李紅玉,趙冰潔,李悅寧,肖柯心,詹 博,王 番,郭東艷,賈艷艷*

1陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,咸陽 712046;2空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科,西安 710032;3西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,西安 710069

慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome,CFS),又名肌痛性腦脊髓炎(myalgic encephalomyelitis,ME),是一種持續(xù)6個(gè)月以上的復(fù)雜多系統(tǒng)疾病,臨床表現(xiàn)為衰弱性疲乏、神經(jīng)認(rèn)知障礙、頭痛、睡眠障礙和一系列自主神經(jīng)癥狀,對(duì)患者的工作和生活造成嚴(yán)重影響[1]。中醫(yī)方面認(rèn)為CFS累及五臟,在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中多稱為“倦”“懈惰”“困薄”“身重”“體重”“四肢不舉”等,隸屬“虛勞”等疾病范疇[2]。隨著人們工作節(jié)奏不斷加快,生活壓力逐漸增大,發(fā)病率持續(xù)上升且呈現(xiàn)低齡化趨勢(shì),已成為臨床熱議的重點(diǎn)。該病的發(fā)病機(jī)制尚不明確,致病因素較多,臨床治療方面也尚無特效藥。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥具有多組分、多靶點(diǎn)、承制調(diào)平的整體效應(yīng),有基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)表明中醫(yī)藥防治慢性疲勞綜合征具有顯著的效果和優(yōu)勢(shì)[3]。絞股藍(lán)為葫蘆科植物絞股藍(lán)Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino的全草?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)具有多種藥理活性,如降血脂血糖、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等作用,俗稱“南方人參”[4]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,絞股藍(lán)多糖可增強(qiáng)小鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)間,促進(jìn)骨骼肌分化等作用,同時(shí)口服絞股藍(lán)又可對(duì)患者精神疲勞和認(rèn)知方面有積極作用,可增強(qiáng)患者免疫力[5]。但其有效成分及作用機(jī)制尚不明確,CFS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,所以其非常適合采用網(wǎng)絡(luò)藥理的方法進(jìn)行研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以計(jì)算機(jī)技術(shù)及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫檢索為基礎(chǔ),將藥理學(xué)與生物信息學(xué)相結(jié)合,從系統(tǒng)角度研究藥物與疾病的關(guān)系,因此本文擬從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接技術(shù)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探索絞股藍(lán)治療CFS的相關(guān)靶點(diǎn)、通路和作用機(jī)制,為其臨床應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 絞股藍(lán)成分及相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

以“絞股藍(lán)”和“Gynostemmapentaphyllum”為關(guān)鍵詞在TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、TCMID數(shù)據(jù)庫(https://bidd.group/TCMID/index.html)進(jìn)行檢索,獲取絞股藍(lán)相關(guān)活性成分。以口服生物利用度(oral bioavailablity,OB)≥ 30%且類藥性(drug likeness,DL)≥ 0.18為篩選條件對(duì)所收集到的活性成分進(jìn)行篩選。

通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取篩選后活性成分的SMILE號(hào)和PubChem-CID/InChI號(hào),輸入成分SMILE號(hào)在Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫獲取相關(guān)成分靶點(diǎn),在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php)輸入成分的PubChem-CID/InChI號(hào),并以Score cutoff ≥ 20為篩選條件獲取相關(guān)靶點(diǎn)。使用UniPort(http://www.uniprot.org)數(shù)據(jù)庫,選擇物種為Human,將以上收集到的所有靶點(diǎn)的名稱校準(zhǔn)為UniProt官方基因名稱,整理并對(duì)重復(fù)項(xiàng)進(jìn)行分類和過濾。

1.2 慢性疲勞綜合征靶點(diǎn)的獲取

以慢性疲勞綜合征英文名稱“chronic fatigue syndrome”在OMIM(https://omim.org/)數(shù)據(jù)庫、GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫、Grugbank(https://go.drugbank.com/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索,得到慢性疲勞綜合征相關(guān)疾病靶點(diǎn)。其中GeneCards數(shù)據(jù)庫以Relevance score ≥ 9篩選疾病靶點(diǎn)。使用UniPort數(shù)據(jù)庫,選擇物種為Human,將以上收集到的所有靶點(diǎn)的名稱校準(zhǔn)為UniProt官方基因名稱,整理并對(duì)重復(fù)項(xiàng)進(jìn)行分類和過濾。

