謝汛杰,江劍輝,曾偉宏△

1南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部(廣東廣州 510220); 2廣東省婦幼保健院(廣東廣州 511400)

高苯丙氨酸血癥(HPA)常見于苯丙氨酸羥化酶(PAH)缺乏癥導(dǎo)致的苯丙酮尿癥(PKU)或四氫生物蝶呤(BH4)輔酶缺乏導(dǎo)致的四氫生物蝶呤缺乏癥(BH4D);兩者血中苯丙氨酸(Phe)或Phe/Tyr均明顯升高,除了BH4D會(huì)出現(xiàn)肌張力異常外,兩者其余表現(xiàn)相似,臨床上容易誤診,檢測(cè)尿液中的新蝶呤和生物蝶呤有助于PKU和BH4D的鑒別診斷[1-4]。高效液相色譜-熒光檢測(cè)法(HPLC-RF)是檢測(cè)尿液中的新蝶呤(N)和生物蝶常(B)用方法。國內(nèi)現(xiàn)用于HPLC檢測(cè)尿蝶呤譜的前處理方法主要有碘(I2)氧化法[5]和二氧化錳(MnO2)氧化法[1]。本文通過比較I2氧化法及與MnO2氧化法的兩種前處理方法對(duì)尿液中的新蝶呤和生物蝶呤定量檢測(cè),尋找一種合適的尿蝶呤譜前處理方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 抽取55例健康人群和10例確診PKU或BH4D患者新鮮尿液標(biāo)本,年齡在1月到1歲區(qū)間(中位數(shù)為4個(gè)月),其中男39例,女26例。研究經(jīng)過廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(廣東省婦幼保健院醫(yī)倫第[202301311]號(hào))。

1.2 試劑 新蝶呤標(biāo)準(zhǔn)品(M.W.253.2阿拉丁公司),生物蝶呤標(biāo)準(zhǔn)品(M.W.237.2西格瑪公司),HPLC級(jí)甲醇(默克公司),37%濃鹽酸(廣州化學(xué)試劑廠),500 g碘化鉀(CNW公司),500 g抗壞血酸(CNW公司),100 g碘片(阿拉丁公司),二氧化錳(廣州化學(xué)試劑廠)。

1.3 儀器設(shè)備 sartorius公司BSA124S-CW高精度分析天平,日本島津公司高效液相色譜層析系統(tǒng)(包括LC-20AT高壓雙泵,SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器,色譜柱Diamonsil C18(4.6 mm I.D×250 mL,5 μm),RF-20A熒光檢測(cè)器)。

1.4 試劑配制

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液配制 稱量10 mg新蝶呤(N)和10 mg生物蝶呤(B),分別加入0.1 mol/L NaOH充分溶解并定容到25 mL,分別用EP管每管分裝1 mL,置于-20℃冷凍保存。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)品工作液配制 取標(biāo)新蝶呤和生物蝶呤準(zhǔn)品儲(chǔ)備液,加入0.1 mol/L 鹽酸分別稀釋到80 μg/L并混勻,再加入0.1 mol/L HCL稀釋成7個(gè)濃度(20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.1、0.01 μg/L)并上機(jī),每個(gè)濃度測(cè)定2次,取均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3 質(zhì)控品配制 取標(biāo)新蝶呤和生物蝶呤準(zhǔn)品儲(chǔ)備液,加入0.1 mol/L 鹽酸分別稀釋到80 μg/L并混勻,再加入0.1 mol/L HCL稀釋成2.0 μg/L和0.5 μg/L兩個(gè)水平。

1.4.4 鹽酸配制 移液管吸取37%濃鹽酸(12 mol/L)并用超純水分別稀釋成9、6、3、1、0.1 mol/L溶液。

1.4.5 碘液(I2-KI)配制 稱量15.6 g碘化鉀(KI)溶于30 mL超純水并加入1.95 g碘片(I2)配制成0.5 mol/L I2-KI溶液,再用超純水分別稀釋成0.1、0.05、0.01 mol/L溶液。

1.4.6 抗壞血酸配制 稱量2.64 g 抗壞血酸溶于30 mL超純水配制成0.5 mol/L VitC溶液再用超純水分別稀釋成0.1 mol/L、0.05 mol/L、0.01 mol/L溶液。

1.5 方法

1.5.1 I2氧化法方法 取樣本(標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品及新鮮尿液)0.5 mL,加入6 mol/L鹽酸25 μL,0.05 mol/L I2-KI溶液0.5 mL,充分混勻,放置暗處30 min,然后加入0.05 mol/L 抗壞血酸溶液0.5 mL,再加入超純水定容到2.5 mL,搖勻,用0.45 μm微孔濾器過濾并上機(jī)分析。

1.5.2 MnO2氧化法方法 取樣本(標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品及新鮮尿液)并立刻加入抗壞血酸(每mL尿液加入10 mg)混勻,處理前3 000 r/min離心10 min后取上清0.5 mL,依次加入1 mol/L鹽酸50 μL、10 mg MnO2,離心過濾,并以0.1 mol/L 鹽酸定容到2.5 mL,用0.45 μm微孔濾器過濾并上機(jī)分析。

