王英哲,徐 博,張 玲,牟書靚,徐安凱*

(1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,吉林 長春 130033; 2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與草學(xué)學(xué)院,吉林 長春 130118)

羊草(Leymuschinensis)又稱堿草,隸屬禾本科賴草屬,主要分布于我國東北平原、華北平原以及黃土高原等地[1],是一種優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的禾本科牧草和生態(tài)草,具有抗寒、抗旱、耐鹽堿、耐踐踏等優(yōu)點(diǎn)[2-4],也是我國唯一出口創(chuàng)匯的禾本科牧草。羊草對(duì)我國生態(tài)環(huán)境保護(hù)、發(fā)展人工草地建設(shè)、修復(fù)退化草地改良、發(fā)展草原畜牧業(yè)等方面具有重要作用[5-6]。由于我國羊草草原管理的缺失及羊草自身的“三低”問題,嚴(yán)重制約了羊草資源開發(fā)與利用。因此,通過生物技術(shù)手段培育羊草優(yōu)良品種,強(qiáng)化人工栽培馴化將成為加快羊草育種進(jìn)程的有效途徑之一[7]。

從20世紀(jì)80年代開始,羊草組織培養(yǎng)的研究取得很多發(fā)展,已建立起以種子、幼穗等作為外植體的植株再生體系[8-11]。幼穗作為外植體雖然可獲得較高的愈傷誘導(dǎo)率,但成本高、耗時(shí)久且受季節(jié)限制等缺點(diǎn);而種子容易儲(chǔ)存,取材方便,周年可用,卻存在外植體消毒困難、胚性愈傷組織少以及植株再生頻率不穩(wěn)定等問題。因此,優(yōu)化羊草種子愈傷組織誘導(dǎo)再生體系,提高胚性愈傷組織誘導(dǎo)分化頻率,對(duì)奠定羊草的遺傳轉(zhuǎn)化及生物技術(shù)育種的研究基礎(chǔ)具有重大意義。

本研究以羊草種子為外植體,對(duì)外植體處理、組培污染率控制、改善愈傷組織生長狀態(tài),提高其分化能力等方面進(jìn)行研究,尋找適合以成熟種子為外植體的誘導(dǎo)培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基,打破幼穗和幼胚的季節(jié)性限制,隨時(shí)獲得具有高頻再生能力的愈傷組織,同時(shí)利用分子標(biāo)記技術(shù),在DNA水平上對(duì)再生植株進(jìn)行遺傳變異分析,為羊草分子育種與遺傳改良提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)材料為‘吉農(nóng)1號(hào)’羊草,‘吉生1號(hào)’羊草和白城野生羊草,種子由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所保存。

1.2 方法

1.2.1外植體的前處理 取成熟、完整、飽滿的羊草種子(‘吉農(nóng)1號(hào)’羊草,‘吉生1號(hào)’羊草和‘白城野生’羊草),進(jìn)行人工去稃處理(未處理的種子作對(duì)照CK),放在75%酒精浸泡5 min,0.1%升汞溶液震蕩10 min,分別接種于MS培養(yǎng)基中。每個(gè)處理設(shè)6個(gè)培養(yǎng)皿,每皿25粒種子,3個(gè)重復(fù),7 d后統(tǒng)計(jì)兩組處理方式外植體的污染率。

選擇外植體污染率低的處理方式對(duì)供試材料種子進(jìn)行處理,用100 mg·L-1赤霉素(GA3)浸泡24 h(未使用GA3浸泡作對(duì)照CK)。放在75%酒精浸泡5 min,0.1%升汞溶液震蕩10 min,分別接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+2.0 mg·L-12,4-D)中。每個(gè)處理設(shè)6個(gè)培養(yǎng)皿,每皿25粒種子,3個(gè)重復(fù),40 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織出愈率。

