高揚,董海鵬,王文娟,劉峰,劉超

石家莊市第三醫(yī)院創(chuàng)傷一科(河北石家莊 050011)

股骨頸骨折內(nèi)固定術(shù)后股骨頭壞死(osteonecrosis of femoral head,ONFH)是內(nèi)固定術(shù)最嚴重的并發(fā)癥,給患者帶來了巨大的經(jīng)濟和心理負擔(dān)。研究人員一直致力于減少或避免ONFH的發(fā)生。公認的內(nèi)固定術(shù)后ONFH危險因素有股骨骨折Garden分型和復(fù)位質(zhì)量[1-4]。此外,研究人員也發(fā)現(xiàn)了許多相關(guān)的ONFH危險因素,包括術(shù)前牽引[1-2]、植入物取出[5]、復(fù)位類型[6]、損傷機制[7]和損傷到手術(shù)的時間間隔[6,8]等。最近,研究報道一些血液生化標(biāo)志物與非創(chuàng)傷性O(shè)NFH有關(guān)。低水平的1型膠原交聯(lián)羧基端肽(CTX)和1型原膠原氨基端前肽(PINP)被認為是糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的ONFH的早期診斷生物標(biāo)志物[9],白細胞介素(IL)-9和IL-33作為免疫和炎癥相關(guān)分子在ONFH患者中的表達也顯著增高[10-11]。此外,血清軟骨低聚基質(zhì)蛋白(COMP)、αMSH和胡蘿卜素等在ONFH患者和對照組之間均有顯著差異[12-14]。但是,很少有研究探究創(chuàng)傷性O(shè)NFN與血清學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系。本課題組前期發(fā)現(xiàn)臨床內(nèi)固定術(shù)后血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)高水平狀態(tài)是術(shù)后股骨頭壞死的風(fēng)險因素。PAI-1是重要的纖溶系統(tǒng)調(diào)控因子,可通過與組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)形成復(fù)合物來調(diào)節(jié)血漿和血管內(nèi)皮細胞表面游離的活性t-PA的含量,進而阻止活性纖維蛋白的降解,使血液呈高凝狀態(tài)[15]。因此,術(shù)后PAI-1高水平狀態(tài)增加股骨頭壞死風(fēng)險的潛在機制可能是內(nèi)固定術(shù)后過表達的PAI-1引起的高凝狀態(tài)影響了局部血供,加重了股骨頭局部缺血,最終誘發(fā)股骨頭壞死。課題組結(jié)合前期研究認為縮短術(shù)后血漿PAI-1高水平持續(xù)狀態(tài)可以有效促進股骨頭局部血供重建,降低股骨頭壞死程度。因此,我們在2022年1月至2023年1月期間使用大鼠創(chuàng)傷性股骨頭壞死模型開展隨機對照試驗。通過PAI-1抑制劑和外源性PAI-1縮短或延長創(chuàng)傷后PAI-1的高水平持續(xù)時間,觀察股骨頭壞死情況,探究PAI-1抑制劑對創(chuàng)傷后股骨頭壞死程度的影響。本研究旨在為臨床治療提供新的研究方向和思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本研究選取成年SD雄性大鼠60只,體重(350±50)g。實驗動物飼養(yǎng)于河北省實驗動物中心[SCXK(冀)2022-001],保持溫度(23±1)°C,光照和黑暗循環(huán)各12 h,并給予充足食物和水。本研究經(jīng)我院動物倫理委員會批準(zhǔn)同意后實施(批準(zhǔn)號:K20211218208)。

1.2 主要試劑及設(shè)備 PAI-1抑制劑毛兩面針?biāo)?Toddalolactone)和Tiplaxtinin均購自MedChemExpress中國公司;外源性PAI-1也購自MedChemExpress中國公司;PAI-1 Activity Assay試劑盒購自美國abcam公司;eXplore Locus小動物活體microCT系購自美國GE Healthcare公司。

