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        高良姜-香附提取純化工藝的研究*

        2024-01-04 13:36:50黃玉芳譚銀豐李永輝戴初雄唐偉森李海龍
        廣州化工 2023年15期
        關(guān)鍵詞:高良姜濃縮液香附

        黃玉芳,譚銀豐,李永輝,戴初雄,唐偉森,李海龍

        (1 海南醫(yī)學(xué)院,海口市黎族醫(yī)藥重點實驗室,海南 ???571199;2 海南壽南山參業(yè)有限公司,海南 ???570100)

        良附方出自《良方集腋》,高良姜性辛熱,功效可溫胃散寒,香附性辛甘,功效可疏肝解郁、理氣寬中[1],二者常用于治療胃炎、胃潰瘍、胃癌等。高良姜是姜科山姜屬植物高良姜(AlpiniaofficinarumHance)的干燥根莖,其主要化學(xué)成分有黃酮類、揮發(fā)油類和二芳基庚烷類[2]等。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[3-4],高良姜具有抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛、抗?jié)?、抗菌等藥理作用。香附為莎草科植物莎?CyperusrotundusL.)的干燥根莖,其化學(xué)成分有揮發(fā)油類、黃酮類、生物堿類、三萜及甾醇類,具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗抑郁等優(yōu)秀的藥理作用[5]。

        大孔樹脂是一種有機高聚物吸附劑,具有成本低、吸附量大、易洗脫、可再生利用等優(yōu)點,常被用于中藥的分離純化[6]。大多數(shù)黃酮類成分呈弱極性,因此純化黃酮類成分目前以AB-8、D101、HPD類居多[7-9]。

        1 材料與儀器

        Prominence UFLC液相色譜儀,日本島津公司;通過Turbo V離子源接口串聯(lián)AB‐SCIEX API 4000+串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀,Analyst軟件控制數(shù)據(jù)采集和處理,美國AB公司;XS105DU十萬分之一電子分析天平,瑞士梅特勒托利多公司;Lab Tower EDI15超純水系統(tǒng),賽默飛公司;KQ‐100v型超聲波清洗器,昆山市超聲儀有限公司;甲醇和甲酸,阿拉丁控股集團有限公司;乙腈,默克股份兩合公司;超純水(自制);高良姜素、山奈素和α-香附酮,成都曼斯特生物科技有限公司;諾卡酮,天津希恩思生化科技有限公司;另外DPHA(5-羥基-7-(4-羥基-3-甲氧苯基)-1-苯-3-庚酮)、DPHB(7-(4′-羥基-3′-甲基苯基)-1-苯庚基-4-烯-3-酮)和DPHC(5-羥基-1,7-雙苯-3-庚酮)(對照品),海南醫(yī)學(xué)院重點實驗室提供(自制);高良姜和香附藥材,海南壽南山參業(yè)有限公司;AB-8樹脂、D101樹脂,西亞試劑;HPD600樹脂,源葉生物。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 含量測定方法

        2.1.1 色譜條件

        Kinetex?XB-C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,2.6 μm),柱溫40 ℃,流速0.35 mL/min,進樣量3 μL,流動相為乙腈(A)-0.2%甲酸水(B),洗脫梯度(0~1.5 min,10%A;1.5~4.5 min,10%~90%A;4.5~5.5 min,90%A;5.5~6 min,90%~10%A;6~7 min,10%A)見圖1。

        圖1 對照品LC-MS/MS色譜圖(A)和供試品LC-MS/MS色譜圖(B)Fig.1 LC-MS/MS chromatogram of reference solution (A) and LC-MS/MS chromatogram of test solution (B)

        2.1.2 質(zhì)譜條件

        電噴霧離子源(ESI),正離子電離模式,碰撞氣4 psi,簾氣35 psi,GS1和GS2均為50 psi,噴霧電壓5 500 V,噴霧溫度550 ℃,多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)參數(shù)見表1。

        表1 化合物優(yōu)化多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)參數(shù)Table 1 Multi-reaction monitoring(MRM)parameters for each compound optimization

        2.1.3 溶液的制備

        對照品溶液的制備 精密稱取高良姜素、山奈素、α-香附酮、諾卡酮、DPHA、DPHB、DPHC對照品1 mg加1 mL甲醇得標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用甲醇稀釋配制成10、20、50、100、200、500、800、1 000、1 250 ng/mL的混合對照品溶液。

        供試品溶液的制備 精密稱定浸膏5 mg,加1 mL甲醇超聲30 min溶解,用0.22 μm微孔濾膜過濾,上樣分析前,將其稀釋100倍。

        2.1.4 線性范圍

        取不同濃度的混合對照品溶液,按質(zhì)譜條件進行測定,以峰面積平均值為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo)計算7個成分的回歸方程,線性范圍:10~1 250 ng/mL,結(jié)果見表2。

        表2 7個成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)Table 2 Regression equation and correlation coefficient of 7 components

