姚海燕，楊潔，楊新光，2

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東廣州 510260；2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東廣州 510120）

自身免疫性腦炎（autoimmune encephalitis，AE）是一種嚴(yán)重且經(jīng)常致命的疾病，與針對可影響神經(jīng)元功能的抗原的神經(jīng)元特異性自身抗體有關(guān)?？股窠?jīng)元抗體包括針對神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞表面或突觸抗原的抗體，以及針對細(xì)胞內(nèi)抗原的抗體。抗細(xì)胞表面抗原的抗體通常是致病性IgG，如抗N?甲基?D?天冬氨酸受體（N?methyl?D?aspartic acid receptor，NMDAR）抗體、抗富亮氨酸膠質(zhì)瘤失活蛋白1（leucine rich glioma inactivated 1，LGI1）抗體、抗接觸蛋白關(guān)聯(lián)蛋白樣蛋白2（contactin?associated protein?like 2，CASPR2）抗體、抗γ 氨基丁酸受體（γ?aminobutyric acid，GABA）抗體、抗α?氨基?3?羥基?5?甲基?4?異唑丙酸受體（α?amino?3?hydroxy?5?methyl?4?isoxazolepropionic acid receptor，AMPAR）抗體，致病機(jī)制包括受體激動(dòng)劑或拮抗劑作用、補(bǔ)體級聯(lián)的激活、抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性以及抗原內(nèi)化，從而改變細(xì)胞表面的抗原密度［1?2］。

AE通常有副腫瘤性的起源，由質(zhì)膜中表達(dá)的腫瘤神經(jīng)蛋白啟動(dòng)腫瘤靶向免疫反應(yīng)，這些抗原呈遞給適應(yīng)性免疫系統(tǒng)并激活免疫細(xì)胞［1?2］?？笰MPAR腦炎是幾種新近描述的自身免疫性疾病之一，以突觸表面蛋白為靶點(diǎn)，引起精神和神經(jīng)癥狀，目前抗AMPAR 腦炎已報(bào)道超過35 例［3?11］。在近一半的抗AMPAR 腦炎患者中發(fā)現(xiàn)了腫瘤，提示腫瘤是抗AMPAR腦炎的主要病因之一［11］。

雖然一些抗AMPAR 腦炎患者合并腫瘤的病理表現(xiàn)為小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）［9］，但SCLC 與抗AMPAR 腦炎之間的病理學(xué)聯(lián)系尚不清楚。本研究收集2 例伴抗AMPAR 腦炎和80 例不伴抗AMPAR 腦炎的SCLC 患者，免疫組化檢測肺部腫瘤組織AMPAR的表達(dá)并描述其表達(dá)特征。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

2013 年6 月至2019 年11 月，連續(xù)從942 例疑似AE患者中收集腦脊液和（或）血清樣本，所有樣本均檢測AE?IgG，包括抗NMDAR、AMPAR1、AMPAR2、CASPR2、LGI1、GABA 抗體。這些樣本來自不同的醫(yī)院，但均在廣州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)科學(xué)研究所進(jìn)行自身抗體篩查。本研究經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2019?hs?11，2020?hs?54），所有患者均知情同意。

1.2 AE抗體檢測和AMAPR?IgG鑒定

參照文獻(xiàn)［12］使用商業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)的大鼠海馬和小腦組織切片，采用間接免疫熒光法檢測腦脊液和（或）血清AE 抗體。將未稀釋的腦脊液或1∶10稀釋的血清與商業(yè)化切片在室溫下孵育3 h，洗滌后與帶有熒光標(biāo)記的山羊抗人IgG 血清室溫下孵育2 h，洗滌后在顯微鏡下觀察熒光模式和熒光強(qiáng)度。使用基于細(xì)胞法（cell?based assay，CBA）試劑盒（德國Euroimmun）檢測AE 抗體陽性的樣本AMPAR1 和AMPAR2抗體表達(dá)。

1.3 腫瘤組織的抗神經(jīng)元抗體免疫組化檢測

收集來自廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院的兩名抗AMPAR 抗體陽性并且合并SCLC 患者的肺部腫瘤組織切片和80 份商業(yè)的無AE 表現(xiàn)的人SCLC 組織芯片（西安Ailina Biotech）。參照文獻(xiàn)［13］，采用親和素?生物素化酶復(fù)合物免疫染色方法進(jìn)行免疫組化檢測。將組織芯片及切片在二甲苯中浸泡3次，每次浸泡5 min，然后在100%乙醇、95%乙醇和90%乙醇中分別浸泡5 min。蒸餾水沖洗，然后PBS洗3 次。室溫下用10%山羊血清孵育芯片及切片30 min 阻斷非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合，然后4 ℃下切片分別與CRMP5、NMDAR、AMPAR1、2 等一抗（1∶300稀釋，北京Bioss）以及患者腦脊液（1∶1）孵育過夜。用PBS 洗滌芯片及切片，用含30%甲醇和30%過氧化氫的PBS孵育20 min，PBS洗3次。組織芯片及切片與二抗室溫下孵育2 h，鹽酸二氨基聯(lián)苯胺（棕色）染色，最后用蘇木精反染（藍(lán)色），顯微鏡下觀察，細(xì)胞染色呈棕色為抗體陽性表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 AMPAR?IgG檢測