1.3 造模與分組 所有大鼠使用2%戊巴比妥(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉并放置于手術(shù)臺上;待深度麻醉后,備皮并在右髖側(cè)轉(zhuǎn)子中心做長約2 cm切口,分離肌肉暴露髖關(guān)節(jié);打開關(guān)節(jié)囊切斷髖關(guān)節(jié)圓韌帶;使用電凝法切斷股骨頸周圍血供,造成股骨頭缺血[16]。術(shù)后使用生理鹽水沖洗傷口,嚴密止血并分層縫合切口,術(shù)后5 d內(nèi)注射氨芐青霉素[25 mg/(kg·d)]。大鼠蘇醒后單獨飼養(yǎng)于鼠籠,無進食及運動限制。將60只造模大鼠隨機分為PAI-1抑制劑組、PAI-1組和空白對照組(每組20只)。各組大鼠建模6 h后開始給予相應(yīng)干預(yù)。PAI-1抑制劑組大鼠在術(shù)后6 h給予抑制劑毛兩面針?biāo)馗骨蛔⑸?1 mg/kg[17],1 d后給予抑制劑Tiplaxtinin灌胃,2 mg/(kg·d),持續(xù)4周。PAI-1組大鼠術(shù)后6 h給予外源性PAI-1腹腔注射,每3 d 1次,劑量為2.5 nmol/kg PAI-1所溶的生理鹽水100 mL,持續(xù)4周[18]。空白對照組術(shù)后每3 d腹腔注射相同劑量的生理鹽水。術(shù)后4周時對實驗動物實施安樂死,并取右側(cè)股骨頭進行顯微CT和HE染色檢查。

1.4 血漿活性PAI-1檢測 所有大鼠在術(shù)前、術(shù)后6、12、24 h和4周時分別采鼠尾靜脈血進行血漿活性PAI-1檢測。靜脈血經(jīng)離心(3 000 r/min,15 min)后得到血清1 mL置于1.5 mL離心管內(nèi)。獲得的血清采用PAI-1 Activity Assay試劑盒檢測活性PAI-1含量。相關(guān)操作嚴格按照試劑盒實驗流程進行。

1.5 顯微CT觀察股骨頭影像學(xué)變化 使用顯微CT掃描儀對所有大鼠右側(cè)股骨頭進行掃描,并采用GE Micro View軟件分析數(shù)據(jù)[19]。觀察指標(biāo)為骨體積分數(shù)(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁分離度(Tb.Sp)。

1.6 HE染色觀察股骨頭病理組織學(xué)改變 采集右側(cè)股骨頭標(biāo)本進行組織病理學(xué)檢查。標(biāo)本固定在10%中性鈣甲醛中7 d,然后用10%EDTA溶液脫鈣28 d。脫鈣和石蠟包埋后,制成5 μm厚的切片并進行HE染色。HE染色用于評估骨壞死情況,評估標(biāo)準(zhǔn)基于Dong等[20]的研究。當(dāng)髓質(zhì)造血細胞或脂肪細胞壞死、空腔陷窩或骨細胞核凝聚時,判斷存在骨壞死。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 所有統(tǒng)計分析均由GraphpadPrism 8.0軟件執(zhí)行。定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用方差分析檢驗對滿足正態(tài)分布和方差齊性檢驗的數(shù)據(jù)進行分析,不滿足方差齊性的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗進行分析。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 本研究將60只雄性大鼠隨機分配至PAI-1抑制劑組、PAI-1組和空白對照組,術(shù)前和實驗結(jié)束時體重組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),表明術(shù)前動物基礎(chǔ)情況均衡可比且術(shù)后恢復(fù)良好。實驗結(jié)束時,PAI-1抑制劑組中2只大鼠出現(xiàn)術(shù)后出血,經(jīng)治療后出血停止?？瞻讓φ战M1只大鼠術(shù)后出現(xiàn)感染死亡。余無特殊并發(fā)癥。為保實驗結(jié)論準(zhǔn)確,以上3只大鼠未納入數(shù)據(jù)統(tǒng)計。見表1。

表1 各組大鼠一般情況

2.2 各組大鼠血漿活性PAI-1含量比較 血漿活性PAI-1含量分析結(jié)果顯示,與術(shù)前相比,空白對照組和PAI-1抑制劑組在術(shù)后6 h血漿活性PAI-1含量明顯升高,而隨著時間的延長,即術(shù)后12、24 h和術(shù)后4周,血漿活性PAI-1含量顯著下降(P<0.01)。PAI-1組血漿活性PAI-1含量在術(shù)后6 h亦明顯升高(P<0.01),但在術(shù)后12、24 h和術(shù)后4周血漿活性PAI-1含量無顯著的降低趨勢(P>0.05)。術(shù)前與術(shù)后6 h 的血漿活性PAI-1含量比較的結(jié)果顯示,與空白對照組相比,PAI-1抑制劑組、PAI-1組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。但在術(shù)后12 h、24 h及術(shù)后4周時的血漿活性PAI-1含量比較結(jié)果顯示,與空白對照組相比,PAI-1抑制劑組明顯降低,PAI-1組顯著升高(P<0.01);與PAI-1抑制劑組相比,PAI-1組在術(shù)后12 h、24 h及術(shù)后4周時的血漿活性PAI-1含量明顯升高(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠不同時間點血漿活性PAI-1含量對比

