王艷花, 聶亞楠, 齊俊娟, 季艷霞

(1.河北省邯鄲市中心醫(yī)院, 河北 邯鄲 056000 2.河北省邯鄲市邯鋼醫(yī)院, 河北 邯鄲 056000)

胃癌(gastric cancer,GC)是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一,是我國第二大常見惡性腫瘤,也是導(dǎo)致惡性腫瘤患者死亡的第3大原因。胃癌發(fā)病隱匿,我國胃癌早期檢出率較低,多數(shù)患者確診時已為中晚期,導(dǎo)致患者5年內(nèi)生存率低于20%,對人們的生命健康造成嚴重的威脅。miRNA可調(diào)控多種腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。miR-21是miRNA家族成員之一,有研究表明,miR-21在胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等多種實質(zhì)瘤中異常高表達,其可通過參與腫瘤細胞的增殖和分化等影響腫瘤的生長和侵襲等。第10染色體同源丟失性磷酸酶及張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)是近年來研究較廣泛的抑癌基因之一,其下調(diào)可促進胃癌、肺癌等多種腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展[1-2]。有研究顯示,miR-21可靶向調(diào)控第PTEN的表達,進而對肝癌細胞凋亡發(fā)揮促進作用,但在胃癌中的調(diào)控作用報道較少[3]。1,2-棕櫚酰磷酯酰肌醇-3-磷酸(1,2-palmitoyl phosphory1 inositol-3-hosphate,PI3P)是PTEN的底物,也是磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase,PI3K)的產(chǎn)物,PI3P可通過激活蛋白激酶B(Serine/throenine protein kinase,AKT介導(dǎo)信號通路下游的信號分子的激活,進而介導(dǎo)細胞的增殖、分化、凋亡等活性[4]。細胞中PTEN丟失,會通過累積PI3P持續(xù)活化AKT,通過激活PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路抑制細胞凋亡,刺激細胞增殖,促進腫瘤發(fā)展。叉頭框蛋白O1(forkhead box protein O1,FoxO1)是PI3K/AKT信號通路的下游靶基因,其可通過調(diào)控下游靶基因的表達抑制細胞生長、促進細胞凋亡、調(diào)控細胞周期等[5]。研究發(fā)現(xiàn),PI3K/AKT信號通路可負向調(diào)控FoxO1表達,FoxO1可作為一種抑癌基因參與多種腫瘤發(fā)展進程[6]。但AKT/FoxO1信號能否成為miR-21靶向PTEN調(diào)控胃癌細胞活性的機制尚不明確,本研究旨在探究miR-21靶向PTEN調(diào)控胃癌細胞凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器:人正常胃黏膜上皮細胞GES-1和胃癌細胞系SGC-7901(中國科學(xué)院細胞庫);miR-21 inhibitors質(zhì)粒及其陰性對照(miR-NC inhibitors)質(zhì)粒,sh-PTEN質(zhì)粒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司);LipofectamineTM2000(上海鈺博生物技術(shù)有限公司);CCK-8檢測試劑盒(美國Sigma公司);Transwell小室(美國BD公司);AKT、p-AKT、PTEN、FoxO1、PI3K、p-PI3K抗體(美國Santa Cruz公司);酶標(biāo)儀(型號:Elx800,美國伯樂公司);流式細胞儀(美國BD公司);光學(xué)顯微鏡(型號:CX23,日本OLYMPUS公司);qRT-PCR儀(型號:7700型,美國Applied Biosystems公司);超低溫冰箱(型號:MDF-38,三洋公司)。

1.2細胞培養(yǎng):將人正常胃黏膜上皮細胞GES-1和胃癌細胞系SGC-7901接種于培養(yǎng)瓶中,將含10%胎牛血清和輕-鏈霉素雙抗的完全培養(yǎng)基加入到細胞中,將培養(yǎng)瓶置于常規(guī)培養(yǎng)箱,設(shè)置條件為37℃、5%CO2。傳代換液,48h一次,取處于對數(shù)期的細胞用于實驗。

1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和分組:按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書,分別將100nM的miR-NC inhibitors、miR-21 inhibitors轉(zhuǎn)染至SGC-7901細胞中,設(shè)為miR-NC inhibitors組和miR-21 inhibitors組;將miR-21 inhibitors和sh-PTEN同時轉(zhuǎn)染至SGC-7901細胞中設(shè)為miR-21 inhibitors+sh-PTEN組;將不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的SGC-7901細胞設(shè)為Control組。轉(zhuǎn)染24h后進行后續(xù)實驗。

