吳嫚婷 吳 佳 仇婧玥 龍 榮 宋厚盼

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙，410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙，410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙，410208）

消化性潰瘍（PU）是一種以胃、十二指腸黏膜形成慢性潰瘍?yōu)樘卣鞯纳舷兰膊?，主要病理改變?yōu)轲つさ木窒扌越M織缺損、炎癥與壞死性病變，深達(dá)黏膜肌層。PU 發(fā)生機(jī)制主要與胃酸、胃蛋白酶的自身消化有關(guān)[1]。臨床上患者常以周期性上腹痛、反酸、噯氣為主要表現(xiàn)，易反復(fù)發(fā)作，很難治愈?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為PU 的發(fā)生與許多因素有關(guān)，最常見的有幽門螺桿菌（Hp）感染、藥物濫用、情緒不良、精神緊張、飲食無規(guī)律、吸煙飲酒[2]。本病多發(fā)于20～50 歲的成年人，男性居多。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人們飲食結(jié)構(gòu)與生活習(xí)慣發(fā)生改變，消化性潰瘍發(fā)生率逐年增加[3]。目前臨床上對(duì)該疾病的治療主要從抑制胃酸分泌、根除Hp、保護(hù)胃黏膜等幾個(gè)方面下手，常規(guī)采用三聯(lián)療法或四聯(lián)療法[4]。

Hp 相關(guān)性PU 中醫(yī)病名為“胃痛”“嘈雜”“胃瘍”。中醫(yī)藥治療PU 有良好的療效，除了能改善癥狀，不良反應(yīng)和耐藥現(xiàn)象也比較少，復(fù)發(fā)率低。左金丸由元代醫(yī)家朱震亨所創(chuàng)，主要用于治療肝郁化火橫犯胃氣導(dǎo)致的脅痛、嘔吐、吞酸等，由黃連和吳茱萸兩味藥物組成?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，左金丸具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、抑制胃酸和胃泌素分泌、胃蛋白酶活性等功效，是治療Hp 相關(guān)性PU、Hp 相關(guān)性胃炎等疾病的常用方[5]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)方法研究藥物與疾病和靶點(diǎn)之間“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”的協(xié)同作用關(guān)系。其整體性、系統(tǒng)性和注重藥物間相互作用的特點(diǎn)與中醫(yī)藥學(xué)整體觀思想相吻合，從系統(tǒng)層面揭示中藥對(duì)機(jī)體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作用[6]。本研究旨在運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)方法篩選左金丸治療Hp相關(guān)性PU 涉及的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 左金丸活性成分收集

登錄TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），點(diǎn)擊Herb name，依次輸入“吳茱萸”和“黃連”，分別檢索兩味藥物的成分信息和相關(guān)靶點(diǎn)，在成分信息中篩選出口服生物利用度 （OB）≥30%和藥物相似性（DL）≥0.18 的活性成分，保存吳茱萸和黃連的活性成分及其相關(guān)參數(shù)。

1.2 活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch）可根據(jù)配體的2D、3D 結(jié)構(gòu)精確預(yù)測(cè)生物活性分子靶點(diǎn)，可通過輸入活性成分的SMILES 化學(xué)式或復(fù)制sdf 格式到繪圖區(qū)兩種方式進(jìn)行檢索，再點(diǎn)擊submit 即可獲得預(yù)測(cè)的相關(guān)靶點(diǎn)[7]。從TCMSP 中檢索出吳茱萸和黃連的活性成分，在Molecule Name 列點(diǎn)擊成分名稱，跳轉(zhuǎn)至Molecule Information，點(diǎn)擊PubChew Cld，保存活性成分2D sdf 格式；PubChew Cld 行顯示N/A 者，點(diǎn)擊成分圖形保存為mol2 格式文件，將mol2 格式文件導(dǎo)入openbabel 軟件中，output format設(shè)置為Sdf-MDL MOL format，保存sdf 格式文件。登錄Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫，物種選擇Homo sapiens，點(diǎn)擊繪圖區(qū)的Import，上傳吳茱萸和黃連活性成分的sdf 格式，自動(dòng)識(shí)別出活性成分結(jié)構(gòu)，點(diǎn)擊Predict targets，獲取左金丸作用靶點(diǎn)。

