王鶴儒 尹 霞 夏彬鳳 鄭慶霜 崔明月

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心血管超聲中心，浙江 杭州，310000；2.吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，吉林 長春，130000；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院老年病科，吉林 長春，130000）

阻塞性睡眠呼吸暫停（obstructive sleep apnea，OSA）是臨床常見的睡眠呼吸紊亂性疾病，心臟是其最常累及的主要臟器之一，OSA 已被認(rèn)為是減少心血管疾病的公共健康干預(yù)的靶點(diǎn)之一[1]。OSA 所致的反復(fù)氧去飽和事件即慢性間歇性乏氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）是其主要致病因素，而氧化應(yīng)激（oxidstive stress，OS）是CIH 所致心臟損傷的主要發(fā)病機(jī)制之一[2-3]。

金屬硫蛋白（Metallothionein，MT）是一種在心臟中高表達(dá)的內(nèi)源性抗氧化蛋白，其表達(dá)可由人體必需微量元素鋅直接誘導(dǎo)[4]。除此之外，鋅離子可在氧化應(yīng)激條件下通過促使穩(wěn)定狀態(tài)的核因子E2 相關(guān)因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor，Nrf2）水平上升來上調(diào)MT 的表達(dá)[5-6]。研究表明MT 表達(dá)上調(diào)對CIH 所導(dǎo)致的心臟損傷發(fā)揮保護(hù)性作用，而其作用機(jī)制鮮有闡明[7-10]。綜上，我們模擬CIH 環(huán)境建立心臟損傷模型，并對部分小鼠予以硫酸鋅及SFN 干預(yù)，通過檢測小鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能、心肌結(jié)構(gòu)組織、相關(guān)蛋白因子的表達(dá)等指標(biāo)，探究鋅及SFN 是否具有抗CIH 引起的心肌損傷的作用，并初步探索其作用機(jī)制，為臨床尋找更好的預(yù)防和治療OSA 及其相關(guān)心血管疾病的藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

昆明小鼠，8 周齡，雄性，體質(zhì)量20～25 g，購買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，蘿卜硫素（B20805-20 mg，源葉生物，中國），硫酸鋅（S22124-500 g，源葉生物，中國），Nrf2 抗體（12721T，CST，美國），MT 抗體（ab235036，abcam，美 國），Akt1 抗 體（2938T，CST，美 國），Akt2 抗 體（5239S，CST，美國），天狼猩紅染液（Solarbio，中國）， 氧流控制系統(tǒng)及氧循箱（A84XOV，BioSpherix，美國），電泳儀（DYY-7C，北京，北京六一），酶標(biāo)儀（ELX-800，美國，BIOTEK），超聲心動(dòng)儀（Philips，SONOS 5500，中國）。本研究通過吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CIH 模型構(gòu)建及SFN、硫酸鋅治療模型構(gòu)建

選取體質(zhì)量為20～25 g 的健康小鼠，隨機(jī)分為對照組、CIH 組、0.9%氯化鈉溶液組、CIH+硫酸鋅治療組、CIH+SFN治療組，每組5 只。CIH 組缺氧模式如下：20.9%及8%氧濃度每120 秒交換一次，暴露2 h/d，連續(xù)8 周。對照組小鼠：放置在室內(nèi)空氣下相似的培養(yǎng)箱中。硫酸鋅及SFN 治療模型：在CIH 第二天分別給予硫酸鋅（5 mg/kg）及SFN（0.5 mg/kg）腹腔注射，隔天注射，持續(xù)給藥8 周。0.9%氯化鈉溶液組：在CIH 第二天給予同等劑量的0.9%氯化鈉溶液腹腔注射。

1.2.2 心臟功能評價(jià)

在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將所有小鼠予以戊巴比妥鈉腹腔注射（40 mg/kg）將其麻醉。采用Philips SONOS 5500 高效超聲系統(tǒng)監(jiān)測心臟功能。取仰臥位固定小鼠，利用30 MHz 高頻探頭采集胸骨旁長軸切面，記錄M 型超聲心動(dòng)圖像。

1.2.3 天狼猩紅染色

在小鼠被處死后，將部分心臟固定于10%福爾馬林中；經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明及石蠟包埋后制作厚度為3 μm厚的石蠟切片，用天狼猩紅飽和苦味酸水溶液進(jìn)行染色。使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察及拍照。

1.2.4 免疫組化

將制好的3 um 厚的石蠟切片進(jìn)行脫蠟及水化，對抗原進(jìn)行修復(fù)后用3%的氧化氫室溫孵育25 min，滴加10%山羊血清覆蓋組織，并置于室溫封閉30 min，將稀釋好的一抗滴入其中4℃過夜，復(fù)溫后滴入稀釋的二抗室溫孵育50 min，復(fù)染（蘇木素）后置入不同濃度的乙醇溶液中進(jìn)行脫水，最后進(jìn)行二甲苯透明及樹膠封片。