1.2.2愈傷組織誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng) 將處理后的外植體接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,培養(yǎng)基配方:MS+2,4-D(1.0 mg·L-1);MS+2,4-D(1.0 mg·L-1)+KT(0.5 mg·L-1);MS+2,4-D(1.0 mg·L-1)+KT(1.0 mg·L-1);MS+2,4-D(2.0 mg·L-1);MS+2,4-D(2.0 mg·L-1)+KT(0.5 mg·L-1);MS+2,4-D(2.0 mg·L-1)+KT(1.0 mg·L-1);MS+2,4-D(3.0 mg·L-1);MS+2,4-D(3.0 mg·L-1)+KT(0.5 mg·L-1);MS+2,4-D(3.0 mg·L-1)+KT(1.0 mg·L-1);MS+2,4-D(5.0 mg·L-1),以上培養(yǎng)基均添加3%蔗糖和0.7%瓊脂,pH=5.8,每份培養(yǎng)基接種外植體25粒,每份培養(yǎng)基設(shè)置3個(gè)重復(fù),置于(25±1)℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行暗培養(yǎng),期間換1～2次培養(yǎng)基。40 d后統(tǒng)計(jì)外植體的出愈率。

在出愈率最高的激素配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)40 d的愈傷組織轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基上,每份培養(yǎng)基放置10塊愈傷組織,每份培養(yǎng)基設(shè)置3個(gè)重復(fù),置于(25±1)℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行暗培養(yǎng),每15天繼代1次,觀察愈傷組織狀態(tài)。

1.2.3愈傷組織的分化及植株再生 將繼代生長狀態(tài)良好的愈傷組織,轉(zhuǎn)置到分化培養(yǎng)基上,培養(yǎng)基配方:MS+6-BA(0.1 mg·L-1);MS+6-BA(0.5 mg·L-1)+NAA(0.5 mg·L-1);MS+6-BA(0.5 mg·L-1)+NAA(1.0 mg·L-1);MS+6-BA(1.0 mg·L-1);MS+6-BA(1.0 mg·L-1)+NAA(0.5 mg·L-1);MS+6-BA(1.0 mg·L-1)+NAA(1.0 mg·L-1);MS+6-BA(2.0 mg·L-1);MS+NAA(1.0 mg·L-1),以上培養(yǎng)基均添加3%蔗糖和0.7%瓊脂,pH=5.8,每份培養(yǎng)基接種愈傷塊14粒,每份培養(yǎng)基設(shè)置5個(gè)重復(fù),(25±1)℃光照培養(yǎng) 16 h,(20±1)℃暗培養(yǎng) 8 h,光照強(qiáng)度2 000 lx,30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的分化率。

1.2.4生根與再生植株的移栽 將分化培養(yǎng)中培養(yǎng)30 d后再生芽轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中,生根培養(yǎng)基為1/2MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂,培養(yǎng)2～3周,待幼苗生長至 15 cm時(shí),打開瓶蓋,室內(nèi)煉苗 3～5 d,洗凈根部的培養(yǎng)基移栽至花缽中(營養(yǎng)土∶蛭石=1∶1)。15～20 d后統(tǒng)計(jì)植株的成活率。

1.2.5基因組DNA的提取及ISSR檢測 以培養(yǎng)的羊草無菌苗為材料,選用17條ISSR引物(上海生工合成)進(jìn)行PCR梯度擴(kuò)增。選取9株羊草再生植株(3份不同基因型供試材料中每個(gè)基因型隨機(jī)選3株),1株栽培羊草植株作對(duì)照,利用Omega試劑盒提取葉片DNA,共設(shè)置3次重復(fù)。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性1 min,94℃變性1 min,36℃退火1 min,72℃延伸2 min,35個(gè)循環(huán),72℃延伸10 min,4℃下保存。取5 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,在2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。ISSR反應(yīng)采用10 μL體系:10×Buffer 1 μL,dNTP 0.2 μL,Primer 4 μL,Taq polymerase 0.2 μL,ddH2O 3 μL,模板DNA 1 μL。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

外植體污染率=外植體受污染數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%;

愈傷組織誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出的愈傷組織數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%;

愈傷組織分化率=有不定芽的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織數(shù)×100%;

成活率=存活的幼苗數(shù)/移栽的幼苗數(shù)×100%。

對(duì)各數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行處理和制作圖表,SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和顯著性測驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子去稃處理對(duì)外植體污染的影響

