張傳津,牛華星,魏茂蓮,門曉東,張志民

(山東省飼料獸藥質量檢驗中心, 山東 濟南 250010)

鎮(zhèn)咳滌毒散收載于《獸藥質量標準》(2017年版)中藥卷,由10味藥材粉碎混合制得,具有清熱解毒,止咳平喘的功效,主要用于雞傳染性支氣管炎、雞傳染性喉氣管炎的輔助治療。現(xiàn)標準對方中麻黃、甘草、石膏、連翹、黃芩、黃連、穿心蓮7味藥材進行顯微鑒別;對黃連、麻黃進行了薄層鑒別;缺少對山豆根、蒲公英、板藍根的質量控制。為完善提升本產品質量標準,更好的對本產品實施質量控制,本試驗主要開展蒲公英的顯微鑒別及薄層色譜研究。結果表明,所建立的方法簡單高效、準確性高、重現(xiàn)性好,專屬性強。

1 鎮(zhèn)咳滌毒散中蒲公英鑒別儀器、材料與試藥

1.1 儀器

Olympus BX43 U-LHLEDC顯微圖像處理系統(tǒng);瑞氏卡瑪LINOMAT5型薄層自動點樣器、瑞氏卡瑪Visualizer薄層成像系統(tǒng);

1.2 材料與試藥

鎮(zhèn)咳滌毒散自制樣品,缺蒲公英自制陰性樣品,均為自制;蒲公英對照藥材(批號:121195-201503),中國食品藥品檢定研究院,咖啡酸對照品(批號:110885-200102),中國藥品生物制品檢定所;硅膠 G 薄層板 ,規(guī)格 10×20 cm,分別購自青島海洋化工有限公司(批號 20190622)和 MN 公司(批號 405127);所用試劑均為分析純,水為超純水。

2 鎮(zhèn)咳滌毒散中蒲公英鑒別方法與結果

2.1 鎮(zhèn)咳滌毒散中蒲公英顯微鑒別

2.1.1 藥材來源 本次實驗共收集蒲公英七批,分別來源于山東1批、河南4批、東北1批、甘肅1批。并將七批 蒲公英藥材分別粉碎成 粗粉,備用。

2.1.2 供試品制備 取本品少量,置載玻片上,攤平,選用水合氯醛試液,用酒精燈加熱至泡沸,反復2次,放冷后,蓋上蓋玻片,置顯微鏡下觀察。

2.1.3 結果 不同來源的蒲公英均具有如下共性顯微特征:(1)上下表皮細胞垂周壁波狀彎曲,表面角質紋理明顯或稀疏可見。氣孔不定式或不等式,副衛(wèi)細胞3～6個;(2)非腺毛3～9細胞,直徑17～34 μm,頂端細胞甚長,皺縮呈鞭狀或脫落;(3)葉肉細胞含細小草酸鈣結晶,多呈方形或短針狀,偏光顯微鏡下呈亮白色至多彩色。(4)花粉粒呈類球形,表面具脊狀突起,上有小刺;(5)多見網紋導管。顯微特征見圖1。

圖1 蒲公英的顯微鑒別

1.2號樣(5μL);2. 2號樣(2μL);3. 2號樣樣(1μL);4.咖啡酸對照;5.蒲公英對照藥材;6.蒲公英陰性樣品;7.3號樣(5μL);8.3號樣(2μL);9.3號樣(1μL)

1. 2號樣(5μL);2. 2號樣(2μL);3. 2號樣(1μL);4.蒲公英陰性樣品;5.咖啡酸對照;6蒲公英對照藥材.;7. 3號樣(5μL);8. 3號樣(2μL;9. 3號樣(1μL)

2.2 鎮(zhèn)咳滌毒散中蒲公英的薄層鑒別

2.2.1 供試品溶液的制備 取本品10 g(相當于蒲公英1.1 g),加甲醇30 mL,超聲處理30 min,濾過,濾液蒸干,殘渣加水10 mL使溶解,濾過,濾液用乙酸乙酯振搖提取2次,每次10 mL,合并乙酸乙酯液,蒸干,殘渣加甲醇1 mL使溶解,作為供試品溶液。