1.3 共有靶點(diǎn)篩選

將上述所獲取的活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/ tools/venny/)網(wǎng)站中映射得到活性成分與疾病共有靶點(diǎn)個(gè)數(shù),并繪制韋恩圖。

1.4 “絞股藍(lán)活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

運(yùn)用Cyctoscape 3.7.1軟件將“1.3”收集得到的共有靶點(diǎn)集及其對(duì)應(yīng)的成分進(jìn)行可視化處理,構(gòu)建“絞股藍(lán)活性成分-共同作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。根據(jù)活性成分和靶點(diǎn)的連接情況篩選絞股藍(lán)作用于CFS的關(guān)鍵成分。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫導(dǎo)入活性成分和疾病的共有靶點(diǎn),將物種設(shè)置為“Homo sapiens”,最小互相作用閾值設(shè)為high confidence>0.7并且隱藏網(wǎng)絡(luò)中沒有連接的靶點(diǎn),得到相互作用關(guān)系圖及保存TSV格式的數(shù)據(jù)。將相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件,繪制共有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖。利用軟件中Network Analyzer對(duì)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,并根據(jù)度值(degree)的大小調(diào)整節(jié)點(diǎn)大小繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。其中degree值越大,即說明該節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)聯(lián)系密切,在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中更重要。

1.6 富集分析

利用R語言軟件中的clusterProfiler (https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/ html/clusterProfiler.html)包對(duì)絞股藍(lán)和CFS關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論(GO)分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路,設(shè)定P<0.05,物種限定為“homo sapiens”,選取前十個(gè)具有顯著差異的GO功能條目并繪制柱狀圖,篩選富集程度較高的前20條通路繪制氣泡圖。

1.7 “絞股藍(lán)成分-疾病-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將“1.4”收集得到的絞股藍(lán)活性成分-共同作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖、“1.6”KEGG通路富集結(jié)果和CFS靶點(diǎn),利用Cyctoscape 3.7.1進(jìn)行關(guān)聯(lián),利用軟件中的Merge功能構(gòu)建“絞股藍(lán)成分-疾病-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。

1.8 分子對(duì)接

將“1.4”中連接靶點(diǎn)數(shù)目最多的前5種核心成分與PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前五的5個(gè)核心靶點(diǎn)依次進(jìn)行分子對(duì)接。從PubChem數(shù)據(jù)庫下載活性成分的2D結(jié)構(gòu)作為小分子配體,保存為SDF格式,利用Chem3D 20.0軟件優(yōu)化小分子的力學(xué)結(jié)構(gòu),保存為mol2格式文件。使用Autodock Tools 1.5.7軟件進(jìn)行加氫、檢測(cè)分子的中心節(jié)點(diǎn)及可旋轉(zhuǎn)鍵后,保存為PDBQT格式文件。從RSCB PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)篩選5個(gè)核心靶點(diǎn)的蛋白結(jié)構(gòu),選擇物種為“Homo sapiens”,分辨率小于3 ?并具有配體的蛋白復(fù)合物作為蛋白受體,下載核心靶點(diǎn)的PDB結(jié)構(gòu)文件。使用Pymol 2.2.0軟件對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)去除水分子及配體,利用Autodock Tools 1.5.7軟件對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷等處理,轉(zhuǎn)化為PDBQT格式。使用Autodock Tools 1.5.7軟件確定配體與受體結(jié)合位點(diǎn)gird box的大小及位置。利用Autodock Vina 1.1.2軟件對(duì)活性成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接并分析其結(jié)果,最后使用Pymol 2.2.0軟件進(jìn)行分子可視化。

1.9 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.9.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性BALB/c小鼠40只,SPF級(jí),體質(zhì)量(20±2 g),5～6周齡,購買于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào):SYXK(陜)2019-001]。完全按照動(dòng)物中心飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng),SPF環(huán)境,溫度18～25 ℃,自由攝食和飲水,定期觀察小鼠生長狀況,及時(shí)更換墊料并定時(shí)給藥。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均嚴(yán)格遵照空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物保護(hù)與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的動(dòng)物使用規(guī)程進(jìn)行操作,倫理審查批準(zhǔn)號(hào):KY20223251-1。

