史莉萍 李 文 林沁華

（贛南衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系，江西 贛州，341000）

對乙酰氨基酚是廣泛應(yīng)用于解熱鎮(zhèn)痛的一大類非甾體類抗炎藥， 但對乙酰氨基酚的中間代謝產(chǎn)物N-乙酰苯醌亞胺（N-acetyl-1，4-benzoquinoneimine，NAPQI）具有肝細胞毒性[1]。因患者不遵醫(yī)囑、誤服或者過量服用等，可造成急性肝損傷（acute liver injury，ALI）甚至肝衰竭，且由對乙酰氨基酚引發(fā)的ALI 呈上升趨勢。對乙酰氨基酚已成為導(dǎo)致藥物性肝損傷最常見的藥物之一，并成為歐美等發(fā)達國家引起急性肝衰竭的首要因素[2]。但是目前臨床上用于治療對乙酰氨基酚所致ALI 的有效藥物和措施不多，且公認的解毒藥N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）具有一系列不良反應(yīng)[3-5]。因此，尋找理想的肝保護藥物，降低對乙酰氨基酚在使用中的肝臟毒性具有重要的臨床意義。甘草是豆科植物甘草的根及塊狀莖，是一種常見的中藥，有清熱解毒、補脾益氣、鎮(zhèn)咳怯痰的作用，而甘草酸苷為其主要活性成分之一?，F(xiàn)代研究表明甘草酸苷具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗病毒、保護肝臟的作用[6-7]。已有學(xué)者研究提示甘草酸苷對對乙酰氨基酚介導(dǎo)的肝損傷具有保護作用[8-9]，但其作用機制仍有待深入探討。因此，本研究通過實驗驗證甘草酸苷對對乙酰氨基酚所致ALI 小鼠的肝臟保護作用并探討其具體機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康昆明種雌性小鼠24 只、雄性小鼠24 只，SPF 級，體質(zhì)量25～35 g，中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。實驗期間均遵守本單位實驗動物中心的管理規(guī)范照料和使用原則。

1.2 藥品與試劑

對乙酰氨基酚注射液（生產(chǎn)企業(yè)：合肥中龍神力動物藥業(yè)有限公司，獸藥字120152532，規(guī)格10 mL:1 g），取適量對乙酰氨基酚溶于少量氯化鈉溶液，然后補足氯化鈉溶液配制成400 mg/mL 溶液備用[10]；注射用甘草酸苷（ 生產(chǎn)企業(yè)：瑞陽制藥有限公司，國藥準字H20060537）；聯(lián)苯雙酯（生產(chǎn)企業(yè)：浙江海翔川南藥業(yè)有限公司，國藥準字H20153110）。藥用級橄欖油（生產(chǎn)企業(yè)：通化德濟參藥業(yè)有限公司，規(guī)格：500 mL/瓶）；0.9%氯化鈉溶液、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）測試盒（賴氏法）（規(guī)格：96T）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）測試盒（微板法）（規(guī)格：96T）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）測試盒（微板法）（規(guī)格：96T）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）測試盒（規(guī)格：96T）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）測試盒（規(guī)格：96T）、還原型谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒（微板法）（規(guī)格：96T）、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測試盒（羥胺法）（規(guī)格：100管/96 樣）、丙二醛(A)測定試劑盒(TBA 法)（規(guī)格：100 管/96樣）；免疫組化用蘇木素-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染液（規(guī)格：50ml*2）（生產(chǎn)企業(yè)：南京建成生物工程研究所有限公司）。

1.3 主要設(shè)備與儀器

醫(yī)用離心機（生產(chǎn)企業(yè)：湖南赫西儀器裝備有限公司，型號：DD5 型）；酶標儀（生產(chǎn)企業(yè)：南昌普朗醫(yī)用設(shè)備有限公司，型號：DNM-9602 型）；自動脫水儀（生產(chǎn)企業(yè)：北京中瑞祥科技有限公司，型號：ZRX-29768 型）；石蠟切片機（生產(chǎn)企業(yè)：美國Thermo Fisher Scientific 公司，型號：HM340E 型）；光學(xué)顯微鏡（生產(chǎn)企業(yè)：日本Olympus 株式會社，型號：CX43型）；蛋白質(zhì)凝膠電泳儀（生產(chǎn)企業(yè)：北京六一生物科技有限公司，型號：DYCZ-24DN 型）。

