范 映 辰, 于 曼 曼, 倪 眾, 周 大 勇,3,4, 劉 玉 欣,3,4

( 1.大連工業(yè)大學 食品學院, 遼寧 大連 116034;2.安徽農(nóng)業(yè)大學 茶與食品科技學院, 安徽 合肥 230036;3.大連工業(yè)大學 國家海洋食品工程技術(shù)研究中心, 遼寧 大連 116034;4.大連工業(yè)大學 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

鮑魚內(nèi)收肌(腹足)是鮑魚的可食用部分,蛋白質(zhì)含量豐富,主要由肌原纖維蛋白(myofibrillar proteins,MPs)和膠原蛋白組成,兩者的緊密結(jié)合使其具有獨特的質(zhì)地特性[1]。在加工貯藏過程中,二者的相對含量和物理化學性質(zhì)的變化與鮑魚內(nèi)收肌的質(zhì)構(gòu)特性密切相關(guān)[2]。

新鮮魚類、貝類等水產(chǎn)品在捕撈后的儲運過程中,很容易因內(nèi)源酶作用而變質(zhì)[3]。貝類中廣泛存在天冬氨酸蛋白酶(AP)、半胱氨酸蛋白酶(CP)、絲氨酸蛋白酶(SP)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)等內(nèi)源性蛋白酶,且在低溫下仍具有活性,它們可以通過水解肌肉蛋白導致貝類軟化[4]。近年來,相關(guān)研究主要集中于魚類、扇貝等水產(chǎn)肌肉食品,而對于鮑魚研究較少。鮑魚的肌原纖維和肌漿部分都存在降解肌原纖維的SP和MMP,而AP和CP存在于溶酶體中,通常在較低的pH下發(fā)揮作用[5]。因此,控制內(nèi)源性蛋白酶對鮑魚蛋白質(zhì)的降解作用是保持貯藏過程品質(zhì)的關(guān)鍵。

以鮑魚腹足內(nèi)收肌為研究對象,使用半胱氨酸蛋白酶抑制劑,反式環(huán)氧丁二酰-L-亮氨酸氨基(4-胍基諾)丁烷(E-64)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑,1,10-菲羅啉水合物(1,10-phe)和絲氨酸蛋白酶抑制劑,苯基甲基磺酰氟(PMSF)等3種蛋白酶抑制劑處理鮑魚,測定鮑魚冷藏過程中持水能力、結(jié)構(gòu)蛋白、微觀結(jié)構(gòu)及質(zhì)構(gòu)的變化及內(nèi)源酶抑制劑處理對指標的影響,以期揭示內(nèi)源酶對冷藏鮑魚質(zhì)構(gòu)特性的影響規(guī)律和機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮皺紋盤鮑,購于大連市甘井子區(qū)仟和市場。E-64、1,10-phe和PMSF(蛋白酶抑制劑為生化試劑,僅為實驗用途,不可用于水產(chǎn)品保鮮),美國Sigma-Aldrich公司;Bradford蛋白試劑盒,南京建成生物技術(shù)有限公司;TA.XT.PLUS型質(zhì)構(gòu)儀,英國Stable Micro System公司;JSM-7800F掃描電鏡儀,日本東京電子株式會社。

1.2 方 法

1.2.1 原料預處理

鮑魚快速脫殼后置于冰上放血1 h,在4 ℃下含有0.1 mmol/L E-64、0.1 mmol/L 1,10-phe和1.0 mmol/L PMSF的混合酶抑制劑溶液(E組)中浸泡2 h,水溶液作為空白對照組(C組)。另取一部分放血后的新鮮鮑魚作為新鮮組(F組)。所有樣品在4 ℃貯存1、3、5 d后,取用內(nèi)收肌部分,并在采樣當天立即對質(zhì)構(gòu)特性、微觀結(jié)構(gòu)和持水能力進行檢測。其余樣品儲存在-30 ℃冰箱中,并在2周內(nèi)分析其余指標。