1.9.2 藥品、試劑與設(shè)備

紅景天口服液(批準(zhǔn)文號(hào):國藥準(zhǔn)字B20070 002,批號(hào):210904)購于西藏藏藥集團(tuán)股份有限公司;絞股藍(lán)藥材購自西安市藥材公司,取絞股藍(lán)加入八倍量70%乙醇,加熱回流提取3次,每次60 min,將3次提取液合并后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干,放入恒溫干燥箱烘干至恒重,得到絞股藍(lán)提取物。

血清尿氮素(BUN)試劑盒(貨號(hào):C013-2-1)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(貨號(hào):A020-2)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào):A045-4)均購于南京建成生物工程研究所;蛋白激酶B(AKT)兔多克隆抗體(貨號(hào):A00024-2)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)兔多克隆抗體(貨號(hào):BA1352-2)、磷酸化AKT(貨號(hào):BM4744)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)兔單克隆抗體(貨號(hào):BA2305)、STAT3兔單克隆抗體(貨號(hào):BM4052)、山羊抗兔IgG二抗(貨號(hào):BA1056)均購自武漢博士德生物工程有限公司;磷酸化 PI3K(美國Cell Signaling Technology公司,貨號(hào):#4288);10%PAGE凝膠快速制備試劑盒(上海雅萌生物醫(yī)藥科技有限公司,貨號(hào):PG112);5×蛋白上樣緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)公司,貨號(hào):P0015);PVDF膜(美國Millipore公司);RIPA組織裂解液、脫脂奶粉、ECL超敏發(fā)光液(武漢博士德生物工程有限公司,貨號(hào)分別為AR0102、AR0104、AR1191)。

MULTISKAN GO型全波長酶標(biāo)儀(美國THERMO);TDZ4-WS型高速離心機(jī)(陜西華新元醫(yī)療器械有限公司);SA102型轉(zhuǎn)棒式疲勞儀(江蘇賽昂斯生物科技有限公司);凝膠成像儀(美國Amersham公司)。

1.9.3 分組及給藥

采用數(shù)字隨機(jī)分組法將BALB/c小鼠分為4組,每組10只即對(duì)照組(control group,CON)、模型組(model group,MOD)、陽性對(duì)照組紅景天(Hongjingtian oral liquid group,HOL,122 mg/kg)、絞股藍(lán)提取物組(G.pentaphyllumextract group,GYP,100 mg/kg)。課題組經(jīng)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選最佳給藥劑量,按照10 mL/kg小鼠灌胃體積將絞股藍(lán)提取物加蒸餾水配置為100 mg/kg。除空白組外,采用復(fù)合刺激的方法(食物限制+強(qiáng)迫游泳)復(fù)制疲勞模型[6],各實(shí)驗(yàn)組小鼠,均于每天上午8～9時(shí)灌胃給藥,于造模7 d后開始給藥,連續(xù)給藥14 d,每天1次?？瞻讓?duì)照組小鼠每次每只灌胃10 mL/kg滅菌去離子水。

1.9.4 強(qiáng)迫游泳

強(qiáng)迫小鼠游泳造成過度疲勞,于每天上午9∶00,在水深30 cm(要求小鼠四肢、重物都無法接觸缸底),水溫25 ± 2 ℃左右的玻璃缸中,將小鼠放入水中,強(qiáng)迫游泳訓(xùn)練10 min,連續(xù)游泳訓(xùn)練21 d。游泳訓(xùn)練過程中,要防止小鼠因體力不支沉入水中而溺死。

1.9.5 控制飲食

模仿飲食失調(diào)因素,對(duì)模型組小鼠實(shí)行單日禁食,雙日正常飲食,使小鼠饑飽失常,飲食“不節(jié)”。

1.9.6 力竭游泳實(shí)驗(yàn)

造模第21 d,將鋼絲(重量為小鼠體重的7%)固定在小鼠尾巴的1/3處,置于30 cm深(50 cm×40 cm×30 cm)的水中,水溫為25 ± 1 ℃,進(jìn)行力竭游泳試驗(yàn)。記錄小鼠從下水到浸水的時(shí)間(即小鼠10 s內(nèi)不能浮出水面)。

1.9.7 轉(zhuǎn)棒疲勞實(shí)驗(yàn)