1.4 建模、分組給藥與實驗動物處理

對乙酰氨基酚腹腔注射建立ALI 小鼠模型，質(zhì)量濃度400 mg/mL、劑量1 mL/100 g 小鼠體質(zhì)量，其中對乙酰氨基酚配置方法：取適量對乙酰氨基酚溶于少量氯化鈉溶液，然后補足氯化鈉溶液，使質(zhì)量終濃度為400 mg/mL[10]。將造模成功的小鼠采用隨機數(shù)表法分為模型組、聯(lián)苯雙酯組、甘草酸苷低劑量組、甘草酸苷中劑量組、甘草酸苷高劑量組，另設(shè)置對照組（建模時對照組僅腹腔注射1mL/100 g 小鼠體質(zhì)量的氯化鈉溶液），各8 只。聯(lián)苯雙酯組予以60 mg/kg 聯(lián)苯雙酯灌胃，甘草酸苷低、中、高劑量組分別予以50、100、150 mg/mL甘草酸苷灌胃（劑量均為1 mL/100 g 小鼠體質(zhì)量，其中甘草酸苷低劑量組為臨床等效劑量，甘草酸苷中劑量組為臨床等效劑量×2，甘草酸苷高劑量組為臨床等效劑量×4），聯(lián)苯雙酯和甘草酸苷均以四氯化碳橄欖油為溶劑。給藥24 h 后取眼眶靜脈血，后頸椎脫臼法處死，迅速剝離肝臟組織。血樣用于檢測肝功能、炎性反應(yīng)指標；肝臟組織用于肝臟病理觀察。

1.5 肝功能指標及炎癥指標檢測

將小鼠血液樣本以4 000 r/min 離心10 min 分離血清。按照試劑盒說明書，酶標儀檢測各孔吸光光度值，根據(jù)標準曲線計算各組血清ALT、AST、LDH、TNF-α、IL-6 水平。

1.6 肝組織病理變化觀察

取各組小鼠左肝葉肝臟組織，制成0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm 組織塊，采用10%甲醛溶液固定。24 h 后自動脫水儀脫水，后石蠟包埋、切片（層厚5 μm）。恒溫烤干，以二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，采用HE 染色。于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 肝組織氧化應(yīng)激測定

取各組小鼠肝組織，冰上勻漿，加入0.9 %氯化鈉溶液，3 000 r/min 離心10 min，取上清。按照試劑盒說明書，測定肝組織GSH、SOD。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 25.0 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料經(jīng)檢驗均符合正態(tài)分布，采用（±s）表示，多組計量資料比較采用單因素方差分析，比較采用t 檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 聯(lián)苯雙酯和甘草酸苷對小鼠肝功能的影響

與對照組比較，模型組血清ALT、AST、LDH 水平均升高（P<0.05）；與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組和甘草酸苷低、中、高劑量組血清ALT、AST、LDH 水平均降低（P<0.05）；與聯(lián)苯雙酯組比較，甘草酸苷低劑量組血清ALT、AST、LDH 水平均升高（P<0.05），甘草酸苷高劑量組血清ALT、AST、LDH 水平均降低（P<0.05），見圖1。

圖1 各組小鼠血清肝酶濃度

2.2 聯(lián)苯雙酯和甘草酸苷對小鼠血清炎性因子的影響

與對照組比較，模型組血清TNF-α、IL-6 水平均升高（P<0.05）；與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組和甘草酸苷低、中、高劑量組血清TNF-α、IL-6 水平均降低（P<0.05）；與聯(lián)苯雙酯組比較，甘草酸苷低劑量組血清TNF-α、IL-6 水平均升高（P<0.05），甘草酸苷高劑量組血清TNF-α、IL-6 水平均降低（P<0.05），見圖2。

圖2 各組小鼠炎癥因子水平

2.3 聯(lián)苯雙酯和甘草酸苷對小鼠肝組織病理的影響

對照組中肝小葉結(jié)構(gòu)完整，中央靜脈形態(tài)完好，肝竇未見充血或擴張，肝細胞形態(tài)及排列正常，未見明顯空泡樣變和水樣變，為0 級損傷。相較對照組，模型組小鼠肝組織HE染色切片有明顯的肝小葉結(jié)構(gòu)改變和肝索間隙擴張，中央靜脈淤血，部分區(qū)域可觀察到肝細胞脂肪樣變、水樣變等病理性改變，并伴有炎性反應(yīng)細胞浸潤，達到Ⅲ級肝損傷。與模型組相比，甘草酸苷低劑量組肝組織結(jié)構(gòu)改變減輕，肝小葉形態(tài)變化減輕，中央靜脈附近和肝細胞間有部分炎性反應(yīng)細胞浸潤；甘草酸苷中劑量組和聯(lián)苯雙酯組肝組織結(jié)構(gòu)和肝小葉形態(tài)輕微改變，中央靜脈附近和肝細胞間少有炎性反應(yīng)細胞浸潤；甘草酸苷高劑量組肝組織結(jié)構(gòu)和肝小葉形態(tài)接近正常，中央靜脈附近和肝細胞間基本沒有炎性反應(yīng)細胞浸潤，未見肝細胞脂肪樣變、水樣變，見圖3。

