劉 博，高 寧

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

柴胡皂苷d（saikosaponin d，SSd）為五環(huán)三萜齊墩果烷型衍生物，是中藥柴胡的主要有效成分，現(xiàn)代研究表明，SSd 在治療腫瘤、氧化損傷、炎癥反應(yīng)等方面展現(xiàn)出良好效果，還具有免疫調(diào)節(jié)、保肝護(hù)肝等多種作用[1,2]?，F(xiàn)階段SSd 的獲得途徑主要是從柴胡藥材中提取分離，然而柴胡野生資源有限、栽培柴胡則存在占用耕地、生長周期長等問題，影響SSd 的生產(chǎn)及應(yīng)用[3,4]。本課題組前期從狹葉柴胡中分離得到一株能夠合成SSd 的內(nèi)生真菌CHS3[5]。然而，有關(guān)從CHS3 菌體中提取SSd 的方法研究尚未見報道，限制了相關(guān)菌種進(jìn)一步工業(yè)化應(yīng)用?？紤]到超聲輔助提取法具有設(shè)備簡單、操作方便、對樣品破壞小、提取效率高等優(yōu)點[6]，本研究擬采用超聲輔助提取法從CHS3 菌體中提取分離SSd，并利用單因素分析結(jié)合響應(yīng)面法分析溶劑濃度、料液比、超聲功率、超聲時間與超聲溫度對SSd 產(chǎn)量的影響，優(yōu)化SSd 提取工藝，為利用發(fā)酵工程生產(chǎn)SSd 奠定理論與實驗基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

真菌CHS3 分離自狹葉柴胡，保存于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生物技術(shù)教研室。

CHS3 菌體的獲取 無菌條件下挑取CHS3 菌絲，接種于適量馬鈴薯蔗糖液體（Potato Dextrose Broth，PDB） 培養(yǎng)基中，28℃、160r·min-1振蕩培養(yǎng)5d，隨后，按1∶10（v∶v）轉(zhuǎn)移至新鮮PDB 培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，28℃、160r·min-1振蕩培養(yǎng)10d。擴(kuò)大培養(yǎng)結(jié)束后，抽濾除去液體培養(yǎng)基，60℃烘干得到CHS3 菌體備用。

PDB 培養(yǎng)基干粉（北京索萊寶科技有限公司）；無水乙醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；甲醇、乙腈，色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；柴胡皂苷d 對照品（中國食品藥品鑒定研究院）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

DL-CT-2NDIA 型超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；DLHR-Q200 型恒溫振蕩器（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；SHD-D（Ⅲ）型循環(huán)水多用真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司）；FA1204 型電子分析天平（上海精科天美科學(xué)儀器有限公司）；KQ-600KDE 型超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；R220 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；UltiMate 3000 型高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）。

1.3 柴胡皂苷d 提取工藝流程

取干燥后CHS3 菌體粉碎，精密稱取10.00g 菌體，置于200mL 圓底燒瓶中，依照實驗設(shè)計加入乙醇溶液，設(shè)置超聲提取儀的超聲功率、時間及溫度，超聲提取SSd，提取結(jié)束后過濾，對濾渣重復(fù)上述提取過程。合并2 次濾液，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮，最終定容至10mL，得到SSd 提取液。

1.4 高效液相色譜法檢測柴胡皂苷d 含量

1.4.1 對照品溶液制備 精密稱取SSd 對照品5.0mg 置于10mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得到對照品溶液。

1.4.2 供試品溶液的制備 取2mL SSd 提取液，50℃烘干，加入色譜甲醇重新溶解并定容至1mL，0.45μm 微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.4.3 HPLC 色譜條件 色譜柱為HypersilTMODS C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相采用乙腈-水梯度洗脫（0～30min：25%乙腈∶75%水→90%乙腈∶10%水），流速1.0mL·min-1，檢測波長210nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量20μL。

1.4.4 SSd 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取SSd 對照品溶液，色譜甲醇稀釋至終濃度分別為0.0025、0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.1mg·mL-1，按1.4.3 中色譜條件進(jìn)行檢測，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以SSd 對照品濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：Y=107.15X+0.083，R2=0.9986，說明SSd 在0.0025~0.1mg·mL-1濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

1.4.5 計算SSd 產(chǎn)量 對SSd 提取液進(jìn)行HPLC 分析，得到SSd 峰面積，通過對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算SSd 提取液濃度c。利用下式計算SSd 產(chǎn)量：

式中c：提取液濃度，μg·mL-1；V：提取液總體積，mL；m：干燥菌體質(zhì)量，g。

1.5 單因素實驗

1.5.1 乙醇濃度對SSd 產(chǎn)量的影響 以濃度分別為30%、50%、70%、85%、95%的乙醇作為溶劑，料液比為1∶10（g∶mL），超聲功率設(shè)為300W，30℃提取30min，平行實驗3 次。

