陸 勤, 張婷婷, 陳明治

(江蘇省宜興市人民醫(yī)院/江蘇大學(xué)附屬宜興醫(yī)院, 江蘇 宜興 214200)

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見且最致命的惡性腫瘤之一[1],全球每年新增病例約220萬例,死亡人數(shù)約為180萬人,中國新發(fā)病例占其中1/3[2]。值得關(guān)注的是,在中國最常見的10種癌癥中,肺癌的5年存活率最低。目前,肺癌的死亡率持續(xù)上升,已嚴(yán)重威脅公共健康。生長停滯特異性蛋白6(Growth arrest specific protein 6,Gas6)/Mer原癌基因酪氨酸酶(Mer Protooncogene tyrosinase,MerTK)通路在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用[3],深入研究該通路在肺癌中的機(jī)制,可能為肺癌的治療提供新的策略。在不同的腫瘤病變中,線粒體自噬的作用不同。既往研究表明,自噬可能在肺癌的發(fā)展過程以及治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。然而,Gas6/MerTK信號(hào)通路是否可通過調(diào)控肺癌細(xì)胞中的線粒體自噬從而影響肺癌的發(fā)生發(fā)展,尚未闡明。本研究利用Calu-1和A-427兩種肺癌細(xì)胞系,通過加入AVB-500抑制Gas6的表達(dá),進(jìn)而加入自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)探究Gas6/MerTK信號(hào)對(duì)肺癌細(xì)胞線粒體自噬及肺癌進(jìn)展的影響。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器:Gas6抗體(美國Sigma-Aldrich)、MerTK抗體(英國abcam公司)、LC3Ⅱ抗體(美國CST公司)、Beclin1抗體、GAPDH抗體(美國Affinity生物技術(shù)公司)、AVB-500、雷帕霉素(上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司)、CCK-8試劑盒(北京愛思力克科技有限公司)、熒光倒置顯微鏡(德國Leica公司)、酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)分組與方法

1.2.1分組和干預(yù):培養(yǎng)Calu-1與A-427細(xì)胞系,根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組:(1)對(duì)照組、Gas6干預(yù)組(25μmoL/L AVB-500干預(yù)24h);(2)對(duì)照組、雷帕霉素(RAPA,10μmoL/L干預(yù)24h)組;各組均設(shè)置6個(gè)重復(fù)樣本。

1.2.2Western blotting 檢測肺癌細(xì)胞中Gas6、MerTK、LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表達(dá)水平:收集干預(yù)各組Calu-1與A-427細(xì)胞,根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入細(xì)胞裂解液,渦旋震蕩后置于冰上靜置,再離心5min,靜置15min,上清液即為蛋白液,將蛋白原液分裝,在100℃金屬浴中進(jìn)行蛋白變性,配制上樣體系和合適濃度的凝膠,向各個(gè)膠塊孔道中加入相同質(zhì)量的樣品進(jìn)行電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,在4℃冰箱中分別孵育Gas6抗體(1∶1000)、MerTK抗體(1∶1000)、LC3Ⅱ抗體(1∶1000)、Beclin1抗體(1∶1000)、室溫孵育二抗(1∶5000)、每個(gè)間隙均使用PBST清洗10min,重復(fù)3次,最后將條帶用發(fā)光液均勻浸沒曝光,并用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3透射電鏡檢測Calu-1與A-427細(xì)胞自噬小體:收集干預(yù)各組Calu-1與A-427細(xì)胞,加入2.5%戊二醛避光固定30min,離心去上清加入1%瓊脂糖溶液懸浮細(xì)胞,加入1%鋨酸避光固定細(xì)胞,每個(gè)間隙均用磷酸緩沖液漂洗。將各組Calu-1與A-427細(xì)胞在上行梯度酒精中脫水,在37℃培養(yǎng)箱中使用丙酮和812包埋劑混合劑處理2h,將包埋板烘烤48h,將樹脂塊超波切片。使用2%醋酸鈾飽避光染色8min,枸櫞酸鉛溶液染色8min,各個(gè)間隙使用去離子水清洗,干燥過夜。透射電鏡觀察各組細(xì)胞自噬小體。

1.2.4平板克隆檢測Calu-1與A-427細(xì)胞增殖能力:將Calu-1與A-427細(xì)胞接種到6孔板,分組干預(yù)并培養(yǎng)至克隆團(tuán)數(shù)量超過50個(gè),PBS清洗,加入甲醛溶液處理15min后棄去甲醛溶液,使用結(jié)晶紫染色克隆團(tuán)10min,清洗染色液,最后拍照并用ImageJ軟件計(jì)數(shù)。