造模第21 d進(jìn)行轉(zhuǎn)棒疲勞試驗(yàn),實(shí)驗(yàn)分為學(xué)習(xí)期(learning phase)和測(cè)試期(test phase),其實(shí)驗(yàn)結(jié)果用于評(píng)價(jià)藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的協(xié)調(diào)能力和疲勞耐力的影響[7]。轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)的觀察指標(biāo)為在棒時(shí)間。實(shí)驗(yàn)開始前,轉(zhuǎn)棒轉(zhuǎn)速為初始轉(zhuǎn)速4 r/min,每只小鼠均在此轉(zhuǎn)速下適應(yīng)1 min。實(shí)驗(yàn)開始后將轉(zhuǎn)速增加至為40 r/min,記錄小鼠在棒時(shí)間,每只測(cè)試3次取平均值。

1.9.8 血液生化指標(biāo)測(cè)定

小鼠轉(zhuǎn)棒測(cè)試后休息30 min,戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠,用一次性抗凝負(fù)壓采血管從腹主動(dòng)脈取血。血液經(jīng)4 ℃過夜后、4 ℃離心取血清,-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。按照試劑盒要求檢測(cè)血清中尿素氮(BUN)、乳酸脫氫酶(LDH)水平,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.9.9 蛋白免疫印跡法檢測(cè)肌肉組織PI3K、AKT、P-PI3K、P-AKT、STAT3蛋白表達(dá)

麻醉小鼠后,取各組小鼠右下肢約1 mm×1 mm×3 mm大小腓腸肌組織塊,取小鼠肌肉組織30 mg,加入RIPA裂解液300 μL,冰上研磨勻漿,4 ℃、12 000 r/min離心10 min后取上清液,BCA法進(jìn)行蛋白定量,采用10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離,結(jié)束后轉(zhuǎn)至PVDF膜上,用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h,TBST洗膜三次,加入一抗PI3K(1∶1 000)、AKT(1∶1 000)、P-PI3K(1∶1 000)、P-AKT(1∶1 000)、STAT3(1∶2 000)、β-actin(1∶8 000),4 ℃孵育過夜,次日TBST洗膜三次,加入二抗(1∶10 000),室溫孵育1 h,TBST洗膜三次,除去殘留二抗,加入ECL顯影液(1∶1比例配制),打開凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行各條帶曝光,用圖像分析軟件Image J對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。

1.9.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 絞股藍(lán)成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

本研究通過TCMSP、TCMID、BATMAN-TCM、SWISS-TARGET數(shù)據(jù)庫篩選,依據(jù)OB ≥ 30%,DL ≥ 0.18為篩選條件得到25個(gè)活性成分,篩除沒有靶點(diǎn)的成分8個(gè),最終獲得17個(gè)活性成分結(jié)果見表1,篩除重復(fù)項(xiàng)后絞股藍(lán)總靶點(diǎn)數(shù)為583個(gè)。

表1 絞股藍(lán)活性成分Table 1 Effective ingredients of G.pentaphyllum

2.2 慢性疲勞綜合征疾病靶點(diǎn)獲取

通過檢索OMIM、GeneCards和Grugbank數(shù)據(jù)庫得到慢性疲勞綜合征的靶點(diǎn)并導(dǎo)入U(xiǎn)niPort數(shù)據(jù)庫校正為官方名稱后,整理并刪除重復(fù)項(xiàng)后共獲得2 692個(gè)靶點(diǎn)。

2.3 共有靶點(diǎn)篩選

將絞股藍(lán)靶點(diǎn)和CFS的靶點(diǎn)通過Venny 2.1構(gòu)建韋恩圖,篩選共有靶點(diǎn),結(jié)果見圖1,共有靶點(diǎn)數(shù)為266個(gè),這些共有靶點(diǎn)既是疾病的靶點(diǎn),又是活性成分作用的靶點(diǎn),所以絞股藍(lán)很有可能是通過這些靶點(diǎn)發(fā)揮治療CFS的作用。

圖1 成分靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Venn diagram of component target-disease target