圖3 小鼠肝組織HE 染色切片（×100）

2.4 聯(lián)苯雙酯和甘草酸苷對小鼠肝組織GSH、SOD 的影響

與對照組比較，模型組GSH、SOD 活性均降低（P<0.05），MDA 活性升高（P<0.05）；與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組和甘草酸苷低、中、高劑量組GSH、SOD 活性均升高（P<0.05），MDA 活性均降低（P<0.05）；與聯(lián)苯雙酯組比較，甘草酸苷低劑量組GSH、SOD 活性均降低（P<0.05），MDA 活性均升高（P<0.05），甘草酸苷高劑量組GSH、SOD 活性均升高（P<0.05），MDA 活性降低（P<0.05），見圖4、5。

圖4 各組小鼠肝組織GSH、SOD 活性

圖5 各組小鼠肝組織MDA 活性

3 討論

對乙酰氨基酚是臨床常用的解熱鎮(zhèn)痛藥之一，過量使用將導(dǎo)致其毒性代謝產(chǎn)物在體內(nèi)蓄積，進而導(dǎo)致肝損傷甚至肝衰竭[11-13]。聯(lián)苯雙酯是目前常用的藥物性肝損傷治療藥物，通過一定的抗氧化及免疫調(diào)節(jié)作用，達到促進肝細胞再生并保護肝細胞，增強肝臟解毒功能，減輕肝臟的病理損傷，減輕因四氯化碳及硫代乙酰胺引起的血清ALT 升高，改善肝功能的目的。因此本研究采用該藥物作為陽性對照。目前，甘草酸苷主要用于治療慢性肝病、改善肝功能異常[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，甘草酸苷可以緩解雷公藤多苷所致的肝損傷[15]，其主要的機制包括減輕雷公藤多苷所致的細胞色素氧化酶CYP2B1的減少。本研究發(fā)現(xiàn)甘草酸苷對于對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的急性肝損傷也有保護作用。組織學(xué)切片顯示，對乙酰氨基酚所致肝損傷主要體現(xiàn)在肝細胞的脂肪變性和淋巴細胞的浸潤。血清中升高的炎性反應(yīng)指標，TNF-α 和IL-6 反映了對乙酰氨基酚導(dǎo)致的炎性反應(yīng)水平的升高。免疫細胞浸潤及一系列免疫反應(yīng)的激活是肝損傷的一個重要環(huán)節(jié)[16-17]。研究顯示，免疫浸潤和炎性反應(yīng)與肝細胞的凋亡壞死常相互伴行[18]。使用甘草酸苷后，肝細胞的損傷及免疫浸潤水平明顯減輕。

對乙酰氨基酚的毒性代謝產(chǎn)物導(dǎo)致肝損傷的重要機制是其引起細胞及組織內(nèi)過度的氧化應(yīng)激反應(yīng)[19]，其通過耗竭胞內(nèi)的還原型物質(zhì)GSH，導(dǎo)致氧化反應(yīng)無法被抗衡，進而產(chǎn)生一系列應(yīng)激反應(yīng)、線粒體功能紊亂及細胞死亡[20]。NAC 正是具有強大的抗氧化作用，是目前緩解對乙酰氨基酚最有效的藥物。SOD 是細胞抗氧化體系的重要組成之一，而MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，本研究結(jié)果顯示，甘草酸苷可有效緩解對乙酰氨基酚導(dǎo)致的GSH 及SOD 活性降低，有望取代NAC 成為緩解對乙酰氨基酚引起的肝內(nèi)氧化應(yīng)激水平的臨床藥物[21-23]。

綜上所述，甘草酸苷能夠減輕對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的ALI，對其肝功能有保護作用，且還可減輕炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激和肝組織病理改變。本研究為臨床治療對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的ALI 提供了一種新的藥物，但其是否具有其他作用機制、在臨床中應(yīng)用的有效性及安全性等仍需要進一步探討，需作為后期的研究方向。