李祥超， 易小萍

（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200237）

DF-1 細(xì)胞來(lái)源于ELL-0（East Lansing Line）雞胚胎，是Chicken Embryo Fibroblast（CEF）永生化的細(xì)胞系，可無(wú)限繁殖，因此具備比CEF 更大的增殖能力[1]。該細(xì)胞缺少禽白血病病毒、肉瘤病毒群病毒相關(guān)的內(nèi)源片段，支持禽反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制，已被廣泛應(yīng)用于禽類病毒的增殖和疫苗的生產(chǎn)，例如馬立克病毒[2]、禽 流 感 病 毒[3-4]、Infectious Bursal Disease Virus[5-6]（IBDV）等。但DF-1 細(xì)胞的IBDV 生產(chǎn)能力較低，因此有效提高DF-1 細(xì)胞的IBDV 增殖能力具有重要的研究?jī)r(jià)值。

許多體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系表現(xiàn)出類似Warburg 效應(yīng)的表型，具有增強(qiáng)的糖酵解通量和高乳酸積累，正如Otto Warburg 描述的癌細(xì)胞，這種表型通常不是歸因于低氧環(huán)境，而是細(xì)胞誘導(dǎo)或自發(fā)形成以及對(duì)體外培養(yǎng)的適應(yīng)[7]。體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞中的丙酮酸有很大一部分在乳酸脫氫酶的催化下還原為乳酸，一些哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸的比率高達(dá)90%[8]。這種糖酵解方式會(huì)導(dǎo)致乳酸的積累，最終導(dǎo)致培養(yǎng)基的酸化，從而抑制細(xì)胞的快速生長(zhǎng)。以病毒為最終產(chǎn)物的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，病毒的增殖依賴于宿主細(xì)胞的物質(zhì)和能量代謝，在病毒快速增殖的中后期細(xì)胞糖酵解速率下降，無(wú)法及時(shí)提供病毒大量增殖所需能量，從而限制病毒增殖[9-10]。乳酸主要是通過(guò)乳酸脫氫酶A 將葡萄糖代謝產(chǎn)生的丙酮酸轉(zhuǎn)化而來(lái)，減少乳酸積累的常用手段是敲除或者下調(diào)乳酸脫氫酶A，這種方法能夠有效減少乳酸生成，同時(shí)不損害細(xì)胞活力或生產(chǎn)力。

由于生物技術(shù)的快速發(fā)展，基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的靶向基因快速穩(wěn)定的突變。目前CRISPR/Cas9 系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、酵母、霉菌[11]、植物、昆蟲(chóng)、鼠、魚(yú)和人種屬細(xì)胞中?；陔u體細(xì)胞在遺傳發(fā)育研究上的重要作用，Véron 等[12]首先將CRISPR/Cas9 系統(tǒng)應(yīng)用于雞細(xì)胞，通過(guò)CRISPR 突變Pax7基因研究動(dòng)物模型中調(diào)控發(fā)育的分子機(jī)制。Abu-Bonsrah 等[13]則使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)敲除了DF-1 細(xì)胞和DT40 細(xì)胞中的6 個(gè)遺傳相關(guān)基因，該研究證明利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可對(duì)雞細(xì)胞基因組進(jìn)行精確的靶向遺傳操作，并證明CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在雞細(xì)胞上的操作可行性和高效性。

本研究首先在人CRISPR 載體基礎(chǔ)上對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行優(yōu)化，建立適用于DF-1 細(xì)胞的CRISPR 載體，隨后應(yīng)用該系統(tǒng)對(duì)DF-1 細(xì)胞的雞乳酸脫氫酶（GgLDHA）基因進(jìn)行定向突變，獲得多株不同基因突變型的單克隆細(xì)胞株，并對(duì)這些重組細(xì)胞株的基因型、蛋白表達(dá)和乳酸脫氧酶（LDH）酶活進(jìn)行分析驗(yàn)證；同時(shí)進(jìn)一步對(duì)突變細(xì)胞株的生長(zhǎng)、葡萄糖和乳酸代謝、能量代謝以及IBDV 增殖進(jìn)行綜合分析，系統(tǒng)研究GgLDHA基因突變對(duì)DF-1 細(xì)胞能量代謝以及IBDV增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 LDH 同工酶分離和鑒定