1.2.5CCK-8檢測Calu-1與A-427細(xì)胞活力:將Calu-1與A-427細(xì)胞接種到96孔板中,培養(yǎng)一定時(shí)間,對(duì)照組不進(jìn)行處理,Gas6干預(yù)組和RAPA組細(xì)胞干預(yù)24h后,將各組分別在0h、24h、48h、72h內(nèi)加入CCK-8溶液,培養(yǎng)2h,待酶標(biāo)儀溫度升至37℃檢測各孔OD值,最后計(jì)算各組細(xì)胞活力。

1.2.6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測Calu-1與A-427細(xì)胞遷移能力:將Calu-1與A-427細(xì)胞接種到6孔板,分組干預(yù)后待細(xì)胞長至85%,用20μL的滅菌槍頭在各孔正中央劃一條直線,培養(yǎng)至0h和24h取出后用PBS清洗,分別在顯微鏡下拍照記錄,培養(yǎng)至0h觀察后的細(xì)胞加入新鮮培養(yǎng)基(無血清)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至24h,使用ImageJ測量遷移距離。

1.2.7免疫熒光染色檢測Calu-1與A-427中LC3表達(dá)情況:將Calu-1與A-427細(xì)胞接種到12孔板,分組干預(yù)后待細(xì)胞長滿后用PBS清洗,棄去PBS,多聚甲醛固定肺癌細(xì)胞處理25min,加入配置的0.5%TritonX-100處理5min,加入配套的封閉液處理30min,PBS清洗后,加入LC3抗體(1∶200)在4℃冰箱中孵育過夜,次日,PBS清洗后,加入對(duì)應(yīng)的二抗(1∶50)避光孵育,使用DAPI染細(xì)胞核8min,最后在黑暗的環(huán)境中使用熒光顯微鏡觀察拍照。

2 結(jié) 果

2.1抑制Gas6對(duì)肺癌細(xì)胞Gas6、MerTK 的蛋白水平的影響:與對(duì)照組相比,Gas6干預(yù)組Calu-1細(xì)胞Gas6(F=17.34,P<0.05)、MerTK(F=13.86,P<0.05)與A-427細(xì)胞Gas6(F=19.01,P<0.05)、MerTK(F=8.31,P<0.05)蛋白水平顯著降低(圖1)。

圖1 Calu-1細(xì)胞與A-427細(xì)胞中Gas6、MerTK的蛋白表達(dá)水平

圖2 Calu-1細(xì)胞與A-427細(xì)胞自噬水平

圖3 Calu-1細(xì)胞與A-427細(xì)胞克隆、活性、遷移能力

圖4 誘導(dǎo)自噬對(duì)Calu-1細(xì)胞與A-427細(xì)胞克隆、增殖、遷移能力

2.2抑制Gas6對(duì)肺癌細(xì)胞線粒體自噬能力的影響:與對(duì)照組相比,Gas6干預(yù)組Calu-1細(xì)胞LC3Ⅱ(F=7.55,P<0.05)、Beclin1(F=9.03,P<0.05)與A-427細(xì)胞LC3Ⅱ(F=7.80,P<0.05)、Beclin1(F=8.87,P<0.05)的蛋白水平顯著增加(圖2A-B),且Calu-1細(xì)胞與A-427細(xì)胞中自噬小體形成,大量自噬空泡聚集(圖2C)。

2.3抑制GAS6對(duì)肺癌細(xì)胞克隆、活性、遷移的影響:與對(duì)照組相比,Gas6干預(yù)組Calu-1細(xì)胞克隆能力顯著降低(圖3A-B,F=6.23,P<0.05)、細(xì)胞活力顯著降低(圖3C,F=3.68,P<0.05)、細(xì)胞遷移距離顯著減少(圖3D-E,F=19.60,P<0.05)。A-427細(xì)胞細(xì)胞克隆能力顯著降低(圖3A-B,F=10.28,P<0.05)、細(xì)胞活力顯著降低(圖3C,F=3.79,P<0.05)、細(xì)胞遷移距離顯著減少(圖3D-E,F=11.62,P<0.05)。