1.2.5 免疫印記（Western-blot）

提取各組小鼠的新鮮心肌組織總蛋白。根據(jù)蛋白定量的結(jié)果加入適量上樣緩沖液，稀釋配平后制成蛋白質(zhì)樣品。取適量樣品上樣至SDS-PAGE 凝膠；使用恒壓電泳使蛋白質(zhì)進(jìn)入分離膠后加大電壓至120 V，預(yù)計(jì)目的蛋白分離后停止電泳；將SDS-PAGE 凝膠上蛋白質(zhì)樣品電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；分別使用抗MT、Nrf2、Akt1、Akt2和內(nèi)參β-actin 抗體4℃孵育過夜，TBST 洗滌10 min，重復(fù)3次；二抗室溫孵育1 h,TBST 洗滌10 min，重復(fù)3 次；滴加混好的ECL 發(fā)光液，室溫孵育3 min 后棄去，使用保鮮膜將條帶封存在暗夾后于暗室顯影。應(yīng)用圖像處理分析軟件（Image J）對各組小鼠心肌的MT、Nrf2、Akt1、Akt2 和β-actin 條帶灰度值進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 硫酸鋅及SFN 可改善CIH 導(dǎo)致的心臟結(jié)構(gòu)及功能變化

超聲心動(dòng)圖結(jié)果表明，在CIH 暴露8 周后，CIH+N.S 組與對照組相比，代表心臟結(jié)構(gòu)的指標(biāo)左心室內(nèi)徑（left ventricle cavitary dimensions，LVID）明顯升高，代表心臟收縮功能的指標(biāo)縮短分?jǐn)?shù)（fractional shortening，F(xiàn)S）和射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）明顯降低，上述指標(biāo)均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；硫酸鋅及SFN 干預(yù)后，兩組LVID 水平低于CIH+N.S 組，EF、FS 水平高于CIH+N.S 組，上述指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1。

2.2 CIH 導(dǎo)致小鼠心肌心肌纖維化

天狼猩紅染色將心肌中的膠原成分染成紅色，其余成分染成黃色。利用Image J 軟件測量心肌膠原纖維陽性區(qū)占所觀察視野的面積比，結(jié)果顯示：對照組小鼠心肌組織內(nèi)大血管、小血管周圍及心肌質(zhì)間可見少許膠原纖維沉積，CIH 組及CIH+N.S 組小鼠心肌組織內(nèi)大小血管周圍可見明顯的膠原纖維沉積，SFN 及硫酸鋅干預(yù)組小鼠心肌內(nèi)膠原組織沉積較CIH+N.S 組有所減少，見圖2。

2.3 硫酸鋅、SFN 上調(diào)MT、Nrf2、AKT2 的表達(dá)

WB 及免疫組化的結(jié)果表明，與對照組相比，CIH+N.S 組小鼠心肌組織中MT、Nrf2 及Akt2 在心肌中表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與CIH+N.S 組相比，硫酸鋅及SFN干預(yù)組小鼠心臟組織中MT、Nrf2 及Akt2 的表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖3、圖4、圖5。

圖3 硫酸鋅及SFN 上調(diào)MT 表達(dá)

圖4 硫酸鋅及SF N 上Nrf2 表達(dá)

圖5 硫酸鋅及SFN 上Akt2 表達(dá)

3 討論

OSA 是一種睡眠呼吸障礙性疾病，其導(dǎo)致的反復(fù)氧去飽和事件即CIH 可對機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)造成損害，在眾多并發(fā)癥中由CIH 導(dǎo)致的心肌損傷是OSA 最為常見的并發(fā)癥之一。CIH是一種長期、慢性、間歇性、夜間乏氧現(xiàn)象，心肌細(xì)胞在反復(fù)的缺氧/復(fù)氧環(huán)境中會產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）及 活 性氮（reactive nitrogen species，RNS），當(dāng)超過機(jī)體的清除能力或機(jī)體的抗氧化能力下降不能將過量的ROS/RNS 清除時(shí)則會引起氧化和抗氧化失衡，由此導(dǎo)致氧化應(yīng)激。未被清除的ROS/RNS 可導(dǎo)致心肌中脂質(zhì)、DNA和蛋白質(zhì)的損傷以及酶的失活，這將引起心肌細(xì)胞迅速的凋亡及壞死，最終導(dǎo)致心肌肥厚及心肌重塑。因此氧化應(yīng)激（oxidstive stress，OS）是CIH 所致心臟損傷的主要發(fā)病機(jī)制之一。然而迄今為止，CIH 導(dǎo)致的心肌損傷的發(fā)病機(jī)制并未完全闡明，治療方法亦較少，因此明確其發(fā)病機(jī)制及新的藥物和治療方法具有十分重要的意義。