（1）破碎細(xì)胞：取適量細(xì)胞重懸于磷酸鹽緩沖液（PBS）中，將其置于冰上用超聲破碎細(xì)胞。細(xì)胞破碎后，將樣品液在4 ℃下13 000 r/min 離心10 min，取上清保存待用。（2）蛋白濃度測(cè)定：以牛血清白蛋白為對(duì)照，測(cè)定樣品上清中的蛋白濃度（PierceTMBCA 蛋白測(cè)定試劑盒，Thermo Scientific）。（3）電泳和同工酶顯色：制備7.5%（75 g/L，下同）非變性PAGE凝膠，預(yù)電泳20 min；每孔上樣15 μg 總蛋白，在Tris-甘氨酸緩沖液（pH 8.9）體系中電泳，后對(duì)LDH 同工酶進(jìn)行活性顯色，最后加入脫色液終止酶反應(yīng)。

1.2 GgLDHA 基因突變的DF-1 細(xì)胞株構(gòu)建

1.2.1 靶向GgLDHA基因的px458-sgRNA 設(shè)計(jì)和構(gòu)建 靶向GgLDHA基因的sgRNA 通過(guò)在線設(shè)計(jì)工具（Optimized CRISPR Design 和CRISPR direct）設(shè)計(jì)得到，篩選出評(píng)分較高的sgRNAs，其相關(guān)引物序列見(jiàn)表1 所示。sgRNA 構(gòu)建參考Ran 等[14]的方法構(gòu)建，其中引物（5’-TTCGCCACCTCTGACTTGA-3’）用于sgRNA 測(cè)序分析。所有引物合成和測(cè)序工作由生工生物工程公司完成，px458 質(zhì)粒購(gòu)自Addgene 庫(kù)。

表1 靶向GgLDHA 基因的sgRNA 構(gòu)建的引物序列Table 1 Primer sequences in the sgRNA construction targeting toGgLDHA gene

1.3 Western Blot 檢測(cè)

用RIPA（Beyotime）裂解液提取DF-1 野生型細(xì)胞和各個(gè)突變型單克隆細(xì)胞的蛋白，使用PierceTMBCA 蛋白測(cè)定試劑盒檢測(cè)其總蛋白濃度。提取的每一蛋白樣品經(jīng)7.5%的SDS-PAGE 電泳，電泳后的蛋白被轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。轉(zhuǎn)移的蛋白在QuickBlockTMWestern Blot 阻斷緩沖液（Beyotime）阻斷后，先后用抗LDH 抗體和辣根過(guò)氧化酶（HRP）偶聯(lián)的羊抗兔免疫球蛋白（Goat anti-rabbit IgG）抗體孵育，其中甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）用作內(nèi)參蛋白。所有抗體均購(gòu)自Abcam 公司。

1.4 LDH 酶活測(cè)定

樣品上清的總LDH 酶活測(cè)定按照LDH 活性檢測(cè)試劑盒（Sigma-Aldrich）的操作步驟進(jìn)行：收集樣品上清，在4 ℃、12 000g條件下離心15 min，加入試劑盒的工作溶液后，在450 nm 處讀取樣品的吸光度，以相對(duì)野生型細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)表示結(jié)果。

1.5 DF-1 細(xì)胞生長(zhǎng)、葡萄糖和乳酸代謝以及能量代謝分析

1.5.1 DF-1 細(xì)胞生長(zhǎng) 本文所用DF-1 細(xì)胞來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室保存。將DF-1 細(xì)胞以每毫升3×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于T25 方瓶中，置于培養(yǎng)箱（37 ℃，φ=5%CO2，70%濕度）中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為含φ=5% 胎 牛 血 清（FBS）的DMEM/F12（培 養(yǎng)基DMEM 與F12 的體積比為1∶1，下同），培養(yǎng)體積為5 mL。活細(xì)胞密度和細(xì)胞活率采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到90% 時(shí)，以每毫升6×105個(gè)活細(xì)胞密度進(jìn)行細(xì)胞接種培養(yǎng)，每24 h 取樣一次，采用血球計(jì)數(shù)板分別計(jì)算每一時(shí)間點(diǎn)的活細(xì)胞密度，用于繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。每個(gè)樣品重復(fù)3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。同時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，用于檢測(cè)葡萄糖和乳酸含量。