        表3 正交試驗考察結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test

        表4 綜合評分方差分析Table 4 Analysis of variance of comprehensive score

        2.1.5 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性

        取某一質(zhì)量濃度的混合對照品溶液,按質(zhì)譜條件分別連續(xù)進樣6次,計算山奈素、高良姜素、諾卡酮、α-香附酮、DPHA、DPHB、DPHC的峰面積RSD分別為7.36%、3.94%、1.89%、6.21%、9.19%、2.29%、1.66%,表明儀器精密度良好。取一批樣品,按2.1.3項下制備供試品溶液,分別于0,2,4,6,8,12,24 h,計算山奈素、高良姜素、諾卡酮、α-香附酮、DPHA、DPHB、DPHC的濃度RSD分別為5.82%、3.19%、7.54%、13.03%、11.16%、8.45%、14.68%,表明各成分在24h內(nèi)穩(wěn)定。平行制備6份供試品溶液,計算山奈素、高良姜素、諾卡酮、α-香附酮、DPHA、DPHB、DPHC的含量(mg/g)分別為2.50、10.98、1.17、0.81、2.68、4.82、2.41,RSD為6.34%、2.21%、4.73、5.15%、9.22%、4.59%、8.95%。

        2.1.6 加樣回收率

        按2.1.3供試品溶液制備項下,平行制備6份,加入已知濃度的各對照品適量,進樣測定,計算回收率,山奈素、高良姜素、諾卡酮、α-香附酮、DPHA、DPHB、DPHC的平均加樣回收率分別為94.73%、109.10%、91.09%、107.94%、102.81%、116.51%、111.21%,RSD分別為9.46%、6.49%、9.81%、10.74%、8.20%、1.31%、8.72%,說明該方法準(zhǔn)確可靠。

        2.2 提取工藝

        2.2.1 正交實驗設(shè)計

        參考文獻[10],選取醇濃度(A):50%、70%、90%,提取時間(B):1 h、1.5 h、2 h,料液比(C):1∶6、1∶8、1∶10,提取次數(shù)(D):1次、2次、3次,分別設(shè)3個水平。稱取高良姜-香附藥材各100 g,按正交設(shè)計進行實驗。采用多指標(biāo)綜合評分法,權(quán)重系數(shù)分別為出膏率(0.50)、高良姜素(0.05)、山奈素(0.05)、諾卡酮(0.10)、α-香附酮(0.15)、DPHA、DPHB、DPHC均為0.05進行綜合評分。

        綜合評分=0.50Dij+0.05Dij+0.05Dij+0.10Dij+0.15Dij+0.05Dij+0.05Dij+0.05Dij(Xij表示第i次試驗中第j個指標(biāo)的測定值,Dij表示第j個指標(biāo)下第i個測定值的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)(Dij= Xij/(Xj)max,其中i=1,2,…,9;j=1,2,3,4,5,6,7,8)。

        根據(jù)結(jié)果可知,醇提最優(yōu)工藝條件為A2B3C3D2,即醇濃度70%,提取時間2 h,料液比1∶10,提取次數(shù)2次。影響提取工藝的影響因素大小順序為醇濃度>提取時間>料液比>提取次數(shù)。由于料液比為1∶8和1∶10其均值相差僅為0.018,最終確定其最優(yōu)工藝為A2B3C2D2,即條件為70%乙醇,提取時間2 h,料液比1∶8,提取次數(shù)2次。

        2.2.2 驗證實驗

        按優(yōu)化條件進行3批驗證實驗,結(jié)果見表5,說明該工藝條件穩(wěn)定可行。

        表5 驗證實驗結(jié)果Table 5 Result of verification experiment

        2.3 大孔樹脂純化工藝

        2.3.1 篩選大孔樹脂類型

        參考文獻[11],稱取預(yù)處理好的D101型(非極性)、AB-8型(弱極性)、HPD-600型(極性)大孔樹脂各5 g,于具塞錐形瓶中,加入濃縮好的提取液50 mL,室溫下于搖床上振搖2 h后取上清液,測定7個成分的濃度,計算各樹脂的吸附率。將多余的上清液棄掉,各加入50 mL95%的乙醇,室溫下于搖床上振搖2 h,取上清液,測定7個成分的濃度,計算解吸率,見表6。

        表6 大孔樹脂類型考察Table 6 Investigation of macroporous resin types

        由表6可知,DPH-600型大孔樹脂吸附能力較其它兩種略差,D1010型和AB-8型大孔樹脂對7個成分的吸附能力相差不大,但D101型的解吸能力較AB-8型差。因此,選擇AB-8型大孔樹脂作為純化填料。

        2.3.2 上樣濃度

        稱取高良姜-香附各100 g,按正交實驗優(yōu)化的最佳工藝進行提取,取三份400 mL提取液按1/2、3/8、1/4進行濃縮,將濃縮液靜置過夜,過濾,測各濃縮液中7個成分的含量,見圖2。

