余 潔 黃風(fēng)琴 黃嘉穎 徐心雨

廣東省人民醫(yī)院南海醫(yī)院 廣東佛山 528200

乳腺癌是好發(fā)于女性乳腺上皮組織的惡性腫瘤,是一種在多種致癌因子的作用下增殖失控而出現(xiàn)的疾病,以乳頭溢液、乳房腫塊、腋窩淋巴結(jié)腫大等為臨床主要表現(xiàn)[1-2]。有文獻(xiàn)顯示,乳腺癌疾病的不同發(fā)展階段與其預(yù)后密切相關(guān),早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是提高乳腺癌患者5年內(nèi)存活率的主要措施[3]。研究表明,原位癌在5年內(nèi)的存活率較高,早期浸潤癌患者5年內(nèi)的存活率約為85%,而已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的浸潤癌患者5年內(nèi)存活率不足30%,因此,選擇更有效的評估指標(biāo)對乳腺癌患者的治療和預(yù)后具有重要意義[4]。有研究表明,M2丙酮酸激酶(PKM2)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin蛋白)可作為識別、診斷乳腺癌的重要指標(biāo),單獨(dú)檢測時(shí)在臨床中運(yùn)用較多,但二者同時(shí)檢測用于判斷疾病發(fā)展和預(yù)后的研究較少[5-6]。PKM2是一種能將ADP和磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP和丙酮酸的糖酵解限速酶,在宮頸癌、乳腺癌、淋巴肉瘤等患者中的表達(dá)增高,可作為診斷以上疾病的準(zhǔn)確、迅速的標(biāo)志物[7]。 E-cadherin蛋白又稱為上皮細(xì)胞鈣黏素,對細(xì)胞識別、分化和遷移具有重要作用[8]。本文通過對腫瘤組織中PKM2和E-cadherin蛋白的表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理及預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行探究,旨在為臨床中患者的診斷、治療、預(yù)后判斷提供參考價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2020年2月—2022年 2月收治的447例乳腺癌患者作為本次研究的對象,患者均為女性,年齡23～68歲,平均年齡(42.46±11.26)歲,BMI指數(shù)(22.49±1.18)kg/m2,平均病程(3.48±1.46)個(gè)月,經(jīng)病理檢查確診為luminal A型乳腺癌,TNM分期情況如下:Ⅰ期121例,Ⅱ期267例,Ⅲ期59例。本研究患者及家屬均知情同意,且本研究經(jīng)院內(nèi)倫理委員會批準(zhǔn)進(jìn)行。

納入標(biāo)準(zhǔn):① 患者均為初次發(fā)病,且經(jīng)病理學(xué)檢查及影像學(xué)檢查,符合2017年版《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范》中關(guān)于乳腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9],確診為乳腺癌患者;②患者在我院接受手術(shù)治療,臨床和病理資料完整,依從性較高;③患者神志清醒,言語能力正常,未有精神系統(tǒng)疾病;④患者隨訪時(shí)間超過6個(gè)月。

排除標(biāo)準(zhǔn):①患有其他惡性腫瘤患者;②患者曾接受過乳腺整形手術(shù);③患者有嚴(yán)重的血液系統(tǒng)疾病或凝血功能障礙;④處于哺乳期或妊娠期女性患者;⑤術(shù)前患者已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

1.2 免疫組化法檢測

對所有患者的乳腺癌組織和癌旁組織部分標(biāo)本進(jìn)行切片,按照4 μm厚度將石蠟標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片,后采取脫蠟處理,將標(biāo)本切片置于70 ℃烤箱中恒溫烘烤24 h,直至標(biāo)本脫蠟。使用蒸餾水沖洗表面蠟液后放入H2O2中室溫浸泡15 min,將其內(nèi)源性H2O2酶活性進(jìn)行滅活,后用蒸餾水沖洗干凈,將標(biāo)本切片置于蒸餾水溶液中備用。按照EDTA緩沖液:蒸餾水=1 ∶50的比例放入高壓鍋中后用電磁爐煮沸,待容器溫度超過98 ℃后,放入標(biāo)本切片煮1.5 min,然后關(guān)火持續(xù)保溫1 min,在室溫下冷卻后用蒸餾水沖洗,再用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行沖洗,連續(xù)沖洗3次;同時(shí)加入一抗在室溫下放置2～3 h,再用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行沖洗,連續(xù)沖洗3次;加入二抗在室溫下放置20 min,重復(fù)上述步驟。使用二氨基聯(lián)苯胺顯色,直至充分染色后用自來水沖洗,使用蘇木素復(fù)染,氨水反藍(lán),用無水乙醇脫水、干燥,后用中性樹脂封片,利用顯微鏡觀察。

1.3 觀察指標(biāo)