2.2.2 對照藥材和對照品溶液的制備 取蒲公英對照藥材1 g,照2.2.1項下制成對照藥材溶液。再取咖啡酸對照品,加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液,作為對照品溶液。

2.2.3 蒲公英陰性對照溶液的制備 取缺蒲公英陰性樣品10 g,照2.2.1項下的方法制備。

2.2.4 薄層鑒別 吸取上述四種溶液各1～5 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以乙酸丁酯-甲酸-水(7.0∶2.5 ∶2.5)的上層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(365 nm)下檢視。

2.2.5 結果 供試品色譜中,在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的熒光斑點。陰性對照無干擾。圖譜見圖6。

3 鎮(zhèn)咳滌毒散中蒲公英鑒別討論與結論

3.1 蒲公英顯微特征的確定

蒲公英植物為菊科蒲公英屬植物蒲公英、堿地蒲公英、東北蒲公英、異苞蒲公英、亞洲蒲公英、紅梗蒲公英等同屬多種植物的全草。4～5月開花前或剛開花時采挖。通過考察七批不同產地的蒲公英粉末顯微特征,較突出的顯微特征為表皮細胞、非腺毛、花粉粒、草酸鈣結晶,這與《中華人民共和國獸藥典》2020年版、《中藥大辭典》描述的顯微特征相同。但不同產地的蒲公英草酸鈣結晶數(shù)量、形態(tài)差異大(方形、針狀、簇晶狀、不規(guī)則多角形等),因此本制劑重點圍繞“花粉粒、非腺毛、表皮細胞”這三個顯微特征考察,確定蒲公英在此方中具有獨特顯微特征的是“花粉粒、非腺毛”。但來自山東、甘肅、河南的三批蒲公英花粉粒均少見,蒲公英(對照藥材)非腺毛、花粉粒均多見,應該是采收季節(jié)或產地對花粉粒的多少可能有影響。非腺毛主要分布葉上下表皮,皺縮呈鞭狀或脫落,極易脆斷,所以可能受產品的粒度影響大。綜上所述,“非腺毛,3～9細胞,直徑7～48μm,頂端細胞甚長,皺縮呈鞭狀或脫落”這組織特征明顯,易于檢出,陰性對照無干擾,適合作為鎮(zhèn)咳滌毒散方劑中蒲公英顯微特征。

3.2 蒲公英TLC實驗中點樣量的考察

在蒲公英的TLC實驗中,對不同的點樣量進行篩選,分別點樣5、2、1μL,結果顯示,點樣量為2～5μL時,斑點顔色清晰,大小適宜,分離度好。

3.3 蒲公英TLC實驗中展開劑的篩選

在蒲公英的TLC實驗中,對展開劑進行了篩選,分別選擇甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)和乙酸丁酯-甲酸-水(7.0∶2.5∶ 2.5)的上層溶液為展開劑,結果顯示,前者蒲公英陰性樣品在咖啡酸對照品位置上有干擾,而后者沒有,經過進一步的重復性試驗,該展開劑重現(xiàn)性良好,所以最后選擇乙酸丁酯-甲酸-水(7.0∶2.5∶2.5)的上層溶液為展開劑。

3.4 蒲公英TLC實驗中薄層板耐用性考察

以上實驗均用進口薄層板和國產薄層板進行了對比實驗,均達到較好的分離效果,說明本方法具有較好的耐用性。

3.5 蒲公英TLC實驗中對照的選擇

查閱蒲公英及其有關制劑質量研究文獻得知,蒲公英植物品種繁多,化學成份復雜,其中咖啡酸、綠原酸、菊苣酸、單咖啡酰酒石酸等是其主要質控指標成份。所以在開展的薄層鑒別研究中,我們參照《中華人民共和國獸藥典》2020年版,采用咖啡酸作對照,同時增加蒲公英對照藥材作對照,方法專屬性更強。

綜上所述,本研究通過顯微鑒別、薄層鑒別兩種方法控制鎮(zhèn)咳滌毒散蒲公英的質量,使標準更加完善,因為TCL法不僅能夠定性,還具有半定量的效果,從而更好地控制該產品的質量。