吳嫚婷 吳 佳 仇婧玥 龍 榮 宋厚盼

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙，410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙，410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點實驗室，湖南 長沙，410208）

消化性潰瘍（PU）是一種以胃、十二指腸黏膜形成慢性潰瘍?yōu)樘卣鞯纳舷兰膊?，主要病理改變?yōu)轲つさ木窒扌越M織缺損、炎癥與壞死性病變，深達(dá)黏膜肌層。PU 發(fā)生機制主要與胃酸、胃蛋白酶的自身消化有關(guān)[1]。臨床上患者常以周期性上腹痛、反酸、噯氣為主要表現(xiàn)，易反復(fù)發(fā)作，很難治愈?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為PU 的發(fā)生與許多因素有關(guān)，最常見的有幽門螺桿菌（Hp）感染、藥物濫用、情緒不良、精神緊張、飲食無規(guī)律、吸煙飲酒[2]。本病多發(fā)于20～50 歲的成年人，男性居多。隨著社會經(jīng)濟發(fā)展，人們飲食結(jié)構(gòu)與生活習(xí)慣發(fā)生改變，消化性潰瘍發(fā)生率逐年增加[3]。目前臨床上對該疾病的治療主要從抑制胃酸分泌、根除Hp、保護胃黏膜等幾個方面下手，常規(guī)采用三聯(lián)療法或四聯(lián)療法[4]。

Hp 相關(guān)性PU 中醫(yī)病名為“胃痛”“嘈雜”“胃瘍”。中醫(yī)藥治療PU 有良好的療效，除了能改善癥狀，不良反應(yīng)和耐藥現(xiàn)象也比較少，復(fù)發(fā)率低。左金丸由元代醫(yī)家朱震亨所創(chuàng)，主要用于治療肝郁化火橫犯胃氣導(dǎo)致的脅痛、嘔吐、吞酸等，由黃連和吳茱萸兩味藥物組成?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，左金丸具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、抑制胃酸和胃泌素分泌、胃蛋白酶活性等功效，是治療Hp 相關(guān)性PU、Hp 相關(guān)性胃炎等疾病的常用方[5]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)運用網(wǎng)絡(luò)方法研究藥物與疾病和靶點之間“多成分、多靶點、多途徑”的協(xié)同作用關(guān)系。其整體性、系統(tǒng)性和注重藥物間相互作用的特點與中醫(yī)藥學(xué)整體觀思想相吻合，從系統(tǒng)層面揭示中藥對機體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作用[6]。本研究旨在運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)方法篩選左金丸治療Hp相關(guān)性PU 涉及的分子機制。

1 材料與方法

1.1 左金丸活性成分收集

登錄TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），點擊Herb name，依次輸入“吳茱萸”和“黃連”，分別檢索兩味藥物的成分信息和相關(guān)靶點，在成分信息中篩選出口服生物利用度 （OB）≥30%和藥物相似性（DL）≥0.18 的活性成分，保存吳茱萸和黃連的活性成分及其相關(guān)參數(shù)。

1.2 活性成分靶點預(yù)測

Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch）可根據(jù)配體的2D、3D 結(jié)構(gòu)精確預(yù)測生物活性分子靶點，可通過輸入活性成分的SMILES 化學(xué)式或復(fù)制sdf 格式到繪圖區(qū)兩種方式進行檢索，再點擊submit 即可獲得預(yù)測的相關(guān)靶點[7]。從TCMSP 中檢索出吳茱萸和黃連的活性成分，在Molecule Name 列點擊成分名稱，跳轉(zhuǎn)至Molecule Information，點擊PubChew Cld，保存活性成分2D sdf 格式；PubChew Cld 行顯示N/A 者，點擊成分圖形保存為mol2 格式文件，將mol2 格式文件導(dǎo)入openbabel 軟件中，output format設(shè)置為Sdf-MDL MOL format，保存sdf 格式文件。登錄Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫，物種選擇Homo sapiens，點擊繪圖區(qū)的Import，上傳吳茱萸和黃連活性成分的sdf 格式，自動識別出活性成分結(jié)構(gòu)，點擊Predict targets，獲取左金丸作用靶點。