1.5.2 料液比對SSd 產(chǎn)量的影響 分別設(shè)置料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL），以70%乙醇作為溶劑，超聲功率設(shè)為300W，30℃提取30min，平行實驗3 次。

1.5.3 超聲功率對SSd 產(chǎn)量的影響 超聲功率分別設(shè)置為100、200、300、400、500W，以70%乙醇作為溶劑，料液比為1∶10（g∶mL），30℃提取30min，平行實驗3 次。

1.5.4 超聲時間對SSd 產(chǎn)量的影響 超聲時間分別設(shè)置為10、20、30、40、50min，以70%乙醇作為溶劑，料液比為1∶10（g∶mL），超聲功率設(shè)為300W，提取溫度為30℃，平行實驗3 次。

1.5.5 超聲溫度對SSd 產(chǎn)量的影響 超聲溫度分別設(shè)置為30、40、50、60、70℃，以70%乙醇作為溶劑，料液比為1∶10（g∶mL），超聲功率設(shè)為300W，提取30min，平行實驗3 次。

1.6 響應(yīng)面優(yōu)化實驗設(shè)計

基于單因素實驗結(jié)果，選取乙醇濃度、料液比、超聲時間、超聲溫度作為影響因素，以SSd 產(chǎn)量為響應(yīng)值，設(shè)計4 因素3 水平的Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化實驗，并通過回歸方程擬合得到最佳提取工藝。實驗因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面實驗設(shè)計因素與水平Tab.1 Factors and levels of the response surface design

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0 對單因素實驗結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Design-Expert 13.0 進(jìn)行響應(yīng)面實驗設(shè)計與分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果分析

2.1.1 乙醇濃度對SSd 產(chǎn)量的影響 乙醇濃度對SSd 產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇濃度對SSd 產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on SSd production

由圖1 可見，乙醇濃度從50%升至70%的過程中，SSd 的產(chǎn)量逐漸增加，在乙醇濃度為70%時，SSd產(chǎn)量最高；此后，隨著乙醇濃度繼續(xù)上升，SSd 的產(chǎn)量則呈下降趨勢。結(jié)果表明，乙醇濃度對SSd 的產(chǎn)量有較大影響，可能是由于乙醇濃度的改變造成提取溶劑的極性改變，影響了SSd 及部分雜質(zhì)的溶出度，從而影響了SSd 的產(chǎn)量。因此，選擇60%、70%、80%作為響應(yīng)面分析中乙醇濃度的水平。

2.1.2 料液比對SSd 產(chǎn)量的影響 料液比對SSd 產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對SSd 產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on SSd production

由圖2 可見，SSd 產(chǎn)量隨著提取溶劑體積的增加而呈上升趨勢，當(dāng)料液比達(dá)到1∶20（g∶mL）時，SSd產(chǎn)量達(dá)到最大值；溶劑體積繼續(xù)增加時，SSd 產(chǎn)量則出現(xiàn)下降。其結(jié)果表明，料液比對SSd 產(chǎn)量有一定影響，溶劑體積越大，SSd 溶出效果越好。因此，選擇1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL）作為響應(yīng)面分析中料液比的水平。

2.1.3 超聲功率對SSd 產(chǎn)量的影響 超聲功率對SSd 產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖3。

圖3 超聲功率對SSd 產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on SSd production

由圖3 可見，超聲功率在100～300W 之間時，超聲功率越大，SSd 的產(chǎn)量越高；而超聲功率超過300W 時，SSd 產(chǎn)量無顯著差異。其結(jié)果表明，超聲功率較高（>300W）時，超聲功率對SSd 的產(chǎn)量無顯著影響。綜合提取效果與能量消耗等因素，選擇300W作為SSd 提取的超聲功率。

2.1.4 超聲時間對SSd 產(chǎn)量的影響 超聲時間對SSd 產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖4。

圖4 超聲時間對SSd 產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on SSd production

由圖4 可見，隨著超聲時間的增加，SSd 的產(chǎn)量呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。超聲提取過程初期，隨著超聲時間的增加，組織與細(xì)胞破碎程度加大，有利于SSd 的溶出，從而提高SSd 產(chǎn)量；當(dāng)超聲時間進(jìn)一步延長（>30min），其它成分的含量增加影響了SSd的溶出及穩(wěn)定性，使得SSd 產(chǎn)量下降。因此，選擇20、30、40min 作為響應(yīng)面分析中超聲時間的水平。

2.1.5 超聲溫度對SSd 產(chǎn)量的影響 超聲溫度對SSd 產(chǎn)量的影響見圖5。

圖5 超聲溫度對SSd 產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on SSd production

由圖5 可見，隨著超聲溫度的升高，SSd 產(chǎn)量呈上升趨勢，當(dāng)超聲溫度為50℃時，SSd 產(chǎn)量達(dá)到最大值；此后，隨著超聲溫度的進(jìn)一步升高，SSd 產(chǎn)量呈下降趨勢。提取溫度升高能夠促進(jìn)SSd 的分子擴(kuò)散，提高SSd 溶出速度與產(chǎn)量，但溫度過高會影響SSd在溶液中的穩(wěn)定性，降低SSd 產(chǎn)量。因此，選擇40、50、60℃作為響應(yīng)面分析中超聲溫度的水平。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面實驗結(jié)果 基于Box-Behnken 實驗設(shè)計進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計結(jié)果Tab.2 Results of response surface test