羊草種子外稃內(nèi)的污染物寄存大量細(xì)菌和真菌,難以徹底殺滅,成為組培過程中難于控制的問題[12],嚴(yán)重影響后續(xù)試驗(yàn)的正常進(jìn)行。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,無論是栽培品吉農(nóng)、吉生系列,還是白城野生材料的種子,直接用未處理的完整種子作為外植體在愈傷組織誘導(dǎo)過程中的污染率在57.56%～65.33%之間,平均污染率為60.89%;而人工去稃后的種子,采用相同的消毒處理方法,污染率均在5%以下;同一品種的種子,兩組處理方式之間差異極顯著(P<0.01)。由此可見去稃的羊草種子能明顯降低組培過程中外植體的污染,從而提高羊草離體的再生頻率(表1)。

表1 種子不同處理對(duì)外植體污染的影響Table 1 The effect of different seed treatments on the contamination on external plant

2.2 影響羊草愈傷組織誘導(dǎo)的因素

2.2.1GA3處理對(duì)羊草種子愈傷組織的影響 將人工去稃的羊草種子用100 mg·L-1赤霉素(GA3)浸泡24 h后,接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,觀察發(fā)現(xiàn)15 d后種子露出白芽,30 d后出現(xiàn)白色或淡黃色顆粒狀愈傷組織,40 d后愈傷組織直徑達(dá)到5 mm左右。本文統(tǒng)計(jì)參試品種(‘吉農(nóng)1號(hào)’羊草,‘吉生1號(hào)’羊草和‘白城野生’羊草)總體的出愈情況,從表2中可以看出,經(jīng)過100 mg·L-1赤霉素(GA3)浸泡24 h后種子的愈傷組織的誘導(dǎo)數(shù)量顯著高于對(duì)照CK(P<0.05),說明適當(dāng)?shù)募に靥幚韺?duì)羊草種子的發(fā)芽以及愈傷組織誘導(dǎo)至關(guān)重要。為提高羊草的愈傷誘導(dǎo)效率,本研究后續(xù)試驗(yàn)采用100 mg·L-1赤霉素(GA3)浸泡24 h的去稃羊草種子作為外植體。

表2 GA3處理對(duì)羊草種子形成愈傷組織的影響Table 2 Effect of GA3 treatment on callus formation of L. Chinensis seeds

2.2.2不同基因型對(duì)羊草種子愈傷組織的影響 供試材料(‘吉農(nóng)1號(hào)’羊草,‘吉生1號(hào)’羊草和‘白城野生’羊草),不同基因型種子萌動(dòng)時(shí)間相差5～9 d(表3)。愈傷組織生長30 d后觀察其生長狀態(tài),發(fā)現(xiàn)不同基因型羊草種子的愈傷組織狀態(tài)相似,但愈傷組織出愈率不同。‘吉農(nóng)1號(hào)’基因型羊草種子出愈率最高48.44%,其次‘吉生1號(hào)’出愈率為43.78%,兩者之間差異不顯著。與野生材料相比,栽培品系羊草種子的出愈率顯著高于野生材料(P<0.05)。羊草栽培種的出愈率顯著高于野生材料(P<0.05),說明羊草種子的出愈率與其基因型關(guān)系密切。

表3 不同基因型羊草種子形成愈傷組織的情況Table 3 Callus formation of different genotypes of L. chinensis seeds

2.2.3不同濃度激素配比對(duì)羊草愈傷組織誘導(dǎo)的影響 研究發(fā)現(xiàn),供試材料(‘吉農(nóng)1號(hào)’羊草,‘吉生1號(hào)’羊草和‘白城野生’羊草),在2,4-D和KT不同濃度配比的培養(yǎng)基中均能誘導(dǎo)出愈傷組織,但愈傷組織生長的狀態(tài)和誘導(dǎo)頻率存在顯著差異。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖1所示,在不同2,4-D濃度下,誘導(dǎo)率隨其濃度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)。誘導(dǎo)率在2,4-D濃度為2.0 mg·L-1時(shí)最高(平均為68.26%),其次是在2,4-D濃度為3.0 mg·L-1時(shí)誘導(dǎo)率為38.33%;2,4-D濃度5.0 mg·L-1時(shí)最低(平均為16.33%)。在2,4-D和KT濃度不同組合的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基含有2.0 mg·L-12,4-D和0.5 mg·L-1KT產(chǎn)生愈傷組織的頻率最高(平均為83.11%),其次是培養(yǎng)基2.0 mg·L-12,4-D +1.0 mg·L-1KT的誘導(dǎo)率(平均為65.02%)。從圖1中可以看出,‘吉農(nóng)1號(hào)’和‘吉生1號(hào)’羊草栽培品種與‘白城野生’材料在同一配方誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)率差異不顯著。從試驗(yàn)結(jié)果來看,影響羊草愈傷組織誘導(dǎo)率的不是基因型而是生長調(diào)節(jié)激素的濃度。