1.3 Hp 相關(guān)性PU 基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)獲取

GEO 數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)是隸屬于美國國立衛(wèi)生研究院生物技術(shù)信息中心（NCBI）的世界最大、最全面的公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫之一。在GEO 數(shù)據(jù)庫中輸入檢索詞“Helicobacter pylori”，共獲得2 647 條結(jié)果，其中人類的基因芯片為670 條，選取基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE19769，其中包含正常胃黏膜樣本10 個(gè)，分別為GSM493642、GSM493643、GSM493644、GSM493645、GSM493646、GSM493647、GSM493648、GSM493649、GSM493650、GSM493651；Hp 相關(guān)性PU 樣本9 個(gè)，分別為GSM493633、GSM493634、GSM493635、GSM493636、GSM493637、GSM493638、GSM493639、GSM493640、GSM493641。

1.4 Hp 相關(guān)性PU 與正常胃組織差異表達(dá)microRNA 篩選

登錄OmicShare 分析平臺(tái)（https://www.omicshare.com/），對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理后，以P<0.05 且︱log2FC︱ >1為條件篩選全部差異表達(dá)microRNA，并繪制基因轉(zhuǎn)錄譜火山圖；以P<0.05 且︱log2FC︱≥2 為篩選條件進(jìn)一步獲取顯著性差異表達(dá)microRNA，繪制層次聚類熱圖[8]。

1.5 Hp 相關(guān)性PU 胃黏膜與正常胃黏膜差異表達(dá)基因篩選

選取Hp 感染人胃黏膜與正常胃黏膜顯著性上調(diào)和下調(diào)排名前五的microRNA，于ENCORI 平臺(tái)（https://starbase.sysu.edu.cn/）點(diǎn)擊miRNA-mRNA 進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，輸入microRNA 名稱，獲得顯著性差異表達(dá)microRNA 對(duì)應(yīng)mRNA，即為Hp 相關(guān)性PU 的致病基因。

1.6 左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 涉及關(guān)鍵基因篩選

把吳茱萸和黃連活性成分靶點(diǎn)，Hp 相關(guān)性PU 關(guān)鍵致病基因?qū)隫enny 數(shù)據(jù)庫（https://bioinfogp.cnb.csic.es/ tools/venny/），將基因分別輸入list1、list2，去重后篩選交集基因，得到左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 涉及的關(guān)鍵基因。

1.7 左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 涉及關(guān)鍵基因GO 功能分析

利用Metascape（https://metascape.org/）數(shù)據(jù)庫，對(duì)左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 涉及關(guān)鍵基因做GO 功能分析，以gene list 方式將基因?qū)?，物種選擇H.sapiens，得到GO 功能三個(gè)分支即生物過程（BP）、分子功能（MP）、細(xì)胞組分（CC）的分析結(jié)果。

1.8 GSEA 法分析左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 涉及信號(hào)通路

GSEA（Gene Set Enrichment Analysis） 是 一種用于確定一組先驗(yàn)定義基因是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的富集方法，能反映一批基因微量變化累積所造成的顯著性差異[9]。登錄OmicStudio（https://www.lc-bio.cn/），選 擇GSEA 富 集 分 析 工具，輸入數(shù)據(jù)ID 類型為symbols，選擇GSEA C2 數(shù)據(jù)集中的KEGG 基因集c2.cp.kegg.v7.4，以.xlsx 文件格式上傳基因，設(shè)置置換次數(shù)為10 000，p 值類型為pvalue，閾值為1，以上述條件篩選出top10 的信號(hào)通路，打包下載信號(hào)通路集表格結(jié)果及相關(guān)圖片。

2 結(jié)果

2.1 左金丸活性成分與相應(yīng)靶點(diǎn)

從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中以O(shè)B≥30%和DL≥0.18 為條件篩選出44 個(gè)有效活性成分，其中，吳茱萸有效成分30 個(gè)，黃連有效成分14 個(gè)，重復(fù)成分3 個(gè)，包括小檗堿（MOL001454）、黃柏酮（MOL013352）、槲皮素（MOL000098），具體的活性成分信息見表1。左金丸作用靶點(diǎn)共4 200 個(gè)，其中黃連作用靶點(diǎn)1 400 個(gè)，吳茱萸作用靶點(diǎn)2 800 個(gè)，去除重復(fù)后得到891個(gè)左金丸作用靶點(diǎn)。