2.2.2 模型擬合與方差分析

利用Design-Expert 13.0 對響應(yīng)面實驗結(jié)果進(jìn)行分析，得到SSd 產(chǎn)量（Y）與實驗因素的二次多元回歸方程：Y=3.83-0.015A+0.225B-0.1625C+0.3375D+0.4900AB-0.0350AC+0.1150AD+0.0825BC+0.0725BD+0.0250CD-0.5482A2-0.5132B2-0.2969C2-0.3594D2。式中：Y為SSd 產(chǎn)量；A 為乙醇濃度；B 為料液比；C 為超聲時間；D 為超聲溫度。方差分析結(jié)果見表3。

表3 二次回歸模型的方差分析結(jié)果Tab.3 Variance analysis results of quadratic regression model

由表3 可見，模型F=11.50，P<0.0001，表明回歸模型極顯著；失擬項F=3.61，P=0.1139（P>0.05），影響不顯著。分析結(jié)果表明模型擬合程度良好，可用于SSd 產(chǎn)量的預(yù)測與分析。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析及提取工藝優(yōu)化結(jié)果響應(yīng)面分析中各因素間交互作用結(jié)果見圖6~8。

圖6 乙醇濃度與料液比、超聲時間、超聲溫度交互作用對SSd 產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of the interaction between material liquid ration, ultrasonic time, ultrasonic temperature and ethanol concentration on the yield of SSd

響應(yīng)面分析相互作用圖中，曲面的斜率與等高線的形狀是各因素間相互作用關(guān)系的直觀體現(xiàn)[7]。由圖6（a）可見，乙醇濃度（A）與料液比（B）交互作用曲面圖中，曲面陡峭，等高線圖呈橢圓形，表明在SSd 提取過程中乙醇濃度與料液比間相互作用顯著。由圖6（b）可見，乙醇濃度（A）與超聲時間（C）交互作用曲面圖中，曲面平緩，等高線近橢圓形，表明在SSd 提取過程中乙醇濃度與超聲時間相互作用不顯著。此外，由圖6（c）、圖7 及圖8 可見，乙醇濃度（A）與超聲溫度（D）、料液比（B）與超聲時間（C）、料液比（B）與超聲溫度（D）以及超聲時間（C）與超聲溫度（D）的交互作用曲面圖中曲面斜率均較低，曲面平緩，等高線均近圓形，表明在SSd 的提取過程中，乙醇濃度與超聲溫度、料液比與超聲時間、料液比與超聲溫度、超聲時間與超聲溫度的交互作用不顯著。

圖7 料液比與超聲時間、超聲溫度交互作用對SSd 產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of the interaction between ultrasonic time, ultrasonic temperature and material liquid ratio on the yield of SSd

圖8 超聲時間與超聲溫度交互作用對SSd 產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of the interaction between ultrasonic temperature and ultrasonic temperature on the yield of SSd

利用Design-Expert 13 對CHS3 中SSd 的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)條件為：乙醇濃度為71.998%；料液比為1∶22.289（g∶mL）；超聲時間為28.359min；超聲溫度為55.80℃。此條件下模型預(yù)測SSd 產(chǎn)量為3.962μg·g-1。

2.2.4 優(yōu)化條件的驗證實驗 為方便實際操作，將分析所得最優(yōu)提取條件調(diào)整為：乙醇濃度為72%；料液比為1∶22（g∶mL）；超聲時間為28min；超聲溫度為56℃；超聲功率300W。在此條件下，取CHS3 發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行5 次平行實驗進(jìn)行驗證。結(jié)果顯示，5 次驗證實驗中，SSd 的產(chǎn)量分別為3.934、3.886、3.929、3.974、3.916μg·g-1，SSd 平均產(chǎn)量為3.928μg·g-1，RSD 值為0.81%，與預(yù)測值接近。實驗結(jié)果表明，模型預(yù)測性良好，所得工藝條件可靠。

3 結(jié)論

本研究通過單因素分析結(jié)合Box-Behnken 實驗設(shè)計，對從真菌CHS3 發(fā)酵產(chǎn)物中提取柴胡皂苷d的工藝方案進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，CHS3 發(fā)酵產(chǎn)物中提取SSd 的最優(yōu)工藝為：72%的乙醇超聲提取，料液比為1∶22（g∶mL），超聲功率為300W，超聲時間為28min，超聲溫度為56℃；該工藝條件下SSd 平均產(chǎn)量為3.928μg·g-1。本研究結(jié)果為利用發(fā)酵工程生產(chǎn)SSd 提供理論與實驗參考。