        圖2 上樣濃度對純化效果的影響Fig.2 Effect of sample concentration on purification efficiency

        由圖2可知,隨著濃縮比例的增加,乙醇濃度不斷減小,7個成分的含量均有所下降,濃縮比例為1/4時各成分的含量明顯較低,濃縮比例為1/2和3/8時各成分含量相差不大,均占原提取液的50%以上,但由于濃縮比例為3/8時濃縮液比較渾濁,對于后續(xù)實驗操作造成麻煩,為提高效率,選擇1/2濃縮液作為上樣液,酒精計測得此時的醇濃度為40%,濃縮液質(zhì)量濃度為0.15 g/mL。

        2.3.3 最大上樣量

        稱取大孔樹脂5.0 g,預(yù)處理后,濕法裝柱,柱體積約10 mL,將濃縮好的提取液每10 mL一份,按1 BV·h-1的流速上樣,10 mL收集一份流出液,共收集10份,測定流出液中7個成分的含量,繪制泄漏曲線,見圖3。

        圖3 AB-8大孔吸附樹脂提取液泄漏曲線Fig.3 Leakage curve of extract solution of AB-8 macroporous resin

        流出液濃度比上樣液濃度超出10%即認為泄漏。40%醇濃度藥液作為上樣溶液,上樣份數(shù)達到8份時,流出液中檢測到DPHA泄漏,表明達最大上樣量。說明5 g AB-8大孔吸附樹脂的最大上樣量約為80 mL,根據(jù)上樣濃度計算可得80 mL上樣液相當(dāng)于生藥量12 g,故AB-8大孔吸附樹脂用量與生藥量的質(zhì)量比為1∶2.4。

        2.3.4 上樣流速

        取預(yù)處理好的5 g AB-8大孔樹脂三份,取1/2濃縮液各80 mL分別以2、4、6 BV·h-1的流速上樣,收集流出液,計算總平均濃度,見圖4。

        圖4 上樣流速對純化效果的影響Fig.4 Effect of sampling speed on purification efficiency

        由圖4可知,隨著上樣流速越慢,有效成分能被更多的吸附保留,流速為6 BV·h-1和4 BV·h-1,測得流出液中成分很高,2 BV·h-1測得流出液成分很低,未超出上樣液的10%,并且其和考察最大上樣量時的上樣流速1 BV·h-1一樣,上樣量可達80 mL才泄露,故確定上樣流速為2 BV·h-1。

        2.3.5 洗脫醇濃度

        上樣完成后,靜置10 min,用純水洗脫至流出液變澄清,再依次用40%、60%、80%、95%的醇進行洗脫(每個梯度洗脫5份,每份10 mL),洗脫流速12 BV·h-1,收集每份洗脫液,測定7個成分的含量,見圖5。

        圖5 洗脫醇濃度對純化效果的影響Fig.5 Effect of eluting alcohol concentration on purification efficiency

        大多數(shù)成分在洗脫濃度為60%時達最大泄漏,但α-香附酮和DPHB在醇濃度為80%時才達最大泄漏,因此,為了能夠更好的富集每個成分,最終選擇80%的乙醇作為洗脫劑。

        2.3.6 驗證實驗

        為確定AB-8大孔樹脂純化工藝的穩(wěn)定可行性,對上述純化工藝進行驗證,取醇濃度為40%的濃縮液進行上樣,上樣流速為2 BV·h-1上樣,分別用40%、80%和95%的乙醇進行洗脫,洗脫流速為12 BV·h-1,測定7個成分的含量,繪制洗脫曲線,見圖6。

        圖6 純化工藝驗證Fig.6 Verification of purification process

        從圖6中可看出7個成分在AB-8大孔數(shù)脂上能很好的被富集,在乙醇濃度為80%時,能很好的被洗脫,3次平行試驗均證實了大孔吸附樹脂能很好的吸附純化高良姜-香附藥對中的主要化學(xué)成分。各成分的總含量平均為57.68%,RSD分別為8.16%、3.74%、2.11%、7.21%、1.84%、7.80%、11.25%。

        3 結(jié) 論

        本研究選擇的7個成分為高良姜-香附中最具代表性的活性成分,但目前有關(guān)高良姜-香附的提取工藝考察指標(biāo)側(cè)重于揮發(fā)油類和黃酮類[12],尤其是高良姜素和α-香附酮。二芳基庚烷類化合物是高良姜中的代表性成分之一,有文獻表明[13],高良姜中的二芳基庚烷類化合物具有鎮(zhèn)痛[14]、抗炎[15]、抗菌[16]、抗氧化[17]等確切的藥理活性。但有關(guān)該藥對的提取工藝中并未涉及此類化合物,其純化工藝更未見報道。

        本研究確定高良姜-香附的最佳提取工藝條件為:醇濃度為70%乙醇,料液比為1∶8,提取次數(shù)為2次,每次2 h;純化工藝為40%醇濃度上樣液通過AB-8型大孔樹脂柱,生藥量:樹脂量1∶2.4,上樣流速2 BV·h-1,洗脫醇濃度為80%乙醇。在驗證實驗中,提取物的總含量平均為13.12%,純化后為57.68%,該提取純化工藝條件合理,穩(wěn)定可行,并且為高良姜-香附的開發(fā)利用提供可能。

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