表1 左金丸主要活性成分信息

2.2 芯片數(shù)據(jù)均一化處理

對(duì)基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE19769 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)化處理，繪制芯片數(shù)據(jù)相對(duì)表達(dá)值的小提琴圖（圖1）。小提琴圖的橫坐標(biāo)代表各樣本編號(hào)，縱坐標(biāo)代表各樣本相對(duì)表達(dá)值。圖1結(jié)果顯示19 個(gè)樣本的中位數(shù)基本位于一條水平直線上，表明芯片數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，沒有異常值，呈現(xiàn)出相對(duì)穩(wěn)定性，適用于Hp 感染胃黏膜與正常胃黏膜差異表達(dá)基因的后續(xù)分析。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)化后GSE19769 各樣本基因表達(dá)值的小提琴圖

2.3 Hp 感染人胃黏膜與正常胃黏膜差異表達(dá)microRNA 分析

通過分析基因表達(dá)譜GSE19769 中Hp 感染組和正常組芯片數(shù)據(jù)，共篩選出差異表達(dá)microRNA 556 個(gè)。以P<0.05，︱log2FC︱ >1 為初步篩選條件，共獲得78 個(gè)差異表達(dá)microRNA，其中上調(diào)56 個(gè)，下調(diào)22 個(gè)。圖2 為Hp 感染組與正常胃黏膜差異表達(dá)microRNA 的火山圖，圖中縱坐標(biāo)為-log10(P value) 值，橫坐標(biāo)為log2（fold change）值。圖中每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)基因，紅色正方形為顯著上調(diào)表達(dá)的microRNA，藍(lán)色三角形為顯著下調(diào)表達(dá)的microRNA，該圖反映了Hp 感染胃黏膜與正常胃黏膜差異表達(dá)microRNA 的總體分布情況。

圖2 Hp 感染組和正常組胃黏膜差異表達(dá)microRNA 火山圖

2.4 Hp 感染人胃黏膜與正常胃黏膜顯著性差異表達(dá)microRNA 篩選

以P<0.05 和︱log2FC︱ >2 為條件篩選出30 個(gè)上下調(diào)顯著性差異表達(dá)microRNA；圖3 為Hp 感染與正常胃黏膜顯著性差異表達(dá)microRNA 的層次聚類熱圖，圖中每個(gè)小方格表示一個(gè)基因，顏色深淺與該基因表達(dá)量的高低正相關(guān)，紅色代表上調(diào)基因，綠色代表下調(diào)基因。熱圖的右側(cè)為microRNA 名稱，每一行代表同一個(gè)microRNA 在不同樣本中的表達(dá)值，每一列代表一個(gè)樣本中的所有顯著性表達(dá)microRNA。從30 個(gè)顯著性差異表達(dá)microRNA 中篩選出︱logFC︱最大的10 個(gè)microRNA，表2 為10 個(gè)microRNA的相關(guān)信息。通過starbase 數(shù)據(jù)庫找到10 個(gè)microRNA 對(duì)應(yīng)的靶基因有869 個(gè)，刪掉重復(fù)值得到684 個(gè)靶基因。

圖3 Hp 感染與正常胃黏膜顯著性差異表達(dá)microRNA 層次聚類熱圖

圖4 左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 涉及關(guān)鍵基因的GSEA 富集分析圖

2.5 左金丸治療Hp 相關(guān)性潰瘍涉及關(guān)鍵基因篩選

將左金丸作用靶點(diǎn)（891 個(gè)）、Hp 感染人胃黏膜顯著性差異表達(dá)microRNA 對(duì)應(yīng)靶基因（684 個(gè)）取交集，得到EGLN3、CBFA2T3、HIF1A、HSP90AB1、UBE2D1、UNC45A、CUL9、LAMTOR5、HIPK4、BIRC5、CDK15、FHIT、CUL7 特異性交集基因，即為左金丸治療Hp 相關(guān)性潰瘍涉及的關(guān)鍵基因。