1.3 Hp 相關(guān)性PU 基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)獲取

GEO 數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)是隸屬于美國國立衛(wèi)生研究院生物技術(shù)信息中心（NCBI）的世界最大、最全面的公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫之一。在GEO 數(shù)據(jù)庫中輸入檢索詞“Helicobacter pylori”，共獲得2 647 條結(jié)果，其中人類的基因芯片為670 條，選取基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE19769，其中包含正常胃黏膜樣本10 個，分別為GSM493642、GSM493643、GSM493644、GSM493645、GSM493646、GSM493647、GSM493648、GSM493649、GSM493650、GSM493651；Hp 相關(guān)性PU 樣本9 個，分別為GSM493633、GSM493634、GSM493635、GSM493636、GSM493637、GSM493638、GSM493639、GSM493640、GSM493641。

1.4 Hp 相關(guān)性PU 與正常胃組織差異表達(dá)microRNA 篩選

登錄OmicShare 分析平臺（https://www.omicshare.com/），對芯片數(shù)據(jù)進行均一化處理后，以P<0.05 且︱log2FC︱ >1為條件篩選全部差異表達(dá)microRNA，并繪制基因轉(zhuǎn)錄譜火山圖；以P<0.05 且︱log2FC︱≥2 為篩選條件進一步獲取顯著性差異表達(dá)microRNA，繪制層次聚類熱圖[8]。

1.5 Hp 相關(guān)性PU 胃黏膜與正常胃黏膜差異表達(dá)基因篩選

選取Hp 感染人胃黏膜與正常胃黏膜顯著性上調(diào)和下調(diào)排名前五的microRNA，于ENCORI 平臺（https://starbase.sysu.edu.cn/）點擊miRNA-mRNA 進行靶基因預(yù)測，輸入microRNA 名稱，獲得顯著性差異表達(dá)microRNA 對應(yīng)mRNA，即為Hp 相關(guān)性PU 的致病基因。

1.6 左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 涉及關(guān)鍵基因篩選

把吳茱萸和黃連活性成分靶點，Hp 相關(guān)性PU 關(guān)鍵致病基因?qū)隫enny 數(shù)據(jù)庫（https://bioinfogp.cnb.csic.es/ tools/venny/），將基因分別輸入list1、list2，去重后篩選交集基因，得到左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 涉及的關(guān)鍵基因。

1.7 左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 涉及關(guān)鍵基因GO 功能分析

利用Metascape（https://metascape.org/）數(shù)據(jù)庫，對左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 涉及關(guān)鍵基因做GO 功能分析，以gene list 方式將基因?qū)?，物種選擇H.sapiens，得到GO 功能三個分支即生物過程（BP）、分子功能（MP）、細(xì)胞組分（CC）的分析結(jié)果。

1.8 GSEA 法分析左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 涉及信號通路

GSEA（Gene Set Enrichment Analysis） 是 一種用于確定一組先驗定義基因是否具有統(tǒng)計學(xué)意義的富集方法，能反映一批基因微量變化累積所造成的顯著性差異[9]。登錄OmicStudio（https://www.lc-bio.cn/），選 擇GSEA 富 集 分 析 工具，輸入數(shù)據(jù)ID 類型為symbols，選擇GSEA C2 數(shù)據(jù)集中的KEGG 基因集c2.cp.kegg.v7.4，以.xlsx 文件格式上傳基因，設(shè)置置換次數(shù)為10 000，p 值類型為pvalue，閾值為1，以上述條件篩選出top10 的信號通路，打包下載信號通路集表格結(jié)果及相關(guān)圖片。

2 結(jié)果

2.1 左金丸活性成分與相應(yīng)靶點

從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中以O(shè)B≥30%和DL≥0.18 為條件篩選出44 個有效活性成分，其中，吳茱萸有效成分30 個，黃連有效成分14 個，重復(fù)成分3 個，包括小檗堿（MOL001454）、黃柏酮（MOL013352）、槲皮素（MOL000098），具體的活性成分信息見表1。左金丸作用靶點共4 200 個，其中黃連作用靶點1 400 個，吳茱萸作用靶點2 800 個，去除重復(fù)后得到891個左金丸作用靶點。