1.4qRT-PCR檢測細胞中miR-21 mRNA表達:取培養(yǎng)好的細胞,加入TRIzol裂解液裂解,提取裂解后細胞和組織中總RNA,提取步驟按照試劑盒說明書進行。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cFNA。瞬時離心各引物(引物序列見表1),在引物中加入去離子水并制成100μmoL/L的液體,稀釋引物終濃度為10μmoL/L。按照以下條件擴增引物,預(yù)變性95℃ 5min;變性95℃ 10s;退火60℃ 20s;延伸72℃ 10min;共30個循環(huán)。用2-△△CT法分析表達量。

表1 引物序列表

1.5CCK-8檢測細胞增殖能力:取對數(shù)生長的SGC-7901細胞,調(diào)整細胞密度為1×104個/mL,在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)孔板48h;后將100μL的CCK-8溶液加入到96孔板中,在上述相同條件下培養(yǎng)孔板1.5h;將孔板置于酶標(biāo)儀450nm處,檢測細胞OD值。

1.6Transwell小室法檢測細胞侵襲能力:取對數(shù)生長的SGC-7901細胞,胰蛋白酶裂解細胞為懸液,將細胞密度調(diào)整為1.5×104個/mL。在Transwell上室中平鋪Matrigel膠,紫外線照射消毒;后將200μL細胞懸液加入到下室中,共孵育Transwell小室24h。輕輕擦掉上室中殘留的Matrigel膠,后將Transwell小室完全置于甲醛溶液中固定,10min后在上室中加入0.1%結(jié)晶紫,染色10min,清洗小室并置于顯微鏡下,觀察個組細胞的侵襲數(shù)。

1.7流式細胞儀檢測細胞凋亡:將對數(shù)生長的SGC-7901細胞密度調(diào)整為1.5×104個/mL,接種細胞于96孔板中培養(yǎng)24h;分別將1× binding buffer,10 μL annexin V和20 μL PI加入到96孔板中;棄掉原有的培養(yǎng)基,加入配制好的Annexin V/PI 染色工作液,于常規(guī)培養(yǎng)箱孵育孔板。在孔板中加入胰蛋白酶裂解,離心機裂解后的細胞懸液,收集上清液,檢測各組細胞凋亡率。

1.8蛋白質(zhì)印跡檢測細胞中PTEN、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、FoxO1蛋白表達:取對數(shù)生長的SGC-7901細胞,胰蛋白酶裂解細胞為懸液,用BCA法檢測總蛋白濃度。將蛋白溶液的終濃度配制為2μg/mL,將蛋白溶液置于熱水中煮沸10min,后保存在-20℃冰箱中。取50μg蛋白樣品與上樣緩沖液混勻,沸水煮沸變性,取定量變性蛋白樣本上樣進行SDS-PAGE分離,轉(zhuǎn)移上樣至PVDF膜上,后加入5%脫脂牛奶封閉1h;用含1mL/L吐溫的Tris緩沖鹽溶液(TBST)洗膜,加入一抗PTEN、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、FoxO1(1∶500),在4℃環(huán)境中孵育過夜;將PVDF膜沖洗干凈后加入二抗(1∶1000),在室溫環(huán)境中孵育2h。在細胞中加入ECL放光液,曝光顯影后用Image Lab軟件分析條帶灰度值。

1.9雙熒光素酶報告基因技術(shù):通過TargetScan7.2軟件預(yù)測miR-21于PTEN 3'-URT結(jié)合的靶位點序列,設(shè)計并合成野生型(WT)PTEN 3'-URT和突變型(MUT)PTEN 3'-URT質(zhì)粒載體。取對數(shù)生長的胃癌SGC-7901細胞,以1×105個/孔密度接種于24孔板內(nèi),在37℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng),根據(jù)Lipofactamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將miR-21 mimics或陰性對照聯(lián)合構(gòu)建好的野生型或突變型PTEN 3'-URT質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)染到SGC-7901細胞,培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h,PBS沖洗后裂解細胞,檢測細胞熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1細胞中miR-21表達比較:和人正常胃黏膜上皮細胞GES-1(1.00±0.10)相比,胃癌細胞SGC-7901中miR-21(1.89±0.17)表達明顯升高(t=11.05,P<0.0001)。和Control組(1.89±0.17)相比,miR-21 inhibitors組(0.83±0.10)細胞中miR-21表達明顯降低(t=13.16,P<0.0001);Control組和miR-NC inhibitors組(1.80±0.15)細胞中miR-21表達相比無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.9724,P=0.3538)(圖1)。