1.5.3 色譜條件參數(shù) 流動(dòng)相92%超純水和8%HPLC級(jí)甲醇,恒定流速0.9 mL/min,色譜柱Diamonsil C18(4.6 mm I.D×250 mmL,5 μm),柱溫30℃,激發(fā)波長(zhǎng)360 nm,檢測(cè)波長(zhǎng)445 nm。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)通過K-S檢驗(yàn)是否符合正態(tài)分布,符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)分析,以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用2個(gè)相關(guān)樣本W(wǎng)ilcixon秩和檢驗(yàn)分析,以中位數(shù)(四分位數(shù))表示。

2 結(jié)果

2.1 尿蝶呤譜分析在鑒別高苯丙氨酸血癥中的應(yīng)用 選取門診就診患兒14份新鮮樣本,分別用I2氧化法和MnO2氧化法處理后上機(jī)分析新蝶呤(N)、生物蝶呤(B)和生物蝶呤比例(B/(N+B))?？梢妰煞N方法輔助診斷PKU和BH4D(PTPS)的符合率均達(dá)100%,兩種方法均可用于尿蝶呤譜檢測(cè)。見表1、圖1(N保留時(shí)間5.6 min,B保留時(shí)間10.2 min)。

圖1 不同前處理方式處理正常樣本、PTPS樣本及PKU樣本的比較

圖2 兩種尿喋呤譜前處理的日間重復(fù)性試驗(yàn)比較

表1 尿蝶呤譜分析在鑒別高苯丙氨酸血癥中的應(yīng)用

2.2 兩種方法檢測(cè)結(jié)果及檢測(cè)限對(duì)比 選取新鮮尿液樣本,分別用I2氧化法和MnO2氧化法處理后上機(jī)分析新蝶呤(N)和生物蝶呤(B),色譜峰面積與濃度成正比,色譜圖可見圖1～3,每份樣本測(cè)量?jī)纱稳【怠2氧化法處理N和B的檢測(cè)結(jié)果高于MnO2氧化法,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見表2。I2氧化法和MnO2氧化法處理N的檢測(cè)限,均取65例中基質(zhì)空白所產(chǎn)生的儀器信號(hào)的3倍值的最低值,見表3。

表2 兩種前處理方法結(jié)果比較 M(P25,P75)

表3 兩種前處理方法檢測(cè)限比較

2.3 兩種前處理方法重復(fù)性實(shí)驗(yàn)對(duì)比

2.3.1 批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)選取3份新鮮樣本,分別用I2氧化法和MnO2氧化法處理,每份樣本重復(fù)測(cè)定10次,計(jì)算3份樣本平均變異系數(shù)。兩種方法處理新蝶呤(N)和生物蝶呤(B)均有較好的批內(nèi)精密度(CV<5%),見表4。

表4 兩種方法重復(fù)性實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià) %

2.3.2 日間重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)選取3份新鮮尿液樣本,I2組樣品分裝3管,MnO2組樣本加入適量抗壞血酸混勻后分裝3管,每組各取1份當(dāng)天處理分析,其余待處理樣本置于負(fù)20℃冰箱存放,分別在2、3、5、7 d取出后37℃溫箱復(fù)溫30 min后處理分析,每份樣品測(cè)定2次,計(jì)算3份樣本平均變異系數(shù)。I2氧化法的日間精密度(CV<5%)比MnO2氧化法的日間精密度(5%

2.4 兩種前處理方法回收實(shí)驗(yàn)對(duì)比 隨機(jī)選取3份新鮮樣本各450 μL,分別加50 μL入低、中、高濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,混勻后用兩種前處理方法分別處理,上機(jī)分析,每份重復(fù)測(cè)量?jī)纱稳【?計(jì)算平均回收率。可見I2氧化法處低濃度標(biāo)準(zhǔn)品新蝶呤(N)回收率較差(128.19%);MnO2氧化法處理低濃度標(biāo)準(zhǔn)品回較好(N:85.7%,B:87.55%),兩種方法中、高濃度回收率均好。見表5。

表5 兩種方法回收試驗(yàn)評(píng)價(jià)

2.5 兩種方法線性范圍評(píng)價(jià)對(duì)比 選取80 μg/L的新蝶呤、生物蝶呤標(biāo)準(zhǔn)品,兩者混勻,加0.1 mol/L 鹽酸稀釋成20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.1、0.01 μg/L,然后用I2氧化法和MnO2氧化法分別處理,上機(jī)分析,每份重復(fù)測(cè)量?jī)纱稳【?以預(yù)測(cè)濃度為橫坐標(biāo),實(shí)際濃度為縱坐標(biāo),繪制散點(diǎn)圖,建立直線回歸方程,可見在0.01～20.00 μg/L范圍內(nèi),兩種前處理方法處理的新蝶呤和生物蝶呤均有較好的線性(R2>0.99)。見圖3。