4 例（0.4%，4/942）患者的腦脊液和血清抗AMPAR 抗體陽性，其中3 例患者經(jīng)病理證實(shí)為SCLC，2例患者肺部腫瘤組織可用于免疫組化檢測。所有3 例患者的臨床資料見表1。3 例患者皆為男性，都出現(xiàn)記憶迅速下降和精神行為異常，磁共振成像（MRI）均顯示非特異性腦損傷。

表1 抗AMPAR2抗體陽性患者3例臨床資料

2.2 抗神經(jīng)元抗體免疫組化檢測

2 例AMPAR?IgG 陽性患者腫瘤組織免疫組化檢測顯示AMPAR1、AMPAR2、CRMP5 均為強(qiáng)陽性，但NMDAR 為陰性。1 例AMPAR2 抗體陽性患者肺部腫瘤組織AMPAR2 高表達(dá)，并與患者的腦脊液抗體發(fā)生反應(yīng)。見圖1，圖2。80例無AE的SCLC患者肺部腫瘤組織AMPAR2均為陽性。

圖2 小細(xì)胞肺癌患者肺部腫瘤組織中的免疫組化檢測

3 討論

抗AMPAR 腦炎既往少見報(bào)道，H?ftberge等［9］在10 573 例疑似AE 或副腫瘤神經(jīng)綜合征的患者中檢測出22 例攜帶AMPAR 抗體（0.2%，22/10 573）。本研究僅0.4%的患者（4/942）AMPAR?IgG 陽性，顯示抗AMPAR腦炎在中國患者中也很罕見。

SCLC一直被認(rèn)為是不同類型AE的重要病因之一。H?ftberge 等［9］報(bào)道，SCLC 患者抗GABA 腦炎發(fā)生率較高（50%～60%），但僅在22 例抗AMPAR 腦炎患者中發(fā)現(xiàn)4 例SCLC（18%），顯示SCLC 在抗AMPAR 腦炎中的比例要低于抗GABA 腦炎。但本研究在4例抗AMPAR腦炎患者中發(fā)現(xiàn)了3例（75%）SCLC，高發(fā)生率可能與樣本量較小有關(guān)，因此需要進(jìn)一步增加樣本量進(jìn)行檢測。

副腫瘤性AE 的發(fā)生機(jī)制尚不清楚。一般來說，腫瘤靶向免疫反應(yīng)是由腫瘤神經(jīng)蛋白啟動(dòng)的，這些蛋白呈現(xiàn)給適應(yīng)性免疫系統(tǒng)并激活免疫細(xì)胞［1］。這些抗原也在神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)，因此受到多種途徑的攻擊，包括受體激動(dòng)劑或拮抗劑作用、補(bǔ)體級聯(lián)的激活、抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和抗原內(nèi)化［1］。

AMPAR 是一類離子型谷氨酸受體，在哺乳動(dòng)物中高度保守，并介導(dǎo)了大腦中的大部分快速興奮性神經(jīng)傳遞。針對AMPAR 胞外結(jié)構(gòu)域的抗體已在一組AE 腫瘤患者中被報(bào)道，包括胸腺瘤、乳腺癌、小細(xì)胞肺癌或非小細(xì)胞肺癌［3］。Bataller 等［4］發(fā)現(xiàn)，乳腺導(dǎo)管浸潤性腺癌強(qiáng)表達(dá)AMPAR，并與AE 患者的IgG 發(fā)生反應(yīng)，從而表明AMPAR?IgG 具有特異性的體液免疫作用。雖然在抗AMPAR 腦炎患者中可以發(fā)現(xiàn)SCLC，但目前還沒有病理證據(jù)表明神經(jīng)AMPAR 抗原也在癌細(xì)胞中表達(dá)，因此我們收集了2例合并抗AMPAR 腦炎的SCLC 患者的肺部腫瘤組織，檢測顯示2 例患者肺部腫瘤組織不僅表達(dá)AMPAR 抗原，并且可與患者腦脊液IgG 發(fā)生反應(yīng)。此外，本研究顯示80 例（100%）無AE 的SCLC 患者的腫瘤組織中均有AMPAR 抗原的強(qiáng)表達(dá)。目前認(rèn)為腫瘤表達(dá)的AMPAR 可能有助于AMPAR 抗體的產(chǎn)生，從而激活腦炎患者的體液免疫和細(xì)胞免疫，這與之前其他腫瘤類型的研究結(jié)果一致［4］。雖然目前普遍認(rèn)為SCLC 的存在是AE 的誘發(fā)因素，但抗AMPAR 腦炎或其他類型的AE 只能在少數(shù)SCLC 患者中發(fā)現(xiàn)［14］。這與我們目前的研究一樣，大部分表達(dá)神經(jīng)元抗原的SCLC 并沒有誘導(dǎo)抗AMPAR 腦炎或其他類型的AE。因此，AE患者中，腫瘤組織蛋白激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的主要機(jī)制尚不清楚，還必須需要進(jìn)一步的研究。

總之，本研究顯示SCLC 本身可以表達(dá)AMPAR抗原，但其表達(dá)的意義尚不清楚，抗AMPAR 抗體在SCLC患者中的致病機(jī)制仍不完全了解，還需要進(jìn)一步進(jìn)行研究。