圖1 細胞中miR-21表達比較

2.2敲減miR-21可抑制胃癌SGC-7901細胞增殖、侵襲能力,促進細胞凋亡:和Control組相比,miR-21 inhibitors組細胞增殖率(45.31±4.92)和侵襲細胞數(shù)(62.34±5.83)明顯降低,細胞凋亡率(23.48±3.51)明顯增加(t增殖率=12.02,t侵襲細胞數(shù)=12.93,t凋亡率=12.07,P<0.0001);Control組細胞增殖率(100.00±10.00)、侵襲細胞數(shù)(135.81±12.64)、凋亡能力(5.42±1.06)和miR-NC inhibitor組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(t增殖率=0.2429,P=0.8130;t侵襲細胞數(shù)=0.6881,P=0.5071;t凋亡率=0.6827,P=0.5103)(圖2)。

圖2 敲減miR-21可抑制胃癌SGC-7901細胞增殖、侵襲能力,促進細胞凋亡

2.3敲減miR-21增加細胞中PTEN、FoxO1蛋白表達,抑制p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值:miR-21 inhibitors組細胞中PTEN(0.98±0.10)和FoxO1(0.76±0.08)蛋白表達高于Control組,p-PI3K/PI3K(0.42±0.05)、p-AKT/AKT(0.51±0.05)比值低于Control組(tPTEN=17.60,tFoxO1=12.32,tp-PI3K/PI3K=10.23,tp-AKT/AKT=7.613,P<0.0001);Control組和miR-NC inhibitors組細胞中PTEN(0.25±0.03)和FoxO1(0.30±0.04)蛋白表達及p-PI3K/PI3K(0.83±0.09)、p-AKT/AKT(0.80±0.08)比值相比無統(tǒng)計學(xué)意義(tPTEN=1.155,P=0.2751;tFoxO1=0.4330,P=0.6742;tp-PI3K/PI3K=0.3849,P=0.7084;tp-AKT/AKT=0.5553,P=0.6103)(圖3)。

圖3 敲減miR-21增加細胞中PTEN、FoxO1蛋白表達,抑制p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值

2.4過表達PTEN可抑制胃癌細胞增殖和侵襲,促進凋亡,增加細胞中PTEN、FoxO1蛋白表達,抑制p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值:和pcDNA-NC組相比,pcDNA-PTEN組細胞增殖率(48.26±5.01)、侵襲細胞數(shù)(65.37±6.02)個和細胞中p-PI3K/PI3K(0.46±0.05)、p-AKT/AKT(0.55±0.06)比值均明顯降低,細胞凋亡率(25.61±3.27)%及細胞中PTEN(0.91±0.09)和FoxO1(0.70±0.08)蛋白表達升高(t增值率=11.24,t侵襲細胞數(shù)=12.41,tp-PI3K/PI3K=9.041,tp-AKT/AKT=6.369,t凋亡率=14.45,tPTEN=15.17,tFoxO1=11.75,P<0.0001)(圖4)。

圖4 過表達PTEN可抑制胃癌細胞增殖和侵襲,促進凋亡,增加細胞中PTEN、FoxO1蛋白表達,抑制p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值

2.5miR-21靶向調(diào)控PTEN:預(yù)測發(fā)現(xiàn)PTEN的3'UTR端與miR-21有堿基互補結(jié)合點位(圖5A)。和miR-NC組(1.00±0.10)相比,轉(zhuǎn)染野生型PTEN(PTEN-WT)時miR-21組(0.32±0.03)熒光素酶活性明顯降低(t=15.95,,P<0.0001);向細胞中轉(zhuǎn)染突變型PTEN(PTEN-WT)時,miR-NC組(0.98±0.10)和miR-21組(1.00±0.09)熒光素酶活性相比無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.3641,P=0.7233)(圖5B)。

圖5 miR-21可靶向調(diào)控PTEN

2.6敲減miR-21靶向PTEN調(diào)控胃癌細胞活性及PI3K/AKT/FoxO1信號通路:和miR-21 inhibitors組相比,miR-21 inhibitors+sh-PTEN組細胞增殖率(90.25±9.14)%和侵襲細胞數(shù)(125.69±10.31)明顯增加,細胞凋亡率(6.24±1.32)%明顯降低,細胞中PTEN(0.30±0.01)和FoxO1蛋白(0.38±0.05)表達降低,細胞中p-PI3K/PI3K(0.80±0.08)、p-AKT/AKT(0.76±0.08)比值增加(t增值率=10.60,t侵襲細胞數(shù)=13.10,t凋亡率=11.26,tPTEN=15.47,tFoxO1=9.867,tp-PI3K/PI3K=9.867,tp-AKT/AKT=6.491,P<0.0001)(圖6)。