圖1 不同2,4-D和KT濃度配比對(duì)羊草愈傷組織誘導(dǎo)率的影響Fig.1 Effects of different 2,4-D and KT concentrations on callus induction rate of Leymus chinensis

2.2.42,4-D濃度對(duì)羊草愈傷組織繼代誘導(dǎo)的影響 在試驗(yàn)中,供試材料(‘吉農(nóng)1號(hào)’羊草,‘吉生1號(hào)’羊草和‘白城野生’羊草)三種基因型的羊草種子作為外植體,其愈傷組織在含有2,4-D(1.0,2.0,3.0,5.0 mg·L-1)的繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d后愈傷組織體積加倍增大。就愈傷組織的生長狀態(tài)而言,三種不同基因型的羊草愈傷組織在相同配方的繼代培養(yǎng)基上生長速度和生長狀態(tài)相似,表明羊草愈傷組織繼代培養(yǎng)的生長狀態(tài)與基因型無關(guān),而受激素2,4-D濃度影響:2,4-D濃度為1.0 mg·L-1繼代培養(yǎng)的愈傷組織質(zhì)地柔軟且粘稠,水漬狀況減輕,無顆粒狀組織誘導(dǎo)(圖2A);2,4-D濃度為2.0 mg·L-1繼代培養(yǎng)的愈傷組織呈乳白色,結(jié)構(gòu)變得緊密,顆粒狀組織明顯(圖2B);2,4-D濃度為3.0 mg·L-1繼代培養(yǎng)的愈傷組織顏色略深,結(jié)構(gòu)變得緊密,顆粒狀組織明顯,后期一部分出現(xiàn)褐化現(xiàn)象(圖2C);2,4-D濃度為5.0 mg·L-1繼代培養(yǎng)的愈傷組織全部褐化(圖2D)。

圖2 不同2,4-D濃度下繼代培養(yǎng)基的愈傷組織生長狀態(tài)Fig.2 Callus growth status of subculture media with different concentrations of 2,4-D注:A,水漬狀;B,緊密狀;C,部分褐化;D,全部褐化Note:A,Watery B,Compact C,Partial browning D,Total browning

2.3 影響羊草愈傷組織再分化的因素

2.3.1羊草愈傷組織狀態(tài)對(duì)再分化的影響 為進(jìn)一步確認(rèn)愈傷組織的生長狀態(tài)與其分化是否有關(guān),本研究分別取緊密型愈傷組織、易碎型愈傷組織和軟粘型愈傷組織放置于分化培養(yǎng)基上(0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA)培養(yǎng)30 d。從圖3中可以看出,緊密型愈傷組織分化率最高(53.26%);其次是易碎型(45.12%);軟黏型的愈傷組織最低(5.97%)。研究結(jié)果表明柔軟透明的愈傷組織不具有胚性,而緊密型具有顆粒狀的愈傷組織具有胚性,因此,選擇緊密型且具有顆粒狀的愈傷組織進(jìn)行分化調(diào)控試驗(yàn)。

圖3 愈傷組織狀態(tài)對(duì)分化率的影響Fig.3 Effect of callus state on differentiation rate

2.3.2不同濃度激素配比對(duì)羊草愈傷組織分化的影響 愈傷組織于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)40 d后接種于分化培養(yǎng)基上,光照條件下培養(yǎng)5 d后出現(xiàn)綠色芽點(diǎn),20 d后萌發(fā)出再生芽。試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn),參試材料的三種基因型羊草,在相同濃度激素條件下,愈傷組織形成的分化愈傷數(shù)量相近,且形成的再生芽數(shù)量也相近,說明愈傷組織的分化率與材料基因型關(guān)聯(lián)不大,分化率的大小更取決于培養(yǎng)基中激素濃度的配比。因此,對(duì)三種基因型羊草愈傷組織的平均值進(jìn)行比較(表4)。

