn)天然表位翻譯后修飾（包括瓜氨酸化、氯化、脫酰胺和氧化）后，44%胰島素-B衍生肽與HLA-A * 02：01的結(jié)合能力增強(qiáng)，產(chǎn)生與HLA結(jié)合親和力更強(qiáng)的肽，增強(qiáng)T細(xì)胞識別和活化[32]。腫瘤新抗原肽是否有此類修飾效應(yīng)，尚需實(shí)驗(yàn)予以證實(shí)。

3.3 抗原多肽偶聯(lián)胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（cytidinephosphate-guanosine，CpG）

免疫佐劑可部分解決新抗原肽弱免疫原性的問題。其中，胞嘧啶-硫代磷酸鹽-鳥嘌呤寡聚脫氧核苷酸（CpG oligonucleotide，CpG ODN）因具有低毒、高效等特點(diǎn)而成為近年來常用的免疫佐劑，其包含未甲基化的CpG二核苷酸序列，類似于細(xì)菌DNA中常見的序列，可特異性觸發(fā)Toll樣受體9，有效觸發(fā)樹突狀細(xì)胞的活化和成熟，使其分泌大量細(xì)胞因子、趨化因子和干擾素，有助于增強(qiáng)抗原的呈遞，并誘導(dǎo)極化輔助性T細(xì)胞1型免疫應(yīng)答，見圖3。研究表明抗原肽和CpG ODN須在同一抗原提呈細(xì)胞中共定位，如將抗原肽與CpG以共價偶聯(lián)、物理吸附、納米載體包裹等多種方式形成新型多肽疫苗，使疫苗進(jìn)入同一抗原提呈細(xì)胞內(nèi)并同步釋放，以產(chǎn)生最有效的抗原特異性免疫應(yīng)答[33]。

圖3 新型多肽疫苗活化CD8+T細(xì)胞

4 小結(jié)與展望

綜合國內(nèi)外對新抗原篩選與免疫原性改進(jìn)的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，新抗原的大規(guī)模臨床推進(jìn)與應(yīng)用仍需深入研究，從而簡化篩選流程、鑒定高效腫瘤新抗原。目前，新抗原免疫原性的改造仍聚焦于提高TCR-HLA-peptide三者復(fù)合物的親和力與穩(wěn)定性，積極研究并探索其他可能影響免疫效應(yīng)的因素，并基于體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)及臨床研究的結(jié)果，對其安全性和有效性進(jìn)行評估。