1.2.2 鮑魚的水分含量及持水力測定

水分含量通過直接干燥法測定[6]。稱取2～3 g樣品放在稱量瓶中,在105 ℃干燥箱中恒重4 h后取出,置于干燥器中冷卻0.5 h。鮑魚水分質(zhì)量分數(shù)(w)通過恒重前后鮑魚的質(zhì)量差進行計算。

樣品的持水力通過高速離心法測定[7]。取4 g樣品準確稱重(m1),用3層濾紙包裹并置于離心管中,在4 ℃、13 500g離心20 min。離心后取出包裹的濾紙并稱量內(nèi)收肌質(zhì)量(m2)。計算鮑魚的持水力。

1.2.3 鮑魚肌原纖維蛋白的變化

1.2.3.1 肌原纖維蛋白提取

肌原纖維蛋白根據(jù)文獻[8]的方法提取,稍做修改。取10 g樣品與30 mL、10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0,0.1 mmol/L NaCl,2 mmol/L MgCl2和1 mmol/L EDTA)在冰浴中勻漿,4 ℃、5 000g離心棄上清,重復2次。沉淀用3倍體積0.1 mol/L NaCl均質(zhì),并用4層紗布過濾以去除膠原結(jié)締組織和大分子聚集物,濾液于4 ℃、5 000g離心15 min,重復2次,收集沉淀即為鮑魚肌原纖維蛋白。

1.2.3.2 肌原纖維蛋白溶解性測定

1 g肌原纖維蛋白和100 mL 0.6 mol/L NaCl在冰浴中勻漿,4 ℃下保持2 h。5 000g離心4 min后收集上清液。用雙縮脲法測定上清液蛋白質(zhì)量分數(shù)[9]。MP溶解度表示為總蛋白質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)。

1.2.4 水溶性組分分析

將樣品和蒸餾水以質(zhì)量體積比1∶3在冰浴中均質(zhì),4 ℃、13 500g離心20 min,收集上清液為水溶性組分。

1.2.4.1 TCA-可溶性寡肽的測定

參考Yvon等[10]的方法測定TCA-可溶性寡肽含量。將6 g樣品和6 mL 20% TCA溶液在冰上勻漿,靜置20 min后4 ℃、10 000g離心10 min。上清液中TCA-可溶性寡肽含量采用Folin-酚法進行測定。

1.2.4.2 水溶性羥脯氨酸的測定

采用酸水解法測定鮑魚和水溶性組分中的羥脯氨酸。準確稱取水溶性組分0.5 g或鮑魚樣品0.2 g置于安瓿瓶中,加3 mL 6 mol/L HCl,135 ℃下水解4 h。測定560 nm吸光度,用L-羥脯氨酸作標準品繪制標準曲線,根據(jù)GB/T 9695.23—2008計算水溶性羥脯氨酸含量。

1.2.4.3 水溶性糖胺聚糖的測定

根據(jù)1,9-二甲基亞甲藍法[11]測定水溶性組分中糖胺聚糖含量。1 mL水溶性組分和3 mL 1,9-二甲基亞甲藍溶液反應(yīng)15 min,測定525 nm吸光度,同時用硫酸軟骨素標準品繪制標準曲線。

1.2.5 鮑魚的微觀結(jié)構(gòu)

將鮑魚內(nèi)收肌修剪成邊長約為0.50 cm的正方體,在戊二醛溶液中固定24 h,經(jīng)乙醇溶液梯度體積分數(shù)(50%,60%,70%,80%,90%,100%(第一次)和100%(第二次))脫水處理,真空冷凍干燥,噴金,在掃描電鏡下觀察微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.6 鮑魚質(zhì)構(gòu)的測定

采用物性分析儀測定鮑魚在冷藏過程中剪切力和質(zhì)地剖面分析(TPA)的變化。將每個鮑魚內(nèi)收肌修剪成邊長約為1.50 cm的正方體。采用HDP/BS刀片進行剪切力測試。采用P50探頭進行TPA測試,測前、測試、測后速率1.00 mm/s,壓縮程度75%。

1.2.7 統(tǒng)計學方法

除質(zhì)構(gòu)測定(8個平行)外,所有實驗操作均采取3個平行實驗,結(jié)果以(平均值±標準差)表示。采用SPSS 20.0分析學軟件中單因素方差(Student-Newman-Keuls模式)進行顯著性分析,當P<0.05時認為有統(tǒng)計學的顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)源酶對冷藏鮑魚內(nèi)收肌水分含量及持水力的影響