2.6 左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 涉及關(guān)鍵基因GO 功能分析

利用Metascape 數(shù)據(jù)庫對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行GO 功能分析，主要涉及29 個(gè)條目（表3）。其中生物過程包括翻譯后蛋白修飾、微管細(xì)胞骨架組織、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、泛素依賴性蛋白分解代謝、上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化等；細(xì)胞成分主要涉及細(xì)胞溶質(zhì)、大分子復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)、泛素連接酶復(fù)合物、細(xì)胞核等；分子功能包括泛素蛋白連接酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、鈣粘蛋白結(jié)合、ATP 結(jié)合、Hsp90 蛋白結(jié)合、組蛋白脫乙酰酶結(jié)合等。

2.7 左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 涉及信號(hào)通路分析

表3 左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 涉及關(guān)鍵基因的GO 功能富集分析

GSEA 分析得到左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 涉及的信號(hào)通路 主要包括自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、趨化因子信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、WNT 信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)通路、癌癥相關(guān)通路。表4 列出了6 條信號(hào)通路的詳細(xì)信息，其中setSize 代表該基因集下的基因總數(shù)，ES 表示富集得分，Pvalue 表示富集結(jié)果的可信度。以上結(jié)果表明，左金丸可能通過上述6 條信號(hào)通路調(diào)控microRNA 和自噬基因以治療Hp相關(guān)性PU。

表4 左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 特異性基因GSEA 富集分析結(jié)果

3 討論

左金丸首見于《丹溪心法》卷一火六篇，原文著“火郁發(fā)之，看何經(jīng)，輕者可降，重者從其性而升之”“凡火盛者，不可驟用涼藥，必兼溫散”，左金丸治肝火，一名回令丸，黃連六兩，吳茱萸一兩或半兩。中醫(yī)臨床常將Hp 相關(guān)性PU 辨證分型為肝胃不和證、脾胃虛寒證、脾胃濕熱證、肝胃郁熱證、胃陰不足證和胃絡(luò)瘀阻證，左金丸可用于治療肝胃郁熱型Hp相關(guān)性消化性潰瘍，黃連主瀉肝之實(shí)火，佐以少量吳茱萸從其性溫散之，脾胃虛寒者忌用。

龔汶等[10]總結(jié)左金丸治療Hp 機(jī)制主要體現(xiàn)在五個(gè)方面，包括抑制尿素酶活性、抑制生物膜合成、調(diào)節(jié)胃部菌群、調(diào)控microRNA 表達(dá)及其他分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。大鼠實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)左金丸可通過升高胃液pH、提高血清中PGE2 含量[11]、降低促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、抑制血漿皮質(zhì)醇（CORT）分泌[12]、降低胃黏膜TNF-α 含量[13]發(fā)揮保護(hù)胃黏膜的作用。黃連和其主成分小檗堿均能抑制Hp 生長與增殖，且實(shí)驗(yàn)顯示黃連抑制Hp 作用明顯優(yōu)于小檗堿[14]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為Hp 相關(guān)性PU 基本病機(jī)為正虛邪實(shí)，治以扶正祛邪，扶正以補(bǔ)養(yǎng)后天脾胃為主，實(shí)驗(yàn)顯示一定劑量黃連可顯著升高胃竇平滑肌組織CaM/MLCKmRNA 表達(dá)水平，起到調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)和“健胃”作用[15]，可在一定程度上扶正。吳茱萸中檸檬苦素、吳茱萸次堿和1-甲基-2-壬基-4(1H)-喹諾酮在體外抑制Hp活性效果很顯著[16]，其中檸檬苦素可通過Nrf2/ARE 途徑改善吲哚美辛(INDO)誘導(dǎo)的腸道損傷和潰瘍[17]。