表1 左金丸主要活性成分信息

2.2 芯片數(shù)據(jù)均一化處理

對基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE19769 進行標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)化處理，繪制芯片數(shù)據(jù)相對表達(dá)值的小提琴圖（圖1）。小提琴圖的橫坐標(biāo)代表各樣本編號，縱坐標(biāo)代表各樣本相對表達(dá)值。圖1結(jié)果顯示19 個樣本的中位數(shù)基本位于一條水平直線上，表明芯片數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，沒有異常值，呈現(xiàn)出相對穩(wěn)定性，適用于Hp 感染胃黏膜與正常胃黏膜差異表達(dá)基因的后續(xù)分析。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)化后GSE19769 各樣本基因表達(dá)值的小提琴圖

2.3 Hp 感染人胃黏膜與正常胃黏膜差異表達(dá)microRNA 分析

通過分析基因表達(dá)譜GSE19769 中Hp 感染組和正常組芯片數(shù)據(jù)，共篩選出差異表達(dá)microRNA 556 個。以P<0.05，︱log2FC︱ >1 為初步篩選條件，共獲得78 個差異表達(dá)microRNA，其中上調(diào)56 個，下調(diào)22 個。圖2 為Hp 感染組與正常胃黏膜差異表達(dá)microRNA 的火山圖，圖中縱坐標(biāo)為-log10(P value) 值，橫坐標(biāo)為log2（fold change）值。圖中每一個點代表一個基因，紅色正方形為顯著上調(diào)表達(dá)的microRNA，藍(lán)色三角形為顯著下調(diào)表達(dá)的microRNA，該圖反映了Hp 感染胃黏膜與正常胃黏膜差異表達(dá)microRNA 的總體分布情況。

圖2 Hp 感染組和正常組胃黏膜差異表達(dá)microRNA 火山圖

2.4 Hp 感染人胃黏膜與正常胃黏膜顯著性差異表達(dá)microRNA 篩選

以P<0.05 和︱log2FC︱ >2 為條件篩選出30 個上下調(diào)顯著性差異表達(dá)microRNA；圖3 為Hp 感染與正常胃黏膜顯著性差異表達(dá)microRNA 的層次聚類熱圖，圖中每個小方格表示一個基因，顏色深淺與該基因表達(dá)量的高低正相關(guān)，紅色代表上調(diào)基因，綠色代表下調(diào)基因。熱圖的右側(cè)為microRNA 名稱，每一行代表同一個microRNA 在不同樣本中的表達(dá)值，每一列代表一個樣本中的所有顯著性表達(dá)microRNA。從30 個顯著性差異表達(dá)microRNA 中篩選出︱logFC︱最大的10 個microRNA，表2 為10 個microRNA的相關(guān)信息。通過starbase 數(shù)據(jù)庫找到10 個microRNA 對應(yīng)的靶基因有869 個，刪掉重復(fù)值得到684 個靶基因。

圖3 Hp 感染與正常胃黏膜顯著性差異表達(dá)microRNA 層次聚類熱圖

圖4 左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 涉及關(guān)鍵基因的GSEA 富集分析圖

2.5 左金丸治療Hp 相關(guān)性潰瘍涉及關(guān)鍵基因篩選

將左金丸作用靶點（891 個）、Hp 感染人胃黏膜顯著性差異表達(dá)microRNA 對應(yīng)靶基因（684 個）取交集，得到EGLN3、CBFA2T3、HIF1A、HSP90AB1、UBE2D1、UNC45A、CUL9、LAMTOR5、HIPK4、BIRC5、CDK15、FHIT、CUL7 特異性交集基因，即為左金丸治療Hp 相關(guān)性潰瘍涉及的關(guān)鍵基因。