圖6 敲減miR-21靶向PTEN調(diào)控胃癌細胞活性及PI3K/AKT/FoxO1信號通路

3 討 論

胃癌是具有較高死亡率和發(fā)病率的惡性腫瘤之一,對患者的生命健康造成嚴重的威脅。研究發(fā)現(xiàn),胃癌早期患者治療后的生存率超過90%,而胃癌晚期患者在治療后的生存率不足10%[7]。因此探究胃癌的發(fā)病機制和腫瘤標(biāo)志物對臨床治療有重要意義。研究發(fā)現(xiàn),miRNA可通過調(diào)控靶mRNA的降解或翻譯抑制參與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展,如胃癌、肺癌等。miR-21是人類腫瘤密切相關(guān)的miRNA之一,有研究發(fā)現(xiàn),胃癌患者血清中miR-21水平和腫瘤大小呈正相關(guān)[8]。miR-21在肺癌A549細胞中高表達,抑制miR-21表達可抑制肺癌細胞增殖和侵襲。本研究通過體外培養(yǎng)胃癌SGC-7901細胞,給予低表達miR-21發(fā)現(xiàn),敲減miR-21表達可對胃癌細胞增殖和侵襲能力發(fā)揮抑制作用,對胃癌細胞凋亡發(fā)揮促進作用,本研究結(jié)果和上述研究結(jié)果一致。

PTEN近年來發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因,在人體多種組織中廣泛表達,其可介導(dǎo)細胞的生長、凋亡、黏附、侵襲和遷移等。有研究表明,PTEN蛋白的丟失可介導(dǎo)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展,和癌旁組織相比,胃癌組織中PTEN呈低表達[9]。Qiu等[10]研究發(fā)現(xiàn),PTEN蛋白表達會隨著食管癌惡性程度的上升而降低,進而對細胞的增殖和侵襲發(fā)揮促進作用。本研究通過向胃癌細胞中轉(zhuǎn)染過表達PTEN發(fā)現(xiàn),pcDNA-PTEN組細胞增殖和侵襲能力明顯降低,細胞凋亡能力明顯增加,提示PTEN在胃癌細胞中可發(fā)揮抑癌作用。有研究發(fā)現(xiàn),PTEN是AKT的負性調(diào)節(jié)器,PTEN可通過拮抗PI3K的作用負向調(diào)控PI3K/AKT信號通路活性[11]。PI3K/AKT是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵信號通路,其可介導(dǎo)多種腫瘤的生物學(xué)活性,如增殖、侵襲、凋亡等。FoxO1是AKT信號通路中下游的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子之一,其可對惡性腫瘤的形成和細胞增殖發(fā)揮抑制作用,還和細胞的新陳代謝、分裂分化等密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,pcDNA-PTEN組細胞中PTEN和FoxO1蛋白表達增加,胃癌細胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值降低,提示過表達PTEN可抑制胃癌細胞中PI3K/AKT信號通路,促進FoxO1蛋白表達。Qiu等[12]研究證實,PTEN可抑制胃癌細胞PI3K和AKT的磷酸化表達,進而參與調(diào)控胃癌細胞的增殖、侵襲和凋亡。研究證實,通過調(diào)控AKT/FoxO1信號通路凋亡相關(guān)因子的釋放能對胃癌細胞的凋亡發(fā)揮促進作用。

為探究miR-21對胃癌細胞生物學(xué)活性的調(diào)控機制,本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測了miR-21與PTEN的3'-URT存在相互結(jié)合位點。敲減miR-21表達可增加胃癌細胞中PTEN和FoxO1蛋白表達,抑制胃癌細胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值。因此猜測miR-21可能靶向調(diào)控PTEN,調(diào)節(jié)AKT/FoxO1信號抑制胃癌細胞增殖和侵襲,促進凋亡。為了證實這一猜想,本研究將miR-21 inhibitors和sh-PTEN共同轉(zhuǎn)染至胃癌細胞中,結(jié)果顯示,miR-21 inhibitors+sh-PTEN細胞增殖和侵襲能力明顯增加,細胞凋亡率明顯降低,且細胞中PTEN和FoxO1蛋白表達降低,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值增加,提示抑制PTEN表達可減弱敲減miR-21對胃癌細胞增殖、侵襲能力的抑制作用及對凋亡能力的促進作用。

綜上所述,miR-21負向調(diào)控PTEN表達,敲減miR-21可靶向PTEN調(diào)控AKT/FoxO1信號通路,進而對胃癌細胞增殖和侵襲發(fā)揮抑制作用,對胃癌細胞凋亡發(fā)揮促進作用。