2.4 “絞股藍(lán)活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

利用Cyctoscape 3.7.1軟件將絞股藍(lán)活性成分與共有靶點(diǎn)集進(jìn)行繪圖與分析,該網(wǎng)絡(luò)由283個(gè)節(jié)點(diǎn),715條邊組成,如圖2所示。利用軟件的Network Analyzer分析,成分與靶點(diǎn)相連的邊越多,degree值越高,活性成分節(jié)點(diǎn)越大。Degree值排名前五位的核心有效成分是槲皮素、異鼠李素、環(huán)黃楊堿D、人參二醇、3′-甲基柔二酸。提示這些成分在絞股藍(lán)治療CFS方面起到關(guān)鍵作用。

圖2 絞股藍(lán)活性成分-共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Effective ingredients of G.pentaphyllum-common target network注:藍(lán)色表示絞股藍(lán)活性成分;黃色表示靶點(diǎn)。Note:Blue represents active components of G.pentaphyllum;Yellow represents target.

2.5 共有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述獲得的266個(gè)共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫,去除無相互作用靶點(diǎn),獲取相互作用關(guān)系圖,將相互作用關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖,該網(wǎng)絡(luò)由258個(gè)節(jié)點(diǎn),4 774條邊組成,再對(duì)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,利用Network Analyzer進(jìn)行分析,degree值越大,表明蛋白質(zhì)間相互作用越強(qiáng),節(jié)點(diǎn)就越大,顏色越深,結(jié)果見圖3。對(duì)靶點(diǎn)的degree值進(jìn)行統(tǒng)計(jì),共有96個(gè)靶點(diǎn)degree值高于平均degree值,為絞股藍(lán)治療CFS的核心靶點(diǎn),degree值位于前10的靶蛋白是STAT3、TP53、SRC、AKT1、HSP90AA1、MAPK3、EGFR、JUN、PIK3R1、MAPK1,結(jié)果見表2。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network diagram

表2 高于平均degree值的核心靶點(diǎn)Table 2 Core targets above average degree values

2.6 核心靶點(diǎn)GO功能富集分析

使用R語言對(duì)96個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析。GO富集分析指在特定功能水平上的蛋白質(zhì)或基因的數(shù)量和組成,它由生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細(xì)胞組分(cellular component,CC)三個(gè)部分組成。BP富集結(jié)果顯示,絞股藍(lán)治療CFS的靶標(biāo)主要參與對(duì)肽、肽激素、化學(xué)壓力、激酶活性、脂多糖、機(jī)械刺激的反應(yīng)以及對(duì)肽基酪氨酸修飾及磷酸化等過程的調(diào)節(jié);CC富集結(jié)果顯示,絞股藍(lán)對(duì)治療CFS的靶標(biāo)集中在膜筏、膜微區(qū)、小窩、質(zhì)膜筏、細(xì)胞基質(zhì)交界處、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物等部位;MF富集結(jié)果顯示,絞股藍(lán)治療CFS的靶標(biāo)集中在細(xì)胞因子受體結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白質(zhì)絲氨酸或蘇氨酸激酶活性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、胰島素受體底物結(jié)合、生長因子受體結(jié)合等方面。根據(jù)富集基因數(shù)目排名前10繪制為柱狀圖,結(jié)果見圖4。

圖4 絞股藍(lán)治療CFS的GO功能富集分析Fig.4 GO functional enrichment analysis of G.pentaphyllum in the treatment of CFS

2.7 核心靶點(diǎn)KEGG信號(hào)通路富集分析

使用R語言富集包對(duì)96個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析,根據(jù)P值≤ 0.05及富集基因數(shù)目,將前20條KEGG信號(hào)通路繪制為氣泡圖,結(jié)果見圖5。結(jié)果表明絞股藍(lán)治療CFS的靶點(diǎn)主要涉及到P13K-AKT信號(hào)通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈硬化、乙型肝炎、內(nèi)分泌抵抗、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、AGE-RAGE信號(hào)通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、HIF-1信號(hào)傳導(dǎo)途徑、ErbB信號(hào)傳導(dǎo)途徑等信號(hào)通路。通過對(duì)通路具體信息進(jìn)行描述,發(fā)現(xiàn)P13K-AKT信號(hào)通路富集基因數(shù)目最多并且包含degree值排名前10靶蛋白中的7個(gè),表明該通路可能為絞股藍(lán)治療CFS的最重要的通路,結(jié)果見表3。為進(jìn)一步了解P13K-AKT信號(hào)通路在絞股藍(lán)治療CFS的重要性,通過 KEGG Mapper將關(guān)鍵靶點(diǎn)映射在P13K-AKT信號(hào)通路上,結(jié)果見圖6。