表4 愈傷組織在不同激素濃度下的分化情況Table 4 Callus Differentiation in different concentrations of hormones

在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d出現(xiàn)綠色芽點(diǎn),形成胚性愈傷組織為愈傷組織分化初期。此時(shí),在分化培養(yǎng)基中加入1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA愈傷組織的分化率最高,其分化率為84.29%。且兩種激素結(jié)合使用要比任何一種激素單獨(dú)使用的效果好。分化率另一評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)為產(chǎn)生再生苗的愈傷組織數(shù)量,胚性愈傷組織經(jīng)過分化培養(yǎng)基培養(yǎng)20 d后形成再生芽,分化培養(yǎng)基中加入1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA產(chǎn)生胚性愈傷組織數(shù)量最多,從而形成的再生芽最多47個(gè),成苗率達(dá)52.86%(表4)。

2.4 生根和移栽

羊草愈傷組織分化培養(yǎng)20～30 d愈傷組織上的綠點(diǎn)逐漸形成不定芽。15～20 d待分化出的芽長到3～5 cm時(shí)轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上,所得的植株都能正常生長。培養(yǎng)1周后開始生根,10 d后每株可長出8～10條根,根長達(dá)4～5 cm(圖4E)。再培養(yǎng)1周,植株健壯,葉色濃綠,20℃左右室溫條件下練苗3～5 d,洗去根部培養(yǎng)基,移栽到盆中放入溫室培養(yǎng),再生苗成活率達(dá)到100%(圖4H)。

圖4 羊草種子的誘導(dǎo)、分化和再生苗Fig.4 Induction,differentiation and regeneration of the seedlings from seeds of Leymus chinensis注:A,種子誘導(dǎo)30 d;B,愈傷組織誘導(dǎo)40 d;C,愈傷組織的繼代;D,愈傷組織的分化;E,分化出的幼苗及根;F,再生植株;G,移栽成活植株;H移栽成活植株Note:Panel A,seed-induced for 30 d;Panel B,callus induction for 40 days;Panel C,Callus succession;Panel D,callus differentiation;Panel E,differentiated seedlings and roots;Panel F,Regenerate plants;Panel G,transplanted into live plants;Panel H,live plants from transplantation

2.5 利用ISSR對(duì)羊草再生植株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性分析

選用17條引物對(duì)羊草的組培再生苗進(jìn)行PCR擴(kuò)增,確定每條引物最適宜的退火溫度。結(jié)果表明,大部分引物均能擴(kuò)增出不連續(xù)帶譜,其中有3個(gè)引物反應(yīng)產(chǎn)物重復(fù)性高、擴(kuò)增穩(wěn)定且條帶清晰(表6),最終篩選出807,811,827共3條擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性好、多態(tài)性較高的引物用于羊草的ISSR-PCR擴(kuò)增。

表6 ISSR引物對(duì)羊草再生植株的擴(kuò)增情況Table 6 ISSRanalysisofLeymuschinensiswith3 primers

隨機(jī)取9株羊草組培再生苗(1株栽培苗作對(duì)照),以其中引物811用于羊草的ISSR-PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上電泳如圖6。研究結(jié)果表明,引物811對(duì)對(duì)照和組培再生苗擴(kuò)增圖譜一致,沒有檢測出多態(tài)性片段,表明未在再生植株基因組中檢測出遺傳變異,說明該組培再生體系誘導(dǎo)羊草再生植株能夠保持遺傳上的穩(wěn)定性。

圖6 引物S811的ISSR擴(kuò)增圖譜Fig.6 ISSR amplification map of primer S811注:M,分子量標(biāo)記;CK,對(duì)照植株;1～9,再生植株Note:M,DNA marker;CK,Wild plant;1～9,Regeneration plants