2.6 左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 涉及關(guān)鍵基因GO 功能分析

利用Metascape 數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵基因進行GO 功能分析，主要涉及29 個條目（表3）。其中生物過程包括翻譯后蛋白修飾、微管細(xì)胞骨架組織、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、泛素依賴性蛋白分解代謝、上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化等；細(xì)胞成分主要涉及細(xì)胞溶質(zhì)、大分子復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)、泛素連接酶復(fù)合物、細(xì)胞核等；分子功能包括泛素蛋白連接酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、鈣粘蛋白結(jié)合、ATP 結(jié)合、Hsp90 蛋白結(jié)合、組蛋白脫乙酰酶結(jié)合等。

2.7 左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 涉及信號通路分析

表3 左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 涉及關(guān)鍵基因的GO 功能富集分析

GSEA 分析得到左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 涉及的信號通路 主要包括自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、趨化因子信號通路、MAPK 信號通路、WNT 信號通路、肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)通路、癌癥相關(guān)通路。表4 列出了6 條信號通路的詳細(xì)信息，其中setSize 代表該基因集下的基因總數(shù)，ES 表示富集得分，Pvalue 表示富集結(jié)果的可信度。以上結(jié)果表明，左金丸可能通過上述6 條信號通路調(diào)控microRNA 和自噬基因以治療Hp相關(guān)性PU。

表4 左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 特異性基因GSEA 富集分析結(jié)果

3 討論

左金丸首見于《丹溪心法》卷一火六篇，原文著“火郁發(fā)之，看何經(jīng)，輕者可降，重者從其性而升之”“凡火盛者，不可驟用涼藥，必兼溫散”，左金丸治肝火，一名回令丸，黃連六兩，吳茱萸一兩或半兩。中醫(yī)臨床常將Hp 相關(guān)性PU 辨證分型為肝胃不和證、脾胃虛寒證、脾胃濕熱證、肝胃郁熱證、胃陰不足證和胃絡(luò)瘀阻證，左金丸可用于治療肝胃郁熱型Hp相關(guān)性消化性潰瘍，黃連主瀉肝之實火，佐以少量吳茱萸從其性溫散之，脾胃虛寒者忌用。

龔汶等[10]總結(jié)左金丸治療Hp 機制主要體現(xiàn)在五個方面，包括抑制尿素酶活性、抑制生物膜合成、調(diào)節(jié)胃部菌群、調(diào)控microRNA 表達(dá)及其他分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。大鼠實驗研究發(fā)現(xiàn)左金丸可通過升高胃液pH、提高血清中PGE2 含量[11]、降低促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、抑制血漿皮質(zhì)醇（CORT）分泌[12]、降低胃黏膜TNF-α 含量[13]發(fā)揮保護胃黏膜的作用。黃連和其主成分小檗堿均能抑制Hp 生長與增殖，且實驗顯示黃連抑制Hp 作用明顯優(yōu)于小檗堿[14]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為Hp 相關(guān)性PU 基本病機為正虛邪實，治以扶正祛邪，扶正以補養(yǎng)后天脾胃為主，實驗顯示一定劑量黃連可顯著升高胃竇平滑肌組織CaM/MLCKmRNA 表達(dá)水平，起到調(diào)節(jié)胃腸運動和“健胃”作用[15]，可在一定程度上扶正。吳茱萸中檸檬苦素、吳茱萸次堿和1-甲基-2-壬基-4(1H)-喹諾酮在體外抑制Hp活性效果很顯著[16]，其中檸檬苦素可通過Nrf2/ARE 途徑改善吲哚美辛(INDO)誘導(dǎo)的腸道損傷和潰瘍[17]。