圖5 絞股藍(lán)治療CFS的KEGG信號(hào)通路富集分析Fig.5 Enrichment analysis of KEGG signal pathway of G.pentaphyllum in the treatment of CFS

圖6 絞股藍(lán)治療CFS的關(guān)鍵靶點(diǎn)在P13K-AKT信號(hào)通路的映射Fig.6 The mapping of P13K-AKT signaling pathway is the core target of G.pentaphyllum in the treatment of CFS注:紅色字體節(jié)點(diǎn)表示絞股藍(lán)作用于CFS的靶點(diǎn)。Note:Red font nodes indicate the targets of G.pentaphyllum in the treatment of CFS.

表3 KEGG通路具體信息Table 3 KEGG pathway specific information

2.8 “絞股藍(lán)成分-疾病-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

利用Cytoscape3.7.1軟件,結(jié)合絞股藍(lán)活性成分、共有靶點(diǎn)、疾病靶點(diǎn)及KEGG通路,構(gòu)建絞股藍(lán)成分-疾病-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖,該網(wǎng)絡(luò)圖由305個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 582條邊組成,見圖7。提示絞股藍(lán)是通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路來實(shí)現(xiàn)治療CFS的作用。

圖7 絞股藍(lán)成分-疾病-靶點(diǎn)-通路圖Fig.7 “G.pentaphyllum ingredient-disease-target-pathway” network注:深綠色表示絞股藍(lán);淺綠色表示絞股藍(lán)活性成分;紫色表示慢性疲勞綜合征;藍(lán)色表示通路;粉紅色表示蛋白靶點(diǎn)。Note:Dark green means G.pentaphyllum;Light green means active components of G.pentaphyllum;Purple means chronic fatigue syndrome;Blue means pathways;Pink means protein target.

2.9 核心成分和核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果

將“2.4”項(xiàng)中得到的核心成分槲皮素、異鼠李素、環(huán)黃楊堿D、人參二醇和3′-甲基柔二酸與成分相關(guān)核心靶點(diǎn)STAT3(PDB ID:4ZIA)、TP53(PDB ID:5O1H)、SRC(PDB ID:4HXJ)、AKT1(PDB ID:1H1O)、HSP90AA1(PDB ID:1BYQ)進(jìn)行分子對(duì)接和結(jié)合能力預(yù)測(cè)。通過對(duì)接能量來評(píng)估配體和受體的結(jié)合能力,結(jié)合能≤ -5 kcal/mol表示配體與受體能夠自發(fā)結(jié)合,且其值越小表示兩者的結(jié)合活性越高[8]。結(jié)果顯示核心成分與蛋白對(duì)接的結(jié)合能均小于-5 kcal/mol,STAT3蛋白與核心成分的結(jié)合能力最好,結(jié)果見表4。其中,人參二醇-STAT3、3′-甲基柔二酸-STAT3、3′-甲基柔二酸-TP53、槲皮素-TP53、3′-甲基柔二酸-HSP90AA1、槲皮素-STAT3對(duì)接模式較好,采用PyMOL 2.2.0 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化展示(見圖8)。

圖8 分子對(duì)接結(jié)果Fig.8 Results of molecular docking注:A～F分別為人參二醇與STAT3、3′-甲基柔二酸與STAT3、3′-甲基柔二酸與TP53、槲皮素與TP53、3′-甲基柔二酸與HSP90AA1、槲皮素與STAT3的分子對(duì)接圖。Note:A-F are the molecular docking diagrams of panaxadiol and STAT3,3′-methyleriodictyol and STAT3,3′-methyleriodictyol and TP53,quercetin and TP53,3′-methyleriodictyol and HSP90AA1,quercetin and STAT3,respectively.