對患者進(jìn)行6個(gè)月隨訪,根據(jù)患者是否復(fù)發(fā)及是否發(fā)生轉(zhuǎn)移將患者分為預(yù)后良好組(261例)與預(yù)后不良組(186例),以免疫組化法對患者組織中的PKM2和E-cadherin蛋白表達(dá)情況進(jìn)行測定,探究患者乳腺癌組織中PKM2、E-cadherin蛋白表達(dá)與臨床病理間的關(guān)系,比較患者乳腺癌組織與癌旁組織、預(yù)后良好組與預(yù)后不良組間PKM2、E-cadherin蛋白表達(dá)情況,并探究PKM2、E-cadherin蛋白表達(dá)與患者預(yù)后不良情況的相關(guān)性。

結(jié)果判斷:在顯微鏡下細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色、棕褐色或染色較背景色相比明顯時(shí)判定為陽性,從5個(gè)不同視角觀察,以每個(gè)視角下細(xì)胞超過200個(gè),且計(jì)算后陽性細(xì)胞數(shù)量比例﹥50%判定為強(qiáng)陽性,陽性細(xì)胞數(shù)量比例為5%～50%時(shí)判定為弱陽性,而陽性細(xì)胞數(shù)量比例﹤5%判定為弱陽性。陽性=強(qiáng)陽性+弱陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PKM2在乳腺癌中的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

在不同年齡、腫瘤部位、腫瘤大小的乳腺癌患者中PKM2蛋白表達(dá)情況無差異(P>0.05);在絕經(jīng)后、中高分化、I～Ⅱ期及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中,PKM2蛋白表達(dá)陽性率更高(P<0.05),見表1、圖1。

圖1 PKM2癌(+++)

2.2 E-cadherin蛋白在乳腺癌中的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

在不同年齡、腫瘤部位、腫瘤大小的乳腺癌患者中E-cadherin蛋白表達(dá)情況無差異(P>0.05),見圖2;在絕經(jīng)前、中低分化、Ⅲ期及存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中,E-cadherin蛋白表達(dá)陽性率更高(P<0.05),見表2。

圖2 E-cad癌(-)

表2 E-cadherin蛋白在乳腺癌中的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系 例(%)

2.3 PKM2在乳腺癌組織與癌旁組織中表達(dá)情況比較

乳腺癌組織中PKM2表達(dá)陽性率(388/447例,86.80%)高于癌旁組織(242/447例,54.14%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=113.013,P<0.001),見表3、圖3。

圖3 PKM2癌旁(+)

表3 PKM2蛋白在乳腺癌組織與癌旁組織中表達(dá)情況比較 (例)

2.4 E-cadherin蛋白在乳腺癌組織與癌旁組織中表達(dá)情況比較

乳腺癌組織中 E-cadherin蛋白表達(dá)陽性率(178/447例,39.82%)低于癌旁組織(362/447例,80.98%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=156.618,P<0.001),見表4、圖4。

圖4 E-cad癌旁(++)

表4 E-cadherin蛋白在乳腺癌組織與癌旁組織中表達(dá)情況比較 (例)

2.5 不同預(yù)后情況下乳腺癌組織中PKM2、E-cadherin蛋白的表達(dá)情況比較

根據(jù)患者預(yù)后情況將患者分組,186例患者存在復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移情況,記為預(yù)后不良組,261例患者未發(fā)生復(fù)發(fā)情況,為預(yù)后良好組。預(yù)后不良組患者乳腺癌組織中PKM2陽性率為94.62%,高于預(yù)后良好組的81.23%;預(yù)后不良組患者乳腺癌組織中E-cadherin陽性率為30.65%,低于預(yù)后良好組的46.36%,差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表5。

表5 不同預(yù)后情況下乳腺癌組織中PKM2、E-cadherin蛋白的表達(dá)情況比較 例(%)

2.6 乳腺癌組織中PKM2、E-cadherin蛋白表達(dá)與患者預(yù)后不良情況的相關(guān)性分析

采用斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)對乳腺癌組織中PKM2、E-cadherin蛋白表達(dá)與患者預(yù)后情況的相關(guān)性進(jìn)行分析,患者預(yù)后不良與乳腺癌組織中PKM2陽性率呈正相關(guān)(r=0.195,P<0.001),與E-cadherin蛋白陽性率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.158,P=0.001)。見表6。

3 討論

乳腺癌是女性中發(fā)病率位居首位的惡性腫瘤,致死率較高,其原因主要為早期癥狀不明顯,發(fā)展至中晚期后乳腺癌增殖速度快,病情發(fā)展迅速,患者臨床表現(xiàn)乳房腫脹、皮膚異常等,若控制不及時(shí)會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移,造成多器官病變,嚴(yán)重威脅患者生命健康[10]。臨床中常使用觸診、CT掃描、磁共振掃描、病理學(xué)檢查等方式診斷乳腺癌,但均有不足之處,觸診時(shí)易受患者及醫(yī)師主觀因素影響,準(zhǔn)確度不高;CT掃描、磁共振掃描雖能滿足準(zhǔn)確度的要求,但檢查費(fèi)用高;病理學(xué)檢查屬于術(shù)后創(chuàng)傷性檢查,無法及時(shí)觀察判斷患者病情發(fā)展和預(yù)后情況,且不利于觀察研究藥物的治療效果[11]。