取左金丸作用靶點和Hp 相關(guān)性PU 關(guān)鍵致病基因的交 集 得 到EGLN3、CBFA2T3、HIF1A、HSP90AB1、UBE2D1、UNC45A、CUL9、LAMTOR5、HIPK4、BIRC5、CDK15、FHIT、CUL7 等關(guān)鍵基因。小檗堿和槲皮素是黃連與吳茱萸共同的活性成分，其中小檗堿可通過下調(diào)EGLN3 誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，EGLN3 抑制增加了細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27的表達(dá)[18]。HIF-1 是哺乳動物應(yīng)對缺氧反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧環(huán)境中，HIF-1A 可觸發(fā)自噬。HIF-1A 過表達(dá)，通常伴隨mTOR 途徑的抑制，進而影響胃黏膜上皮細(xì)胞自噬[19]。研究表明小檗堿通過調(diào)節(jié)HIF-1α 在結(jié)腸癌[20]和鼻咽癌[21]中發(fā)揮重要作用。小檗堿是一種新的HIF-1α 抑制劑，通過抑制mTOR 依賴的HIF-1α 蛋白合成來抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的糖代謝，下調(diào)HIF-1α 和TGF-β 的表達(dá)來抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。槲皮素對HIF-1α 的調(diào)節(jié)作用有雙面性，一方面抑制蛋白質(zhì)合成可減少HIF-1α 的積累[22]，另一方面抑制脯氨酸羥化酶可增強HIF-1α 蛋白的穩(wěn)定性。同時槲皮素通過HIF-1α 依賴性誘導(dǎo)p21WAF 抑制細(xì)胞增殖。有研究顯示槲皮素可調(diào)控HIF-1α[23]和BIRC5[24]在肝癌中的作用，誘導(dǎo)HIF-1α 在人HepG2 肝癌細(xì)胞中的表達(dá)和活性，通過下調(diào)BIRC5 的表達(dá)抑制人肝細(xì)胞癌（HCC）細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

GO 功能分析結(jié)果顯示，左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 涉及翻譯后蛋白修飾、微管細(xì)胞骨架組織、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、泛素依賴性蛋白分解代謝、上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化等生物學(xué)過程，主要發(fā)生于細(xì)胞溶質(zhì)、大分子復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)、泛素連接酶復(fù)合物、細(xì)胞核，分子功能包括泛素蛋白連接酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、鈣粘蛋白結(jié)合、ATP 結(jié)合、組蛋白脫乙酰酶結(jié)合等。GSEA 結(jié)果顯示，左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 涉及的信號通路包括自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、趨化因子信號通路、MAPK 信號通路、WNT 信號通路、肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)通路、癌癥相關(guān)通路。

WNT 信號通路主要由一個分泌的生長因子蛋白家族控制，該通路參與了很多重要的細(xì)胞系統(tǒng)[25]。腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白(Tipα)是Hp 新的致癌蛋白，可損傷胃黏膜，Tipα可以激活胃癌干細(xì)胞Wnt/β-catenin 信號通路，使下游靶基因Oct4 和Nanog 的mRNA 表達(dá)量增加[26]。NK 細(xì)胞可誘導(dǎo)caspase 依賴的凋亡，主要機制為表達(dá)FasL 和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的NK 細(xì)胞與表達(dá)死亡受體的靶細(xì)胞的相互作用[27]。MAPK 信號通路也和胃黏膜上皮損傷后的修復(fù)密切相關(guān)，是治療Hp 相關(guān)性潰瘍的重要靶點[28]。黃連素可從蛋白和mRNA 水平兩個方面顯著抑制由TNF-α 刺激產(chǎn)生的IL-6、IL-8 和MCP-1，進而下調(diào)MAPK 通路磷酸化水平[29]。檸檬苦素可降低NP 細(xì)胞中MAPK/NF-κB 信號通路和RIP1/RIP3/MLKL 壞死通路的激活[30]。吳茱萸次堿可使MAPK 通路失活，從而減少細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[31]。Hp 感染可引發(fā)慢性胃炎、慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、胃癌等疾病，癌癥信號通路亦與Hp 感染、致病及臨床治療顯著相關(guān)。

綜上所述，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)方法預(yù)測左金丸治療Hp 相關(guān)性PU 的分子機制，并進一步分析了分子機制中涉及的關(guān)鍵基因、信號通路，探討左金丸活性成分抗Hp 的主要分子機制，相關(guān)研究結(jié)果旨在為Hp 相關(guān)性PU的臨床診斷和治療提供理論指導(dǎo)，為今后Hp 相關(guān)性潰瘍的治療靶點選擇及新藥研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。