1.5.2 葡萄糖和乳酸含量測(cè)定 將上述所得的細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用生物傳感分析儀（濟(jì)南延和生物科技有限公司）測(cè)定其葡萄糖和乳酸濃度，用于計(jì)算葡萄糖消耗速率（GCR）和乳酸生成速率（LPR）。

1.5.3 線粒體呼吸測(cè)定 細(xì)胞的線粒體呼吸采用Oxygraph-2k 呼吸檢測(cè)儀（OROBOROS 公司）測(cè)定，操作步驟參考Zhao 等[15]描述：將野生型和突變型單克隆細(xì)胞正常傳代，48 h 后重懸細(xì)胞至DMEM/F12培養(yǎng)基中，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果將細(xì)胞稀釋至每毫升1.0×106個(gè)細(xì)胞；然后加入至Oxygraph-2k 呼吸檢測(cè)儀的測(cè)定倉(cāng)中，封閉倉(cāng)后測(cè)定細(xì)胞的基礎(chǔ)氧呼吸速率ROUTINE；加入1 μL（2 μg/mL）寡霉素，記錄此時(shí)氧氣消耗速率LEAK；然后逐步加入羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）解偶聯(lián)劑，氧氣消耗速率逐漸升高至平穩(wěn)，記錄此時(shí)氧氣消耗速率（ETS）；最后加入抗霉素A 和魚(yú)藤酮（Sigma 公司）來(lái)抑制電子傳遞鏈的復(fù)合物I 和III，氧氣消耗速率會(huì)急劇下降至平穩(wěn)，記錄為ROX。

1.5.4 腺苷三磷酸（ATP）濃度測(cè)定 ATP 胞內(nèi)濃度測(cè)定采用的是ADP/ATP 比率檢測(cè)試劑盒（Sigma 公司）。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)照細(xì)胞株的胞內(nèi)ATP 水平設(shè)置為100%，由此計(jì)算得到各克隆細(xì)胞株的胞內(nèi)總ATP 相對(duì)含量。

1.5.5 IBDV 滴度測(cè)定 當(dāng)培養(yǎng)的DF-1 細(xì)胞匯合度達(dá)到90% 時(shí)，移除培養(yǎng)上清，加入新鮮DMEM/F12培養(yǎng)基，接種IBDV 病毒。當(dāng)80% 左右的細(xì)胞發(fā)生病變后，結(jié)束細(xì)胞培養(yǎng)，反復(fù)凍融3 次，收獲病毒。IBDV 病毒滴度（TCID50）參照Chen 等[16]描述：將待檢測(cè)病毒樣品進(jìn)行梯度稀釋（10-1～10-10），然后將每一稀釋樣品接種于96 孔板的DF-1 單層細(xì)胞中，每一梯度的病毒稀釋液接種6 個(gè)復(fù)孔。在顯微鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），其特征為細(xì)胞變圓、脫落和裂解，并使用Reed-Muench 法計(jì)算TCID50。

2 結(jié)果與討論

2.1 LDH 同工酶鑒定和GgLDHA 基因型確認(rèn)

LDH 是催化丙酮酸與乳酸相互轉(zhuǎn)變的同工酶，不同類型的同工酶是由A 或B 亞基組成的四聚體，具有不同的相對(duì)分子量，通過(guò)PAGE 電泳方法可以將其分離，DF-1 細(xì)胞株的LDH 同工酶的表達(dá)分析如圖1 所示。從圖1 可以看出，LDH5 顯色較深，而LDH5 由4 個(gè)LDHA 亞基組成，推測(cè)在DF-1 細(xì)胞中LDHA 表達(dá)占據(jù)主導(dǎo)地位。因此，本研究選擇GgLDHA基因作為靶向基因?qū)ζ溥M(jìn)行基因突變。對(duì)本研究采用的野生型DF-1 細(xì)胞中的GgLDHA基因序列進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)（NCBI Reference Sequence：NC_006092.3）。測(cè)序結(jié)果表明，GgLDHA基因的部分序列大小1 076 bp（含部分內(nèi)含子、外顯子exon 4 和exon 5）， 與NC_006092.3 存在7 個(gè)堿基的差別，同源性為99.3%。基于基因測(cè)序結(jié)果，針對(duì)設(shè)計(jì)靶向GgLDHA基因的sgRNA 設(shè)計(jì)具體見(jiàn)表1 所示。