表4 核心成分與核心靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果Table 4 Molecular docking result between core components and core targets

2.10 絞股藍(lán)對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間及轉(zhuǎn)棒時(shí)間的影響

采用力竭游泳實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)絞股藍(lán)抗疲勞作用。結(jié)果顯示,各組小鼠造模21 d后,與對(duì)照組相比,模型組力竭游泳時(shí)間明顯減少,在棒時(shí)間顯著減少(P<0.01或P<0.05)。給藥干預(yù)14 d后,紅景天組、絞股藍(lán)提取物組力竭游泳時(shí)間以及在棒時(shí)間明顯提高,且絞股藍(lán)組優(yōu)于紅景天組(P<0.01或P<0.05),結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,結(jié)果見圖9。

圖9 小鼠力竭游泳時(shí)間(A)及在棒時(shí)間Fig.9 Exhaustive swimming time (A) and time at the bar (B) in 注:與對(duì)照組相比,#P<0.05,##P<0.01;與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01,下同。Note:Compared with control group,#P<0.05,##P<0.01;Compared with model group,*P<0.05,**P<0.01,the same below.

2.11 絞股藍(lán)對(duì)小鼠血清BUN、LDH的影響

血清尿素氮、乳酸脫氫酶等代謝產(chǎn)物的堆積被認(rèn)為是疲勞發(fā)生的重要因素[9]。結(jié)果如圖10所示,造模21 d后,與對(duì)照組相比,模型組小鼠血清中BUN水平和LDH活性顯著升高(P<0.05),給藥治療14 d后,絞股藍(lán)提取物組可顯著降低小鼠血清BUN水平及LDH活性(P<0.01或P<0.05)。

圖10 小鼠血清尿素氮水平(A)和乳酸脫氫酶活性Fig.10 BUN level (A) and activity of LDH (B) in

2.12 絞股藍(lán)對(duì)慢性疲勞綜合征小鼠肌肉組織PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白及STAT3蛋白表達(dá)的影響

通過Western blot方法檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白及分子對(duì)接中結(jié)合能力最好的STAT3蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組小鼠肌肉組織中AKT蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01),P-AKT蛋白和STAT3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05),PI3K及P-PI3K蛋白無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與模型組相比,絞股藍(lán)提取物組小鼠肌肉組織中PI3K、AKT蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01或P<0.05)且優(yōu)于紅景天組,P-PI3K、P-AKT和STAT3蛋白水平明顯降低(P<0.01或P<0.05)且優(yōu)于紅景天組。結(jié)果見圖11。

圖11 絞股藍(lán)對(duì)CFS小鼠肌肉組織PI3K、AKT、STAT3蛋白表達(dá)的影響Fig.11 Effect of G.pentaphyllum on the expression of PI3K,AKT and STAT3 proteins in muscle tissue of CFS

3 討論與結(jié)論

中醫(yī)藥在治療CFS方面起到了關(guān)鍵作用,主要以補(bǔ)益類藥物治療,絞股藍(lán)作為補(bǔ)益藥的一種,研究報(bào)道其活性成分具有抗炎、抗疲勞、改善氧化應(yīng)激、增強(qiáng)免疫功能的作用[10,11]。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)絞股藍(lán)活性成分進(jìn)行分析,通過“絞股藍(lán)活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)槲皮素、異鼠李素、人參二醇等成分degree值排名較高?，F(xiàn)代藥理研究表明槲皮素可顯著提高負(fù)重游泳小鼠過氧化氫酶(CAT)和總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性,同時(shí)影響糖異生和糖代謝,起到延緩或消除疲勞作用[12]。Gong等[13]研究發(fā)現(xiàn)異鼠李素可作為潛在的抗氧化劑,其作用機(jī)制可能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT和Nrf2/ARE信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化作用,提高細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)表達(dá),顯示出優(yōu)異的抗氧化和抗疲勞作用。Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)人參二醇可增加疲勞小鼠肝肌糖原在體內(nèi)的儲(chǔ)備、降低血清中乳酸(LD)含量,提高LDH活性,抗疲勞作用顯著。預(yù)測(cè)這些成分可能為絞股藍(lán)治療CFS的關(guān)鍵核心成分。