2.4誘導(dǎo)線粒體自噬對(duì)肺癌細(xì)胞克隆、活性、遷移的影響:與對(duì)照組相比,Calu-1細(xì)胞中,RAPA組LC3蛋白表達(dá)增加(F=6.43,P<0.05)、Cas6干擾組的LC3蛋白表達(dá)增加(F=8.71,P<0.05),A-427細(xì)胞中RAPA組LC3蛋白表達(dá)增加(F=7.84,P<0.05),Cas6干擾組的LC3蛋白表達(dá)增加(圖4A,F=8.26,P<0.05);與對(duì)照組相比,Calu-1細(xì)胞中RAPA組細(xì)胞克隆能力顯著降低(圖4B,F=7.90,P<0.05)、細(xì)胞活力顯著降低(圖4C,F=3.02,P<0.05)、細(xì)胞遷移距離顯著減少(圖4D-E,F=10.47,P<0.05),A-427細(xì)胞細(xì)胞克隆能力顯著降低(圖4B,F=9.26,P<0.05)、細(xì)胞活力顯著降低(圖4C,F=3.46,P<0.05)、細(xì)胞遷移距離顯著減少(圖4D-E,F=12.25,P<0.05)。

3 討 論

肺癌是北美和其他發(fā)達(dá)國家癌癥相關(guān)死亡疾病的首要原因,通常晚期才被診斷出[5],且只有不到7%的患者在診斷后存活達(dá)到10年[6]。目前仍缺乏有效的治療藥物,這提醒我們需要更深入了解導(dǎo)致肺癌進(jìn)展的可能影響機(jī)制。Gas6是一種維生素K依賴性分泌蛋白,參與自身免疫性疾病、腫瘤、血栓性疾病、病毒感染等疾病的過程[7-8]。Gas6在肺、腫瘤組織、心臟等組織中高表達(dá),可與其受體Axl、Tyro3和MerTK結(jié)合,調(diào)控下游信號(hào)通路從而影響腫瘤的生長、遷移[9-10]。MerTK在人類多種癌組織中高表達(dá),臨床試驗(yàn)顯示以MerTK為干預(yù)點(diǎn)的療法可能具有抗癌效果[11]。既往研究顯示,干預(yù)Gas6/MerTK信號(hào)通路,在抗癌中發(fā)揮有效作用。值得關(guān)注的是,Gas6/MerTK通路在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用[3],因此,深入研究其涉及的更多可能分子機(jī)制或許可為臨床攻克肺癌這一大難題提供新的線索。

線粒體自噬是細(xì)胞利用溶酶體酶特異性清除損傷或多余線粒體的過程,在肺癌細(xì)胞的增殖、遷移中發(fā)揮重要作用[12]。謝利等[13]研究發(fā)現(xiàn),沉默Gas6可調(diào)控自噬參與石英塵小鼠的肺部炎癥損傷。高雅婷等[14]研究顯示,芪玉三龍湯可上調(diào)Beclin1、LC3的蛋白表達(dá),促進(jìn)LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化,從而誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬。這提示肺癌病變機(jī)制中可能也存在Gas6調(diào)控自噬過程。本研究通過選用人肺癌細(xì)胞系Calu-1與A-427進(jìn)行研究,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,肺癌細(xì)胞中Gas6、MerTK蛋白高表達(dá),通過抑制Gas6蛋白表達(dá),上述蛋白表達(dá)下降的同時(shí)線粒體自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、Beclin1蛋白水平增加,肺癌細(xì)胞胞質(zhì)中可見自噬空泡聚集,肺癌細(xì)胞的克隆能力下降、細(xì)胞活力降低、細(xì)胞遷移相對(duì)距離減少。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Gas6/MerTK信號(hào)通路與線粒體自噬在肺癌細(xì)胞中的作用機(jī)制,我們使用自噬誘導(dǎo)劑RAPA進(jìn)行研究,結(jié)果顯示肺癌細(xì)胞中LC3表達(dá)增加,細(xì)胞克隆能力下降、細(xì)胞活力降低、細(xì)胞遷移相對(duì)距離減少。

綜上所述,Gas6/MerTK信號(hào)通路與線粒體自噬在肺癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用,下調(diào)Gas6/MerTK信號(hào)通路可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞線粒體自噬,使肺癌細(xì)胞增殖、遷移能力下降。然而,本研究選用的是肺癌細(xì)胞系,若是收集臨床肺癌標(biāo)本、提取原代肺癌細(xì)胞或許能更具有說服力。此外,本研究只是初步探究了在肺癌細(xì)胞中Gas6/MerTK信號(hào)通路與線粒體自噬可能關(guān)系,關(guān)于二者之前可能存在的具體機(jī)制仍有待研究。