圖1 DF-1 細(xì)胞株的LDH 同工酶表達(dá)分析Fig.1 LDH isoenzyme expression in DF-1 cell

2.2 CRISPR 載體優(yōu)化、靶向GgLDHA 的sgRNA構(gòu)建及活性驗(yàn)證

將px458 質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染DF-1 細(xì)胞，在熒光顯微鏡下未觀察到任何綠色熒光蛋白（GFP）陽(yáng)性細(xì)胞。推測(cè)px458 質(zhì)粒載體中巨細(xì)胞病毒重組啟動(dòng)子（CBh）在雞胚細(xì)胞中未能有效啟動(dòng)Cas9蛋白表達(dá)，而Cas9 蛋白的表達(dá)對(duì)于CRISPR系統(tǒng)發(fā)揮基因編輯是必須要素。因此，將CBh 啟動(dòng)子更換為更通用的巨細(xì)胞病毒（CMV）啟動(dòng)子，并將px458 質(zhì)粒載體中的人U6 啟動(dòng)子（huU6）更換為雞U6（chU6）啟動(dòng)子，具體過(guò)程如圖2（a～c）所示。CMV序列和chU6 都通過(guò)PCR擴(kuò)增得到，其中CMV序列是以pCI-neo 為擴(kuò)增模板和同CMV 配對(duì)的引物對(duì)擴(kuò)增所得。將px458 質(zhì)粒載體和CMV 的PCR 片段同時(shí)用KpnI 和AgeI 內(nèi)切酶處理，然后用T4 連接酶連接獲得px458-CMV 載體。采用CMV 啟動(dòng)子替換CBh 啟動(dòng)子后，GFP 蛋白在DF-1 細(xì)胞中獲得正常表達(dá)如圖2（d）所示。由于Cas9 蛋白與GFP蛋白通過(guò)2A 肽（T2A）共用CMV 啟動(dòng)子，所以GFP 蛋白的高表達(dá)間接表征Cas9 蛋白在DF-1 細(xì)胞中獲得了高表達(dá)。

圖2 適用于DF-1 細(xì)胞的CRISPR 載體構(gòu)建過(guò)程和DF-1 細(xì)胞中Cas9 蛋白表達(dá)驗(yàn)證Fig.2 Processes of CRISPR vector construction suitable for DF-1 cell and Cas9 protein expression verification in DF-1 cell

II 型CRISPR 系統(tǒng)中采用人III 型RNA 聚合酶U6 啟動(dòng)子起始sgRNA 轉(zhuǎn)錄，考慮到huU6 和chU6啟動(dòng)子的種屬差異性，且Gandhi 等[17]的研究中發(fā)現(xiàn)chU6 啟動(dòng)子能夠獲得比huU6 啟動(dòng)子高4 倍的sgRNA 表達(dá)，因此本研究嘗試采用chU6 啟動(dòng)子替換huU6 啟動(dòng)子，結(jié)果表明（圖2（e）），在DF-1 細(xì)胞中，huU6 和chU6 啟動(dòng)子具有相似的活性，推測(cè)chU6 啟動(dòng)子可能存在DF-1 細(xì)胞不具備的調(diào)控因子。通過(guò)T7EI 錯(cuò)配識(shí)別酶的切割作用，對(duì)sgRNA 活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。研究發(fā)現(xiàn)，單條sgRNA 轉(zhuǎn)染的Indel% 很低，通過(guò)共轉(zhuǎn)染sgRNA1 和sgRNA2，可將Indel% 顯著提高，相較單一sgRNA 轉(zhuǎn)染分別提高了2 倍和4 倍。