通過對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建發(fā)現(xiàn),STAT3、TP53、SRC、AKT1等蛋白的degree值較高。STAT3作為信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子,可調(diào)控ATP合成酶的活性和白細(xì)胞介素水平,影響機(jī)體能量代謝和炎癥狀態(tài)。Gilad等[15]研究發(fā)現(xiàn)SRC可發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用,其作用機(jī)制是通過調(diào)節(jié)NF-κB通路和免疫細(xì)胞進(jìn)而影響炎癥及氧化應(yīng)激等。Fang等[16]發(fā)現(xiàn)TP53通過抑制疲勞大鼠骨骼肌P53蛋白的表達(dá),可減少細(xì)胞凋亡,調(diào)節(jié)肌肉疲勞狀態(tài),另有研究表明其對(duì)氧化應(yīng)激也有平衡作用。AKT1通過調(diào)節(jié)MAPK磷酸化激活PPARα/PGC-1α促進(jìn)線粒體生物合成,影響組織能量代謝,有研究證明其通過調(diào)節(jié)能量代謝影響疲勞狀態(tài)[17]。表明STAT3、TP53、SRC、AKT1可通過調(diào)節(jié)能量代謝、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等作用于CFS,可能為絞股藍(lán)治療CFS的關(guān)鍵靶點(diǎn)。本文進(jìn)一步將關(guān)鍵靶點(diǎn)與核心成分進(jìn)行分子對(duì)接,結(jié)果顯示兩者結(jié)合活性較高,其中STAT3蛋白與核心成分的結(jié)合能力最好。

對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)GO和KEGG富集分析,結(jié)果顯示絞股藍(lán)治療CFS涉及P13K/AKT、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、HIF-1信號(hào)傳導(dǎo)途徑、AGE-RAGE等信號(hào)通路,其中P13K/AKT信號(hào)通路富集基因數(shù)最多。CFS伴隨著腦內(nèi)炎癥出現(xiàn),影響著腦內(nèi)神經(jīng)元增殖和凋亡。P13K/AKT信號(hào)通路與多種酶生物學(xué)效應(yīng)和葡萄糖代謝密切相關(guān),可影響腦內(nèi)HPA軸進(jìn)而改善神經(jīng)炎癥,緩解中樞疲勞。P13K可激活A(yù)KT蛋白的表達(dá)量并且通過磷酸化P13K和AKT蛋白參與細(xì)胞代謝、增殖分化、抗凋亡等方面[18]。已有研究顯示絞股藍(lán)總皂苷可通過激活P13K/AKT信號(hào)通路,抑制下游促凋亡蛋白釋放,降低氧化應(yīng)激改善腦損傷[19],表明P13K-AKT信號(hào)通路在絞股藍(lán)治療CFS的重要性。再次通過KEGG Mapper映射P13K-AKT信號(hào)通路,發(fā)現(xiàn)多數(shù)關(guān)鍵靶點(diǎn)都映射在該信號(hào)通路上。提示P13K/AKT通路為絞股藍(lán)治療CFS的潛在作用通路。

為了進(jìn)一步探究絞股藍(lán)治療CFS的機(jī)制,通過食物限制和強(qiáng)迫游泳建立CFS小鼠模型。通過力竭游泳實(shí)驗(yàn)及轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)能顯著延長小鼠力竭游泳時(shí)間和在棒時(shí)間,運(yùn)動(dòng)耐力的提高是評(píng)價(jià)藥物抗疲勞最客觀的指標(biāo),提示絞股藍(lán)皂苷具有顯著的抗疲勞作用,可減少疲勞代謝產(chǎn)物的堆積,增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間。當(dāng)劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí),機(jī)體處于相對(duì)無氧狀態(tài),依靠肌肉糖酵解供能導(dǎo)致LDH和BUN增多,引起一系列機(jī)體神經(jīng)傳導(dǎo)、肌肉收縮等功能障礙,影響能量的產(chǎn)生、釋放和儲(chǔ)存,進(jìn)一步導(dǎo)致體力疲勞發(fā)生[20]。本研究發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)能顯著降低CFS小鼠血清中BUN水平和LDH活性,說明絞股藍(lán)能減少機(jī)體代謝產(chǎn)物的堆積。Western blot 結(jié)果顯示,絞股藍(lán)可以提高PI3K、Akt的表達(dá)量,降低P-PI3K、P-AKT、STAT3的表達(dá)量從而調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路,提示PI3K/AKT信號(hào)通路可能是絞股藍(lán)治療慢性疲勞綜合征的關(guān)鍵通路。

綜上所述,絞股藍(lán)核心活性成分槲皮素、異鼠李素等可能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激及能量代謝等作用于STAT3、TP53、SRC、AKT1、HSP90AA1等多個(gè)靶點(diǎn),調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路等多個(gè)途徑發(fā)揮作用,具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑治療CFS的潛力。本研究可為絞股藍(lán)的深入研究和臨床應(yīng)用提供參考。