2.3 各組大鼠骨體積分數(shù)、骨小梁厚度和骨小梁分離度比較 顯微CT用于評估術(shù)后4周時各組大鼠創(chuàng)傷性股骨頭壞死發(fā)生情況,結(jié)果顯示:與PAI-1抑制劑組相比,PAI-1組和空白對照組骨小梁連續(xù)性中斷、骨小梁稀疏、骨礦物質(zhì)流失明顯。各組股骨頭骨體積分數(shù)(BV/TV×100%)的比較結(jié)果顯示,與空白對照組相比,PAI-1抑制劑組顯著升高(P<0.05),PAI-1組顯著降低(P<0.05);與PAI-1抑制劑組相比,PAI-1組股骨頭骨體積分數(shù)顯著降低(P<0.05)。各組骨小梁厚度計算的結(jié)果顯示,與空白對照組比較,PAI-1抑制劑組的骨小梁厚度顯著升高(P<0.05),PAI-1組顯著降低(P<0.05);與PAI-1抑制劑組相比,PAI-1組骨小梁厚度顯著降低(P<0.05)。骨小梁分離度計算的結(jié)果顯示,與空白對照組相比,PAI-1抑制劑組顯著降低(P<0.05),PAI-1組顯著升高(P<0.05);與PAI-1抑制劑組相比,PAI-1組骨小梁分離度顯著升高(P<0.05)。見圖1、表3。

圖1 各組大鼠股骨頭顯微CT結(jié)果比較

表3 各組大鼠股骨頭顯微CT數(shù)據(jù)結(jié)果比較

2.4 各組大鼠股骨頭病理組織學(xué)觀察 股骨頭HE染色表明,與空白對照組相比,PAI-1抑制劑組股骨頭空骨陷窩和脂肪壞死發(fā)生率明顯減少,PAI-1組明顯增加?？展窍莞C率(空骨陷窩數(shù)/骨陷窩數(shù)×100%)的分析結(jié)果顯示,且與空白對照組相比,PAI-1抑制劑組顯著降低(P<0.05),而PAI-1組顯著升高(P<0.05);與PAI-1抑制劑組相比,PAI-1組空骨陷窩率顯著升高(P<0.05)。各組大鼠股骨頭的脂肪組織面積比較結(jié)果顯示,與空白對照組比較,PAI-1抑制劑組明顯降低(P<0.05),而PAI-1組顯著升高(P<0.05);與PAI-1抑制劑組相比,PAI-1組脂肪組織面積顯著升高(P<0.05)。見圖2、表4。

表4 各組大鼠股骨頭HE染色數(shù)據(jù)結(jié)果比較

3 討論

ONFH是一種股骨頭血供被破壞進而導(dǎo)致骨壞死的病理過程,是骨科最具挑戰(zhàn)性的疾病之一。為追尋更好的治療方法和治療材料,研究人員需要開展各種基礎(chǔ)和臨床試驗,在這個過程中,可靠的股骨頭壞死動物模型十分重要。合適、可靠的動物模型可以反映病理條件下體內(nèi)微環(huán)境的變化,在一定程度上反映人類疾病的進展。股骨頭壞死動物模型可分為非創(chuàng)傷性和創(chuàng)傷性兩類[21],本研究采用大鼠創(chuàng)傷性股骨頭壞死模型[16]。建模過程中的手術(shù)創(chuàng)傷與臨床中內(nèi)固定手術(shù)創(chuàng)傷相似,而對股骨頸周圍血管的阻斷與股骨頸骨折對血管的影響相似。因此,本研究中的創(chuàng)傷性模型可以很好地模擬臨床中股骨頸骨折內(nèi)固定術(shù)的損傷要素,反映病理條件下患者內(nèi)固定術(shù)后的體內(nèi)生理變化。此外,PAI-1主要通過影響局部血運增加股骨頭壞死風(fēng)險,激素或酒精誘發(fā)的非創(chuàng)傷性模型無法用于探究PAI-1與股骨頭壞死的關(guān)系。因此,選擇合適的創(chuàng)傷性動物模型是獲得可靠研究結(jié)論的基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn),患者創(chuàng)傷后早期血漿PAI-1分泌明顯升高并與損傷嚴重程度有關(guān)。在Hayakawa等[22]的研究中,大鼠受到嚴重鈍性創(chuàng)傷后3 h時血漿PAI-1含量約為98 ng/mL,可達到非創(chuàng)傷組大鼠的180倍。而Wu等[23]發(fā)現(xiàn),大鼠多發(fā)創(chuàng)傷后4 h血漿PAI-1可升高至33 ng/mL。兩項研究結(jié)果的差異說明創(chuàng)傷嚴重程度與血漿PAI-1分泌水平相關(guān),較高的PAI-1可能意味著更加嚴重的創(chuàng)傷。Carter等[24]模擬了大鼠雙側(cè)股骨骨折條件,發(fā)現(xiàn)手術(shù)組和假手術(shù)組血漿PAI-1水平在術(shù)后6 h和12 h時有統(tǒng)計學(xué)差異,而在24 h時無統(tǒng)計學(xué)差異。因此,本研究中建模后6 h血漿PAI-1水平(PAI-1抑制劑組64.95 ng/mL、PAI-1組64.84 ng/mL,空白對照組65.31 ng/mL)與建模過程中的創(chuàng)傷程度相匹配,且空白對照組術(shù)后PAI-1變化符合正常創(chuàng)傷后生理趨勢。