2.3 GgLDHA 基因突變的DF-1 單克隆細(xì)胞株鑒定

通過(guò)轉(zhuǎn)染重組CRISPR 載體，結(jié)合流式細(xì)胞儀分選，共獲得13 株GgLDHA基因突變的單克隆DF-1 細(xì)胞株，分別標(biāo)記為MC1～MC13，基因突變株的基因型、蛋白表達(dá)和酶活分析如圖3 所示。對(duì)突變序列進(jìn)行基因測(cè)序鑒定發(fā)現(xiàn)（圖3（b）），基因突變大多發(fā)生于雙鏈斷裂（DSB）附近，且造成中間29 bp 片段的刪除。從13 株突變型細(xì)胞株基因型分析發(fā)現(xiàn)，既存在GgLDHA基因的純合突變，也存在如MC1、MC10、MC11 的嵌合突變，存在一定的隨機(jī)性。因突變發(fā)生于exon 5 編碼區(qū)（圖3（a），PAM 為原間隔相鄰基序），且插入或刪除的堿基數(shù)不是3 的倍數(shù)，因此預(yù)測(cè)基因大多發(fā)生了移碼突變。值得注意的是，由于MC1 突變株發(fā)生嵌合GgLDHA基因突變，加上比其他克隆更高的Western Blot 印跡表達(dá)，因此未對(duì)其檢測(cè)LDH 酶活性。MC4 和MC6 突變株后期生長(zhǎng)不佳，推測(cè)可能發(fā)生脫靶，影響了細(xì)胞生長(zhǎng)，未能獲得蛋白和酶活數(shù)據(jù)。

圖3 GgLDHA 基因突變克隆株的基因型、蛋白表達(dá)和酶活分析Fig.3 GgLDHA mutation monoclonal genotype, protein expression and LDH activity

通過(guò)Western Blot 進(jìn)一步驗(yàn)證基因突變對(duì)LDHA蛋白表達(dá)的影響，從圖3（c）可以看出，突變細(xì)胞株的LDHA 相對(duì)表達(dá)水平出現(xiàn)不同程度的降低。其中MC5 的LDHA 相對(duì)表達(dá)水平只有對(duì)照細(xì)胞的14%，MC2、MC8、MC9、MC11、MC12、MC13 的LDHA 相對(duì)表達(dá)水平約為對(duì)照細(xì)胞的30%～60%。綜合分析表明，不同突變形式和位置對(duì)LDHA 蛋白表達(dá)可產(chǎn)生不同的影響，雙鏈DNA 中不是3 倍數(shù)的堿基數(shù)的片段缺失，可造成蛋白表達(dá)水平顯著下降。

LDHA 作為L(zhǎng)DH 的重要組成亞基，基因突變會(huì)直接減弱LDH 總酶活。將對(duì)照細(xì)胞中LDH 總相對(duì)酶活標(biāo)記為100%，LDH 總酶活的測(cè)定結(jié)果（圖3（d））顯示，相比于對(duì)照細(xì)胞，幾乎所有的突變細(xì)胞株LDH 總酶活均顯著下降，只有對(duì)照細(xì)胞株的10%～20%。LDH 酶活結(jié)果與LDHA 蛋白表達(dá)，呈現(xiàn)不完全相同的趨勢(shì)，推測(cè)可能突變部位選擇的是LDHA 酶關(guān)鍵活性區(qū)域，突變對(duì)酶活影響顯著。上述研究結(jié)果表明對(duì)GgLDHA基因進(jìn)行定向突變，可顯著降低DF-1 細(xì)胞的LDH 總酶活性。

2.4 GgLDHA 基因突變對(duì)DF-1 細(xì)胞生長(zhǎng)、葡萄糖和乳酸代謝的影響

為評(píng)價(jià)GgLDHA基因突變對(duì)DF-1 細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的影響，本文選取2 株突變型單克隆細(xì)胞株（MC2 和MC5）進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)、葡萄糖和乳酸代謝的探討，結(jié)果如圖4 所示。由圖可見(jiàn)，相比于對(duì)照細(xì)胞，GgLDHA基因突變對(duì)DF-1 細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯的影響，但整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程（96 h）的平均GCR 明顯下降（圖4（b）），平均LPR 也顯著降低（圖4（c））。相比于對(duì)照細(xì)胞，突變株MC2、MC5 的平均GCR 分別下降13%和23%；平均LPR 則分別下降了24%和41%。凈乳酸的產(chǎn)量與凈葡萄糖的消耗量之比（LPR/GCR）比值可以表征葡萄糖進(jìn)入乳酸生成途徑的通量，從圖4（d）可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)照細(xì)胞LPR/GCR 達(dá)到了2.1，而突變株該比值明顯降低，MC5 最低降至1.6，降低了24%。表明GgLDHA突變能在不影響細(xì)胞生長(zhǎng)的前提下，有效降低乳酸生成速率。