圖3 不同前處理方法處理新喋呤和生物喋呤線性圖

3 討論

臨床上HPA患兒主要苯丙氨酸羥化酶或輔酶四氫生物蝶呤缺乏引起,兩者癥狀相似,但治療方式不一致,需要鑒別診斷。高效液相色譜法檢測(cè)尿蝶呤譜、紅細(xì)胞DHPR活性測(cè)定、BH4負(fù)荷試驗(yàn)和基因診斷能有效鑒別PKU和BH4D,其中HPLC法檢測(cè)尿蝶呤譜可快速鑒別PKU、BH4D[6],聯(lián)合紅細(xì)胞DHPR活性測(cè)定能快速有效鑒別出BH4D的類型,包括PTPS、DHPR、GTPCH三種常見類型[1、7];BH4負(fù)荷試驗(yàn)和基因診斷考慮到操作性和時(shí)效性,常不作為快速鑒別PKU和BH4D的篩查手段[3,8]。在HPLC法中,國外有研究表明鹽酸洗脫干血片也可用于血液中蝶呤類檢測(cè)[9]。國內(nèi)常用I2氧化法[5]或者M(jìn)nO2氧化法[1]處理新鮮尿液標(biāo)本,這兩種方法的標(biāo)本可選用隨機(jī)尿,收集方便且無創(chuàng),實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單,是HPLC法檢測(cè)尿蝶呤譜前處理的首選方法。

本研究表明,I2氧化法和MnO2氧化法檢測(cè)尿蝶呤能有效鑒別PKU和BH4D,疾病診斷符合率達(dá)到100%,但兩種方法檢測(cè)結(jié)果有差異(P<0.05),這可能與兩種方法使用不同的鹽酸濃度有關(guān)(I2氧化法使用6 mol/L,MnO2氧化法使用1 mol/L),有研究表明[10],改變實(shí)驗(yàn)環(huán)境的酸度會(huì)影響蝶呤類物質(zhì)的檢出,這是尿液PH值或離子強(qiáng)度會(huì)影響蝶呤類物質(zhì)熒光基團(tuán)的結(jié)構(gòu),從而影響檢測(cè);另外,上述兩種方法有差異也可能與使用的氧化物類型、濃度或氧化時(shí)間有關(guān)。氧化物的濃度會(huì)對(duì)新蝶呤和生物蝶呤有影響,這可能與高濃度氧化物或強(qiáng)氧化性物質(zhì)會(huì)破壞尿液中的新蝶呤和生物蝶呤;低濃度氧化物、弱氧化性物質(zhì)或氧化時(shí)間不足,難以將尿液中的四氫生物蝶呤、二氫生物蝶呤等生物蝶呤衍生物完全氧化成生物蝶呤有關(guān)[7]。

在I2氧化法和MnO2氧化法的方法學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中,兩種方法N的檢測(cè)限[I2氧化法:(0.000 63±0.000 27)μg/L;MnO2氧化法:(0.000 76±0.000 32)μg/L],B的檢測(cè)限[I2氧化法:(0.000 84±0.000 35)μg/L;MnO2氧化法:(0.000 81±0.000 33)μg/L],I2氧化法優(yōu)于MnO2氧化法。兩種方法的批內(nèi)精密度(CV)均較好(I2氧化法和MnO2氧化法N:2.54%、3.51%,B:2.43%、3.26%);批間CV I2氧化法優(yōu)于MnO2氧化法(I2氧化法和MnO2氧化法N:2.26%、6.25%,B:2.75%、7.32%)。尿液樣本在-20℃冰箱保存,穩(wěn)定性較好(CV<10%)。在低濃度標(biāo)準(zhǔn)品回收試驗(yàn)中,I2氧化法中N的平均回收率較差,(I2氧化法和MnO2氧化法N:128.19%、85.70%;B:93.49%、87.55%),這可能與低濃度物質(zhì)在儀器中的響應(yīng)度低,容易受儀器噪音干擾有關(guān);中、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品回收試驗(yàn)N和B的平均回收率均良好(中、高濃度回收率分別是I2氧化法N:109.90%、99.59%,B:97.57%、103.29%;MnO2氧化法N:94.71%、98.41%,B:95.43%、100.50%)。兩種方法處理樣品在0.01～20.00 μg/L范圍內(nèi)均有良好的線性。上述方法學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果可認(rèn)為I2氧化法優(yōu)于MnO2氧化法,但兩者可基本滿足臨床上檢測(cè)尿蝶呤譜的需求。由于兩者新蝶呤和生物蝶呤的檢測(cè)結(jié)果、檢測(cè)限、精密度和回收率有差異,各實(shí)驗(yàn)室需要結(jié)合實(shí)際需要選擇合適的方法并制定相應(yīng)的參考范圍[11-12]。

利益相關(guān)聲明:作者均聲明無利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明:謝汛杰設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過程,分析數(shù)據(jù),論文撰寫;江劍輝實(shí)驗(yàn)資金支持,論文修改;曾偉宏提出研究思路,設(shè)計(jì)研究方案,論文修改。