有研究表明,血清腫瘤生化指標(biāo)在乳腺癌的診斷和預(yù)后中具有重要意義,臨床中被廣泛使用[12-13]。PKM2作為糖代謝過程中的限速酶,能通過非代謝機(jī)制加速細(xì)胞的增殖和分化,可加速腫瘤細(xì)胞的生長,是參與癌細(xì)胞糖代謝過程的關(guān)鍵酶。有研究表明,糖代謝異常是影響乳腺癌患者疾病發(fā)展的重要因素,糖代謝過程中產(chǎn)生的乳酸不僅能作為糖異生的原料,還可發(fā)揮抑制作用,降低外周組織對葡萄糖的生物利用度,通過糖代謝異常和有氧糖代謝的雙重作用導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[14]。研究顯示,PKM2在肺癌、乳腺癌[15]等十余種癌癥疾病中均有高表達(dá),且與其不良臨床結(jié)局有關(guān)[16]。E-cadherin蛋白屬于鈣粘附蛋白家族中的跨膜糖蛋白,可參與細(xì)胞的分化、分泌和釋放,在臨床中已被用作判斷惡性腫瘤病情發(fā)展的標(biāo)志物,當(dāng)其水平降低時(shí),能減少腫瘤細(xì)胞之間的黏連。有研究顯示,E-cadherin 蛋白在乳腺癌中的表達(dá)水平較高,其高表達(dá)與癌細(xì)胞的分化、轉(zhuǎn)移、發(fā)展、預(yù)后密切相關(guān),能作為臨床判斷治療效果和預(yù)后的指標(biāo)[17]。

本研究中發(fā)現(xiàn),PKM2陽性率和E-cadherin蛋白陽性率與病理類型、絕經(jīng)情況、分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。分析其原因,PKM2高表達(dá)時(shí)會促進(jìn)癌細(xì)胞的有氧糖酵解過程,為癌細(xì)胞的生長、分化和增殖提供了能量,加快患者病情發(fā)展和浸潤程度,進(jìn)一步加速機(jī)體內(nèi)淋巴結(jié)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,而E-cadherin蛋白低表達(dá)時(shí)會接觸性抑制腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生,進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移,提高腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力,不利于患者預(yù)后[18-19]。本研究還發(fā)現(xiàn),乳腺癌組織中PKM2表達(dá)陽性率高于癌旁組織,而E-cadherin蛋白表達(dá)陽性率低于癌旁組織,提示乳腺癌組織中PKM2高表達(dá)、E-cadherin蛋白低表達(dá)與癌細(xì)胞的浸潤發(fā)展程度有關(guān),進(jìn)一步證實(shí)PKM2高表達(dá)、E-cadherin蛋白低表達(dá)會影響浸潤性乳腺癌患者的預(yù)后[20]。

有研究表明,當(dāng)E-cadherin蛋白水平降低時(shí)會加速乳腺癌細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移,不利于患者預(yù)后,E-cadherin蛋白水平升高時(shí)能增加細(xì)胞之間黏附,使腫瘤細(xì)胞聚集在原發(fā)灶周圍,發(fā)揮抑制作用,減少腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移,對患者預(yù)后較好[21]。PKM2水平升高時(shí)會加速糖代謝異常,進(jìn)而加快浸潤癌病程,對患者的預(yù)后不利[22]。本文研究結(jié)果顯示,預(yù)后不良組患者PKM2陽性率高于預(yù)后良好組,而E-cadherin蛋白陽性率低于預(yù)后良好組,提示PKM2陽性率和E-cadherin蛋白陽性率與乳腺癌患者的預(yù)后有關(guān)。同時(shí),本研究中對PKM2、E-cadherin蛋白的表達(dá)與患者預(yù)后情況作ROC曲線分析時(shí),二者AUC值均高于0.7,說明PKM2、E-cadherin蛋白對乳腺癌患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值較高,進(jìn)一步證實(shí)了上述研究結(jié)果。

綜上所述,乳腺癌患者腫瘤組織中PKM2、E-cadherin蛋白表達(dá)與患者的臨床病理存在一定聯(lián)系,對患者的預(yù)后有較高的預(yù)測價(jià)值。值得關(guān)注的是,樣本容量過小,且研究樣本均來自于同一個(gè)地區(qū)的醫(yī)院,今后的研究還將擴(kuò)大樣本容量,尋求在多個(gè)地區(qū)或多個(gè)中心開展工作,以獲取一個(gè)更具代表性的樣本,并進(jìn)行多變量分析以更好地控制潛在的混雜因子,并且對乳腺癌組織與癌旁組織中PKM2、E-cadherin蛋白表達(dá)的具體作用機(jī)制未做明確研究,有待后續(xù)繼續(xù)完善。