圖4 野生型和突變型DF-1 細(xì)胞株的細(xì)胞生長(zhǎng)、葡萄糖和乳酸代謝對(duì)比Fig.4 Comparison of cell growth, glucose and lactic acid metabolism between wild type and mutant DF-1 cells

2.5 GgLDHA 基因突變對(duì)DF-1 細(xì)胞能量代謝、IBDX病毒增殖的影響

為評(píng)估GgLDHA基因突變對(duì)DF-1 細(xì)胞有氧代謝速率和能量代謝效率的影響，本文采用線粒體呼吸測(cè)定儀測(cè)定氧呼吸速率，結(jié)果如圖5 所示。由圖可見(jiàn)，相比于對(duì)照細(xì)胞，兩株突變細(xì)胞株的R/E 都有所增加，凈呼吸比值（Net R/E）也明顯增加，表明在突變細(xì)胞株中更多比例的氧氣用于ATP 合成，突變細(xì)胞株的有氧呼吸速率明顯加強(qiáng)。

圖5 野生型和突變型DF-1 細(xì)胞株的的能量代謝和IBDV 病毒滴度Fig.5 Cell energy metabolism and IBDV titer of wild type and mutant DF-1 cells

胞內(nèi)總ATP 濃度可以用來(lái)表征細(xì)胞的能量狀態(tài)，為進(jìn)一步探索GgLDHA基因突變對(duì)DF-1 細(xì)胞能量代謝的影響，對(duì)比野生型和突變株的胞內(nèi)總ATP水平，結(jié)果如圖5（b）所示，設(shè)對(duì)照細(xì)胞中胞內(nèi)ATP濃度為100%，突變細(xì)胞株的胞內(nèi)ATP 濃度明顯提高，其中MC5 突變細(xì)胞株的胞內(nèi)ATP 濃度增加了57%，表明在丙酮酸生成乳酸通量減少的同時(shí)，進(jìn)入三羧酸（TCA）循環(huán)的通量增加，產(chǎn)生了更多的ATP，突變細(xì)胞株的能量代謝效率明顯改善。結(jié)合代謝分析中突變細(xì)胞株葡萄糖消耗速率的明顯下降，表明突變細(xì)胞株的葡萄糖利用效率得到明顯提高。

DF-1 細(xì)胞是IBDV 的良好宿主細(xì)胞，IBDV 病毒的復(fù)制、增殖嚴(yán)格依賴于宿主細(xì)胞為其提供物質(zhì)和能量。對(duì)照細(xì)胞的相對(duì)IBDV 滴度為1，與對(duì)照細(xì)胞相比，突變細(xì)胞株MC2 和MC5 的相對(duì)IBDV 滴度分別提高了2 倍和5 倍（見(jiàn)圖5（c））。突變細(xì)胞株的IBDV 滴度顯著增加，突變細(xì)胞株的IBDV 增殖能力明顯增強(qiáng)。表明DF-1 細(xì)胞能量代謝狀態(tài)的改善有效促進(jìn)了IBDV增殖。