MT 是一種低分子量、內(nèi)源性抗氧化蛋白，在人體內(nèi)普遍存在，而在心臟相對高表達(dá)。MT 不僅可以直接清除自由基，還可以通過多條細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制氧化應(yīng)激。大量研究表明，MT 可抵御多種病理狀態(tài)及物理因素如糖尿病、肥胖、缺血再灌注、膿毒血癥、吸煙、低溫等導(dǎo)致的心臟損傷，是一種強(qiáng)大而有效的內(nèi)源性心臟保護(hù)蛋白[11-12]。然而尚無證據(jù)表明在CIH 條件下補(bǔ)鋅是否可誘導(dǎo)MT 表達(dá)并有效預(yù)防CIH 導(dǎo)致的心臟損傷。本研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)鋅能顯著改善CIH 所導(dǎo)致的心臟結(jié)構(gòu)改變及心功能低下，減少膠原纖維在心肌中沉積，明顯減輕了心肌纖維化程度。而在8 周時(shí)，與對照組相比，CIH組及CIH+N.S 組MT 的表達(dá)出現(xiàn)明顯下降，而在硫酸鋅與SFN 干預(yù)后MT 的表達(dá)明顯升高，因此我們認(rèn)為，鋅及SFN對CIH 導(dǎo)致的心臟損傷發(fā)揮保護(hù)性作用可能依賴于上調(diào)MT表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

研究表明MT 可由多種物質(zhì)通過多條途徑誘導(dǎo)表達(dá)[4]。其中人體必需微量元素鋅被認(rèn)為是內(nèi)源性MT 的誘導(dǎo)劑之一，可有效誘導(dǎo)其在體內(nèi)的表達(dá)[13]。首先，MT 由鋅直接誘導(dǎo)表達(dá)的經(jīng)典方式為鋅離子經(jīng)ZIP 轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞后激活金屬反應(yīng)元件轉(zhuǎn)錄因子1（metal regulatory transcription factor 1，MTF-1），隨后MTF-1 易位進(jìn)入細(xì)胞核,與MT 基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合,上調(diào)MT 基因轉(zhuǎn)錄使其表達(dá)增加[14-15]。除此之外，鋅離子可作為第二信使，將細(xì)胞的內(nèi)源性“危險(xiǎn)信號”傳遞給Nrf2 負(fù)調(diào)控因子Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白（Kelch-1ike ECH- associated protein l，Keap1），而鋅離子與Keap1 接觸后會導(dǎo)致其構(gòu)象改變，從而抑制Nrf2 的泛素化，細(xì)胞內(nèi)Nrf2 水平上調(diào)使穩(wěn)定狀態(tài)的Nrf2 水平上升進(jìn)而上調(diào)MT 等一系列抗氧化蛋白的表達(dá)[5-6]。因此，本研究在檢測MT 蛋白水平的基礎(chǔ)上還進(jìn)一步檢測了各組小鼠心肌組織中Nrf2 的表達(dá)情況。結(jié)果表明，硫酸鋅及SFN 干預(yù)組Nrf2 水平亦上調(diào)。首先對于SFN 來說，其作為Nrf2 的激活劑可直接使穩(wěn)定狀態(tài)的Nrf2 水平上調(diào)，從而增加其下游抗氧化蛋白MT 的表達(dá)；而對于鋅來說，結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們認(rèn)為其有可能通過直接及間接兩種方式影響MT 的表達(dá)。

另有實(shí)驗(yàn)證明MT 減輕CIH 所致心肌細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)、心臟結(jié)構(gòu)改變及心功能下降等是通過激活A(yù)kt 信號通路實(shí)現(xiàn)[16]；而MT 可通過PI3K/Akt 通路與Nrf2 協(xié)同對CIH 導(dǎo)致的心臟損傷發(fā)揮保護(hù)性作用[9-10]。因此我們認(rèn)為MT 的心臟保護(hù)作用的發(fā)揮與Akt 信號通路密切相關(guān)，然而Akt 有三種亞型，每個(gè)亞型對于心臟的作用不盡相同。CIH 條件下到底是哪一類型的Akt 發(fā)揮主要作用尚不明確，因?yàn)锳kt1 和Akt2 均在心臟中具有相對高表達(dá)，Akt3 僅在心臟中的低水平表達(dá)，且其主要功能與大腦的生長及功能密切相關(guān)，于是我們檢測了小鼠心肌中的總Akt1 和Akt2 的蛋白水平[17]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在SFN 及硫酸鋅治療組中Akt2 的表達(dá)均明顯上調(diào)。由此可見，Akt2 可能在MT 減輕CIH 導(dǎo)致的心臟損傷的過程中發(fā)揮了主要作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MT 在CIH 導(dǎo)致的心肌損傷中發(fā)揮了保護(hù)性作用，補(bǔ)鋅可能會直接及間接地誘導(dǎo)MT 的表達(dá)，SFN 作為Nrf2 的激活劑可能間接上調(diào)MT 的表達(dá)，而Akt 信號通路可能參與了MT 的保護(hù)性作用。本研究為CIH 導(dǎo)致的心肌損傷的發(fā)病機(jī)制提供了理論依據(jù)，為OSA 導(dǎo)致的心臟相關(guān)并發(fā)癥的臨床治療提供了一種潛在的候選藥物。