由圖1(a)可知,在冷藏過程中空白對照組和抑制劑組鮑魚內(nèi)收肌的水分含量變化不明顯,但各組的水分含量均略高于新鮮鮑魚,這可能是由于浸泡過程中含鹽度較高的鮑魚內(nèi)收肌吸水造成的。由圖1(b)可知,新鮮鮑魚內(nèi)收肌持水力為85.61%,隨著冷藏時間的延長,持水力呈下降趨勢?？瞻讓φ战M的持水力在冷藏5 d后降至67.72%,這可能是冷藏過程中內(nèi)源性蛋白酶降解鮑魚內(nèi)收肌肌原纖維和結(jié)締組織蛋白,導致持水力降低。相比之下,抑制劑組的持水力在冷藏5 d后僅降至72.88%,表明添加混合抑制劑能夠抑制鮑魚內(nèi)收肌內(nèi)源性蛋白酶活性,減少其對組織結(jié)構(gòu)的降解破壞,使鮑魚內(nèi)收肌保持較好的持水能力[12]。

(a) 水分質(zhì)量分數(shù)

2.2 內(nèi)源酶對鮑魚內(nèi)收肌蛋白水解的影響

TCA-可溶性寡肽可用于測定肌肉蛋白的降解程度[13]。鮑魚內(nèi)收肌冷藏期間的TCA-可溶性寡肽變化如圖2所示。隨著冷藏時間的延長,TCA-可溶性寡肽含量顯著上升,表明冷藏過程中鮑魚內(nèi)收肌肌肉蛋白發(fā)生降解。冷藏相同時間后,抑制劑組TCA-可溶性寡肽含量均顯著低于空白對照組,說明混合蛋白酶抑制劑可以通過抑制酶活力,有效控制蛋白降解。Liu等[12]的研究表明,扇貝柱冷藏過程中,絲氨酸蛋白酶在肌原纖維蛋白和結(jié)締組織蛋白降解中均起到主要作用,而半胱氨酸蛋白酶主要降解肌原纖維蛋白,混合酶抑制劑對蛋白水解的抑制作用優(yōu)于單一抑制劑。

圖2 新鮮及冷藏不同時間鮑魚內(nèi)收肌TCA-可溶性寡肽的變化

2.3 內(nèi)源酶對鮑魚內(nèi)收肌肌原纖維蛋白的影響

肌肉蛋白通常分為三大類:肌質(zhì)蛋白、肌原纖維蛋白和結(jié)締組織蛋白[14],后兩類多為水不溶性蛋白。通過測定鮑魚的MPs提取率和肌原纖維蛋白溶解性來闡明內(nèi)源性蛋白酶對鮑魚內(nèi)收肌肌原纖維蛋白的影響。由圖3可知,隨著冷藏時間延長,MPs提取率和溶解度呈下降趨勢,表明肌原纖維蛋白被內(nèi)源性蛋白酶降解。冷藏相同時間后,抑制劑組MPs提取率和溶解度均高于空白對照組,表明加入混合蛋白酶抑制劑后,可以控制鮑魚內(nèi)收肌中MPs的降解。

(a) 肌原纖維蛋白提取率

2.4 內(nèi)源酶對鮑魚內(nèi)收肌膠原纖維蛋白的影響

通過測定鮑魚在冷藏過程中水溶性羥脯氨酸和糖胺聚糖含量,以說明內(nèi)源性蛋白酶對鮑魚內(nèi)收肌膠原纖維蛋白的影響。由圖4可知,空白對照組的羥脯氨酸溶出率、糖胺聚糖(GAG)溶出量均隨冷藏時間延長逐漸升高。羥脯氨酸是膠原蛋白中特有的氨基酸,其溶出率增加表明水不溶性膠原蛋白發(fā)生降解。GAG是膠原纖維中蛋白聚糖橋接結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成成分,其釋放表明膠原纖維中蛋白聚糖橋接結(jié)構(gòu)的降解[15]。可見,在冷藏過程中,內(nèi)源性蛋白酶可引起鮑魚內(nèi)收肌中膠原成分的降解。冷藏相同時間后,抑制劑組的羥脯氨酸溶出率及糖胺聚糖含量均顯著低于空白對照組,這表明混合抑制劑可通過抑制酶活性,減少內(nèi)源性蛋白酶對膠原纖維蛋白的降解。