3 討論

20世紀(jì)70年代開始,隨著基因工程技術(shù)的興起與發(fā)展,通過基因轉(zhuǎn)移進(jìn)行植物遺傳改良的研究工作廣泛開展,高效的離體再生體系是其中一個(gè)重要的環(huán)節(jié)。對(duì)于羊草這類禾本科單子葉植物而言,選用穩(wěn)定的愈傷組織再生系統(tǒng)才能為遺傳轉(zhuǎn)化提供再生頻率高和再生能力穩(wěn)定的受體材料[13-14]。

3.1 種子處理對(duì)羊草組織培養(yǎng)的影響

禾本科牧草愈傷組織的誘導(dǎo)中,種子、幼胚、幼穗、根莖都可以用作外植體[15],劉江淑等[8]從幼穗、幼胚和成熟種子誘導(dǎo)的愈傷組織上都得到了再生植株,幼穗和幼胚的誘導(dǎo)率高于90%,而成熟的種子的誘導(dǎo)頻率不足20%。魏淇等[16]研究表明羊草種子愈傷組織的誘導(dǎo)率僅12%。曲同寶等[17]將人工去稃的羊草種子在100 mg·L-1GA3浸泡24 h后發(fā)芽率從0提高到12%,放置誘導(dǎo)培養(yǎng)上培養(yǎng)15 d后,種子最高出愈率達(dá)到25.33%。鄒吉祥等[18]研究發(fā)現(xiàn)GA3的濃度和浸泡時(shí)間對(duì)羊草種子發(fā)芽率影響較大,200 mg·L-1GA3浸泡48 h對(duì)打破羊草種子休眠的效果最佳,羊草種子的發(fā)芽率和出愈率分別為7%和16.5%。由此可見,羊草種子雖取材方便且不受季節(jié)影響,但作為外植體,種子發(fā)芽率低、出愈率低是影響組培效率的首要問題,也是學(xué)者們急切解決的難題。禾本科牧草種子的穎殼潛伏的微生物和細(xì)菌增加了種子滅菌的難度[19],發(fā)現(xiàn)種子去穎后污染率顯著降低[20-22]。本研究在建立羊草組織培養(yǎng)體系初期,也發(fā)現(xiàn)去稃處理能得到較好的試驗(yàn)結(jié)果,組培污染率從從60.89%控制到5%以下;同時(shí)去稃后的種子經(jīng)GA3浸泡處理,種子出愈率從17.93%增加到36.44%,在一定程度上解決了種子作為外植體誘導(dǎo)率低的難題。由此可見,去稃處理對(duì)一種自為外植體的禾本科牧草愈傷組織培養(yǎng)具有顯著的促進(jìn)作用。

3.2 不同激素配比對(duì)羊草愈傷組織誘導(dǎo)的影響

能否實(shí)現(xiàn)羊草愈傷誘導(dǎo)階段的高頻誘導(dǎo)效率,2,4-D的存在及適宜濃度起著至關(guān)重要的作用[23]。肖燕等[24-25]研究發(fā)現(xiàn)在愈傷組織誘導(dǎo)和繼代過程中添加2.0 mg·L-12,4-D有利于羊草胚性愈傷組織再生。邸桂俐等[9]在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加5.0 mg·L-12,4-D,羊草幼穗出愈率最高達(dá)87.5%。本研究共設(shè)置了1.0～5.0 mg·L-1共4個(gè)水平的2,4-D濃度,結(jié)果表明,低質(zhì)量濃度2,4-D雖能維持愈傷組織的生長但不利于愈傷組織的分化,高質(zhì)量濃度2,4-D不利于愈傷組織胚性的保持,本研究適宜的2,4-D濃度為2.0 mg·L-1;同時(shí),在培養(yǎng)基中添加微量KT(0.5 mg·L-1)可以明顯促進(jìn)愈傷組織的胚性發(fā)育,愈傷組織誘導(dǎo)率平均提高到83.11%。此外,本文對(duì)三個(gè)不同基因型羊草愈傷組織誘導(dǎo)進(jìn)行比對(duì),結(jié)果表明愈傷組織的生長狀態(tài)及誘導(dǎo)率受基因型的差異影響不大,而是與培養(yǎng)基中激素濃度配比影響密切。在繼代培養(yǎng)基中添加2.0 mg·L-12,4-D能夠保持愈傷組織的緊密、穩(wěn)定結(jié)構(gòu),提高愈傷組織的胚性或促進(jìn)其向胚性狀態(tài)發(fā)展[26],而質(zhì)量濃度過低愈傷組織呈水漬狀;過高使愈傷組織容易產(chǎn)生褐變,都不利于其胚性調(diào)整。