本研究中,PAI-1抑制劑組在術(shù)后加用PAI-1抑制劑后,血漿活性PAI-1含量顯著降低,縮短了高PAI-1水平持續(xù)時間,且顯微CT和組織染色結(jié)果表明大鼠股骨頭壞死程度顯著下降。與之相對的,PAI-1組大鼠在術(shù)后加入外源性PAI-1延長了高PAI-1水平時間,且大鼠股骨頭壞死情況更加嚴重。這些結(jié)果表明血漿活性PAI-1是術(shù)后股骨頭壞死的重要風(fēng)險因素之一,且PAI-1抑制劑可有效降低股骨頭壞死發(fā)生風(fēng)險。1963年研究人員首次報道了纖溶酶原激活劑抑制物PAI-1。PAI-1通過減少纖維蛋白降解抑制了纖溶系統(tǒng),進而促進血栓形成。因此,它是血管事件進展過程中的關(guān)鍵蛋白,與心肌梗死、腦卒中、深靜脈血栓形成和微血管血栓密切相關(guān)[25]。這些血管事件對內(nèi)固定術(shù)后患者來說都是引發(fā)股骨頭壞死的直接風(fēng)險因素。術(shù)后使用抑制劑減少血管血栓形成,是改善股骨頭血供降低壞死風(fēng)險的重要措施之一。此外,研究還發(fā)現(xiàn)PAI-1還是肥胖、糖尿病和代謝綜合征的生物學(xué)標(biāo)志物[26]。肥胖患者脂肪細胞中PAI-1 mRNA和血漿PAI-1含量分別是正常人的2倍和6倍。研究人員給肥胖動物模型服用PAI-1抑制劑后觀察到動物體重降低和脂肪細胞體積減少[27]。因此,長期服用PAI-1抑制劑對于降低肥胖誘發(fā)的股骨頭壞死風(fēng)險具有積極作用。相類似的,PAI-1與高血壓、糖尿病和高膽固醇血癥之間的密切聯(lián)系也提示PAI-1抑制劑可能有著良好的研究前景。

綜上所述,PAI-1抑制劑既可以通過術(shù)后早期抑制PAI-1分泌直接抑制血栓形成,進而改善股骨頭血供降低壞死風(fēng)險,又可以通過長期服用緩解肥胖、高血壓、糖尿病和代謝綜合征等疾病來間接降低股骨頭壞死風(fēng)險。然而,盡管本研究進行了嚴格的對照試驗,但仍存在一定局限性。首先,術(shù)后6 h給予PAI-1抑制劑時有2只大鼠發(fā)生出血并發(fā)癥,因此更加安全的抑制劑類型和治療時間點的選擇仍需進一步研究。其次,動物研究的結(jié)論仍需臨床驗證才能真正指導(dǎo)臨床實踐,使患者臨床受益。

在大鼠模型中,血漿活性PAI-1是創(chuàng)傷性骨頭壞死的重要風(fēng)險因素之一,且使用PAI-1抑制劑可以有效降低大鼠血漿活性PAI-1含量,降低大鼠創(chuàng)傷后股骨頭壞死程度。本研究為進一步的臨床研究提供了堅實的實驗基礎(chǔ)。但是,新型抑制劑的開發(fā)仍需進一步研究。

利益相關(guān)聲明:本文所有作者聲明無利益沖突。

作者貢獻說明:高揚負責(zé)實驗設(shè)計和論文初稿的寫作; 董海鵬和王文娟負責(zé)方案執(zhí)行和數(shù)據(jù)收集;劉峰負責(zé)數(shù)據(jù)分析處理;劉超負責(zé)論文修改。