(a) 羥脯氨酸溶出率

2.5 內(nèi)源酶對鮑魚內(nèi)收肌微觀結(jié)構(gòu)的影響

新鮮鮑魚內(nèi)收肌的微觀結(jié)構(gòu)如圖5(a)所示,平行排列的肌原纖維緊密堆積,纖維之間空隙較小。冷藏3 d后,空白對照組(圖5(b))鮑魚內(nèi)收肌組織微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化,表面開始出現(xiàn)大量蛋白質(zhì)顆粒,可能是膠原結(jié)締組織在冷藏過程中發(fā)生降解所致。冷藏第5天時,空白對照組(圖5(d))纖維結(jié)構(gòu)排列變得無序且發(fā)生斷裂,肌原纖維表面的膠原組織逐漸消失,表明內(nèi)源性蛋白酶降解肌肉蛋白可導致微觀結(jié)構(gòu)的變化[16],而抑制劑組(圖5(e))表面膠原結(jié)締組織部分保留,肌纖維總體仍然平行排列。說明在冷藏過程中混合抑制劑抑制了內(nèi)源性蛋白酶對肌原纖維和結(jié)締組織的降解,有助于延緩鮑魚內(nèi)收肌的質(zhì)構(gòu)劣變。

(a) 新鮮

2.6 內(nèi)源酶對鮑魚內(nèi)收肌質(zhì)構(gòu)變化的影響

由圖6可以看出,冷藏第1天時,抑制劑組剪切力、硬度、咀嚼度和彈性均高于新鮮樣品,這可能是由于鮑魚內(nèi)收肌進入到死后僵直階段[17]。冷藏3 d后,剪切力顯著下降,但硬度、咀嚼度、彈性和回復性仍保持穩(wěn)定,而冷藏至5 d后,所有質(zhì)構(gòu)指標均顯著下降,說明內(nèi)源性蛋白酶降解肌肉蛋白,破壞肌肉纖維結(jié)構(gòu),導致剪切力、硬度、咀嚼度和彈性下降。冷藏1～3 d后,空白對照組樣品的剪切力、硬度、咀嚼度和彈性等指標均顯著低于抑制劑組,這表明混合酶抑制劑通過抑制內(nèi)源性蛋白酶活性,在前3天有效控制了鮑魚內(nèi)收肌的質(zhì)構(gòu)劣變。冷藏5 d后,空白對照組與抑制劑組的剪切力、硬度、咀嚼度和彈性等指標均無顯著性差異,這說明加入抑制劑雖可以延緩蛋白降解的進程,但由于肌肉蛋白的持續(xù)降解,與空白對照組之間的差異性不再顯著。

(a) 剪切力

3 結(jié) 論

鮑魚內(nèi)收肌在冷藏5 d過程中,內(nèi)源性蛋白酶降解內(nèi)收肌中的肌原纖維蛋白和結(jié)締組織蛋白,導致肌原纖維蛋白提取率下降、溶解度降低,TCA-可溶性寡肽、羥脯氨酸和糖胺聚糖溶出增加,破壞微觀結(jié)構(gòu)完整性,并降低其持水力,最終導致鮑魚內(nèi)收肌質(zhì)構(gòu)劣變,表現(xiàn)為剪切力、硬度、彈性、回復性和咀嚼度顯著下降。添加半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶的混合蛋白酶抑制劑,可以通過特異性降低各內(nèi)源性蛋白酶活性,延緩鮑魚內(nèi)收肌在冷藏過程中的質(zhì)構(gòu)劣變。本研究為可食用酶抑制劑的開發(fā)及鮑魚保鮮加工過程中的質(zhì)構(gòu)控制提供了理論支撐。