3 結(jié) 論

本研究采用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對(duì)DF-1 細(xì)胞的GgLDHA基因進(jìn)行了定向突變。首先對(duì)原適用于人的CRISPR 載體px458 進(jìn)行了改造，用CMV 啟動(dòng)子替換CBh 啟動(dòng)子，同時(shí)用chU6 啟動(dòng)子替換huU6 啟動(dòng)子，最終獲得了能夠適用于DF-1 細(xì)胞的CRISPR載體px458-chU6-CMV。采取共轉(zhuǎn)靶向同一基因的2 條sgRNA，通過(guò)造成中間大片段的刪除，有效提高了Indel%?；蜩b定結(jié)果顯示，多株突變細(xì)胞中GgLDHA基因發(fā)生29 bp 的刪除，這有可能是共轉(zhuǎn)靶向GgLDHA基因的2 條sgRNA 靶向位置相距適中，可以為Cas9 蛋白造成DSB 提供空間位阻，從而造成中間大片段的刪除?；蛐丸b定結(jié)果表明大部分突變型細(xì)胞株的GgLDHA基因突變發(fā)生于sgRNA1 和sgRNA2 引起的DSB 處，但也存在例外，如MC3 細(xì)胞株的一條染色體GgLDHA基因型發(fā)生2 bp 的插入和10 bp 的刪除，而另外一條染色體的等位基因處發(fā)生1 bp 的插入和14 bp 的刪除。MC13細(xì)胞株的一條染色體中GgLDHA基因發(fā)生55 bp 的刪除，而另外一條染色體的等位點(diǎn)發(fā)生1 bp 的插入和1 bp 的刪除。綜合分析基因型鑒定結(jié)果表明，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)實(shí)施的靶向基因突變存在部分隨機(jī)性，移碼突變是造成靶向蛋白LDHA 酶活下降的主要原因。采取共轉(zhuǎn)靶向同一基因2 條sgRNA 的方法，能夠有效獲得大片段移碼突變。

在DF-1 細(xì)胞中，乳酸代謝與細(xì)胞的能量代謝密切相關(guān)。本文中在野生型DF-1 細(xì)胞快速生長(zhǎng)階段（0～96 h），其乳酸分泌速率高達(dá)約8.2 μmol/(106cell·d)，而葡萄糖消耗速率約為3.9 μmol/(106cell·d)，乳酸對(duì)葡萄糖的得率為2.1，表明在野生型DF-1 細(xì)胞中絕大部分葡萄糖進(jìn)入了乳酸生成的代謝途徑。在氧化磷酸化過(guò)程中，每分子葡萄糖能夠獲得36 個(gè)ATP，而在糖酵解過(guò)程中，每分子葡萄糖只能獲得2 個(gè)ATP，是一種較為低效的能量代謝過(guò)程。顯然，野生型DF-1細(xì)胞更傾向于采用糖酵解這種低效但快速產(chǎn)能的代謝方式，可為DF-1 細(xì)胞的病毒增殖提供有效的能量補(bǔ)充。Xie 等[18]通過(guò)多基因來(lái)調(diào)控丙酮酸相關(guān)代謝，通過(guò)減少丙酮酸到乳酸的通量，增加丙酮酸進(jìn)入TCA 循環(huán)的通量，有效提高了HEK 293 細(xì)胞的腺病毒產(chǎn)量。

GgLDHA基因的突變對(duì)DF-1 細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，卻能夠改善葡萄糖的利用效率。有研究[19]證明LDHA 和LDHB 基因丟失，不會(huì)損害細(xì)胞生長(zhǎng)而且還會(huì)促進(jìn)線粒體能量代謝。然而，乳酸代謝使得細(xì)胞的體外培養(yǎng)通過(guò)糖酵解能夠自給自足，煙酰胺腺嘌呤是維持糖酵解運(yùn)行的關(guān)鍵物質(zhì)，其在丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸的過(guò)程中生成，所以葡萄糖供給充足時(shí)，糖酵解就由細(xì)胞快速完成產(chǎn)能。TCA 循環(huán)和氧化磷酸化涉及眾多酶和底物，制約因素較多，糖酵解的獨(dú)立性擺脫了后續(xù)眾多因素的制約，保障了細(xì)胞能量供給的穩(wěn)定性和安全性。與氧化磷酸化相比，雖然糖酵解產(chǎn)生ATP 效率低，但速率得到提升，單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)能增加，當(dāng)糖酵解快速進(jìn)行時(shí)，其ATP 產(chǎn)量很容易超越氧化磷酸化，Pfeiffer 等[20]認(rèn)為這種低效高產(chǎn)的能量形成方式在能量競(jìng)爭(zhēng)中更具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。這種能量代謝模式在細(xì)胞快速生長(zhǎng)時(shí)保證了快速和穩(wěn)定的能量供應(yīng)，然而在病毒增殖期，葡萄糖的這種代謝模式明顯下降，不能及時(shí)供給病毒大量增殖所需的能量需求。本文發(fā)現(xiàn)在DF-1 細(xì)胞中，GgLDHA基因突變可在不影響DF-1 細(xì)胞生長(zhǎng)的情況下明顯改善DF-1 細(xì)胞代謝狀態(tài)，促進(jìn)葡萄糖的利用效率。突變細(xì)胞株MC2 乳酸分泌速率降至6.3 μmol/(106cell·d)，而葡萄糖消耗速率約為3.4 μmol/(106cell·d)，乳酸對(duì)葡萄糖的得率降為1.8，乳酸的分泌速率和乳酸對(duì)葡萄糖的得率都得到明顯改善；而MC5 的乳酸分泌速率則進(jìn)一步降低至4.8 μmol/(106cell·d)，葡萄糖消耗速率也降低至3.0 μmol/(106cell·d)，乳酸對(duì)葡萄糖的得率進(jìn)一步降為1.6，其對(duì)葡萄糖利用效果的改善更為明顯。