取左金丸作用靶點(diǎn)和Hp 相關(guān)性PU 關(guān)鍵致病基因的交 集 得 到EGLN3、CBFA2T3、HIF1A、HSP90AB1、UBE2D1、UNC45A、CUL9、LAMTOR5、HIPK4、BIRC5、CDK15、FHIT、CUL7 等關(guān)鍵基因。小檗堿和槲皮素是黃連與吳茱萸共同的活性成分，其中小檗堿可通過下調(diào)EGLN3 誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，EGLN3 抑制增加了細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27的表達(dá)[18]。HIF-1 是哺乳動(dòng)物應(yīng)對(duì)缺氧反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧環(huán)境中，HIF-1A 可觸發(fā)自噬。HIF-1A 過表達(dá)，通常伴隨mTOR 途徑的抑制，進(jìn)而影響胃黏膜上皮細(xì)胞自噬[19]。研究表明小檗堿通過調(diào)節(jié)HIF-1α 在結(jié)腸癌[20]和鼻咽癌[21]中發(fā)揮重要作用。小檗堿是一種新的HIF-1α 抑制劑，通過抑制mTOR 依賴的HIF-1α 蛋白合成來抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的糖代謝，下調(diào)HIF-1α 和TGF-β 的表達(dá)來抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。槲皮素對(duì)HIF-1α 的調(diào)節(jié)作用有雙面性，一方面抑制蛋白質(zhì)合成可減少HIF-1α 的積累[22]，另一方面抑制脯氨酸羥化酶可增強(qiáng)HIF-1α 蛋白的穩(wěn)定性。同時(shí)槲皮素通過HIF-1α 依賴性誘導(dǎo)p21WAF 抑制細(xì)胞增殖。有研究顯示槲皮素可調(diào)控HIF-1α[23]和BIRC5[24]在肝癌中的作用，誘導(dǎo)HIF-1α 在人HepG2 肝癌細(xì)胞中的表達(dá)和活性，通過下調(diào)BIRC5 的表達(dá)抑制人肝細(xì)胞癌（HCC）細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

GO 功能分析結(jié)果顯示，左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 涉及翻譯后蛋白修飾、微管細(xì)胞骨架組織、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、泛素依賴性蛋白分解代謝、上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化等生物學(xué)過程，主要發(fā)生于細(xì)胞溶質(zhì)、大分子復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)、泛素連接酶復(fù)合物、細(xì)胞核，分子功能包括泛素蛋白連接酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、鈣粘蛋白結(jié)合、ATP 結(jié)合、組蛋白脫乙酰酶結(jié)合等。GSEA 結(jié)果顯示，左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 涉及的信號(hào)通路包括自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、趨化因子信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、WNT 信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)通路、癌癥相關(guān)通路。

WNT 信號(hào)通路主要由一個(gè)分泌的生長因子蛋白家族控制，該通路參與了很多重要的細(xì)胞系統(tǒng)[25]。腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白(Tipα)是Hp 新的致癌蛋白，可損傷胃黏膜，Tipα可以激活胃癌干細(xì)胞Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，使下游靶基因Oct4 和Nanog 的mRNA 表達(dá)量增加[26]。NK 細(xì)胞可誘導(dǎo)caspase 依賴的凋亡，主要機(jī)制為表達(dá)FasL 和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的NK 細(xì)胞與表達(dá)死亡受體的靶細(xì)胞的相互作用[27]。MAPK 信號(hào)通路也和胃黏膜上皮損傷后的修復(fù)密切相關(guān)，是治療Hp 相關(guān)性潰瘍的重要靶點(diǎn)[28]。黃連素可從蛋白和mRNA 水平兩個(gè)方面顯著抑制由TNF-α 刺激產(chǎn)生的IL-6、IL-8 和MCP-1，進(jìn)而下調(diào)MAPK 通路磷酸化水平[29]。檸檬苦素可降低NP 細(xì)胞中MAPK/NF-κB 信號(hào)通路和RIP1/RIP3/MLKL 壞死通路的激活[30]。吳茱萸次堿可使MAPK 通路失活，從而減少細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[31]。Hp 感染可引發(fā)慢性胃炎、慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、胃癌等疾病，癌癥信號(hào)通路亦與Hp 感染、致病及臨床治療顯著相關(guān)。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 的分子機(jī)制，并進(jìn)一步分析了分子機(jī)制中涉及的關(guān)鍵基因、信號(hào)通路，探討左金丸活性成分抗Hp 的主要分子機(jī)制，相關(guān)研究結(jié)果旨在為Hp 相關(guān)性PU的臨床診斷和治療提供理論指導(dǎo)，為今后Hp 相關(guān)性潰瘍的治療靶點(diǎn)選擇及新藥研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。