3.3 不同激素配比對(duì)羊草胚性愈傷組織分化和生根的影響

分化培養(yǎng)中激素的組合與濃度的配比是影響愈傷組織分化率的關(guān)鍵因素[27,28]。研究發(fā)現(xiàn),不同禾本科牧草的外植體分化有其最適宜的激素[29],在分化培養(yǎng)基中2,4-D的濃度很低,甚至不添加2,4-D才能保證植株再生。大多數(shù)試驗(yàn)表明,6-BA的效果最好,其次是KT。本研究共設(shè)計(jì)了8種激素濃度梯度的分化培養(yǎng)基,結(jié)果表明,外源激素6-BA對(duì)愈傷組織分化的影響十分顯著,低濃度6-BA(0.1 mg·L-1)未誘發(fā)任何可見形態(tài)變化發(fā)生,高濃度6-BA(2.0 mg·L-1)誘導(dǎo)愈傷褐變。既不會(huì)誘導(dǎo)褐變同時(shí)防止愈傷組織過度繁殖還能讓愈傷組織再生的最佳濃度6-BA為1.0 mg·L-1。為提高愈傷組織的再生芽率,產(chǎn)生良好的分化效果,在不添加2,4-D的培養(yǎng)基中同時(shí)加入1.0 mg·L-16-BA和0.5 mg·L-1NAA,再生芽的成苗率可達(dá)50%以上。不定芽在MS培養(yǎng)基中受鹽脅迫的影響容易失水死亡,1/2MS的培養(yǎng)基中鹽分對(duì)不定芽的傷害減少,不定芽可直接形成不定根,且生根速度快,根毛生長健壯,從而形成完整植株[30],這與本研究觀點(diǎn)一致,本研究選用1/2MS培養(yǎng)基獲得良好的生根效果,一方面是因?yàn)?/2MS本身具有促進(jìn)植物生根的能力,另一方面是羊草的生根能力比較強(qiáng)。

植物組培苗的遺傳穩(wěn)定性主要由基因型、繼代次數(shù)、培養(yǎng)條件等因素影響[31-32],通過表型鑒定無法檢測出培養(yǎng)中產(chǎn)生的變異,因此,變異檢測成為生產(chǎn)中亟待解決的問題。近年來,幾種DNA分子標(biāo)記技術(shù)已被成功應(yīng)用于檢測再生植株遺傳穩(wěn)定性[33-34]。其中,簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增(ISSR)具有快速高效、操作簡便及低成本被廣泛使用[35-36]。本研究利用ISSR檢測技術(shù)對(duì)建立的羊草再生體系穩(wěn)定性進(jìn)行檢測,檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨機(jī)選擇的再生植株擴(kuò)增圖譜一致,沒有檢測出多態(tài)性片段,說明該組培再生體系誘導(dǎo)羊草再生植株能夠保持遺傳上的穩(wěn)定性。同時(shí),利用上述引物和ISSR-PCR擴(kuò)增體系具有可靠的應(yīng)用價(jià)值,可以用作羊草的遺傳多樣性分析。

4 結(jié)論

以去稃的羊草種子為外植體,100 mg·L-1赤霉素(GA3)浸泡24 h后使用,愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+2.0 mg·L-12,4-D+ 0.5 mg·L-1KT,誘導(dǎo)率可達(dá)83.11%;繼代培養(yǎng)基為:MS+2.0 mg·L-12,4-D,胚性愈傷誘導(dǎo)率為53.26%;分化培養(yǎng)基為:MS+1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA,分化率為84.29%,成苗率為52.86%;生根培養(yǎng)基為:MS+1/2MS,生根率及移栽存活率為100%。該組培再生體系對(duì)不同品種的羊草愈傷誘導(dǎo)及分化具有共性和參考價(jià)值。通過ISSR分析,再生植株沒有發(fā)生遺傳變異,能夠保持遺傳上的穩(wěn)定性,為優(yōu)良羊草種質(zhì)選育提供了新的途徑。