病毒復(fù)制需要來(lái)源于宿主細(xì)胞提供能量和大分子前體。Munger 等[21]采用HCMV 病毒感染人成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的糖酵解和TCA 循環(huán)的代謝物水平增加，同時(shí)相關(guān)酶的轉(zhuǎn)錄水平也發(fā)生了上調(diào)，這兩個(gè)代謝途徑不僅能夠提供多種大分子代謝物的合成前體，同時(shí)也提供能量，說(shuō)明病毒的增殖與細(xì)胞的能量狀態(tài)密切相關(guān)。DF-1細(xì)胞作為IBDV 的宿主細(xì)胞，IBDV 增殖嚴(yán)格依賴于宿主細(xì)胞的物質(zhì)和能量代謝。為了深入探索GgLDHA基因突變對(duì)DF-1 細(xì)胞有氧代謝速率的影響，本文探討了GgLDHA基因突變對(duì)DF-1 細(xì)胞有氧呼吸代謝和能量代謝的影響。研究發(fā)現(xiàn)，相比于對(duì)照細(xì)胞株，突變細(xì)胞株的R/E、Net R/E 均有所增加，顯示更多比例的氧氣用于后續(xù)ATP 的合成。進(jìn)一步分析胞內(nèi)ATP 濃度表明，相比于對(duì)照細(xì)胞，MC5 和MC2 突變細(xì)胞株的胞內(nèi)ATP 濃度較對(duì)照細(xì)胞分別增加了57%和40%，推測(cè)葡萄糖酵解生成的丙酮酸更多進(jìn)入TCA 循環(huán)中生成乙酰，通過(guò)有氧代謝產(chǎn)生更多的ATP，有效提高了能量代謝效率。突變株和對(duì)照細(xì)胞株的IBDV 病毒感染研究表明，MC2 和MC5 突變細(xì)胞株的IBDV 增殖能力明顯增強(qiáng)，病毒滴度較對(duì)照細(xì)胞顯著增加，相比于對(duì)照細(xì)胞株，MC5 和MC2 突變細(xì)胞株的相對(duì)病毒滴度分別提高了5 倍和2 倍。由以上可見(jiàn)，促進(jìn)DF-1 細(xì)胞的能量代謝，有利于促進(jìn)IBDV 在DF-1 中的增殖。

總之，針對(duì)DF-1 細(xì)胞，本研究重新優(yōu)化構(gòu)建了適用于DF-1 細(xì)胞的CRISPR 載體，發(fā)現(xiàn)chU6 和huU6啟動(dòng)子具有相似的活性，CMV 啟動(dòng)子和Cas9 蛋白在DF-1 細(xì)胞中具有良好的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)活性。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染2 條sgRNA 的方法，可以顯著提高Indel%。采用優(yōu)化的CRISPR 載體成功獲得了13 株GgLDHA基因突變型單克隆細(xì)胞株，對(duì)突變株細(xì)胞生長(zhǎng)、物質(zhì)、能量代謝以及病毒增殖綜合分析表明，發(fā)生GgLDHA基因型突變不會(huì)影響細(xì)胞正常生長(zhǎng)，可有效減少乳酸生成，提高葡萄糖的利用效率，明顯改善DF-1 細(xì)胞能量代謝效率，顯著提高IBDV 病毒滴度。本研究為提高IBDV 疫苗的生產(chǎn)能力提供了一種新思路。