何嘉瑩,胡綺萍,童培珍,邱韻靜,李國衛(wèi)*,陳向東,郭嘉亮,孫冬梅

1廣東一方制藥有限公司,佛山 528244;2 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院,佛山 528000

土鱉蟲首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為中品[1]。土鱉蟲[2]為鱉蠊科昆蟲地鱉EupolyphagasinensisWalker或冀地鱉Steleophagaplancyi(Boleny)的雌蟲干燥體。土鱉蟲[3]主要含有氨基酸、蛋白質(zhì)、揮發(fā)油類化合物,另含有生物堿、脂肪酸、纖溶活性成分及微量元素等其他成分。土鱉蟲具有散血瘀,消堅結(jié)、消腫止痛、下乳通經(jīng)等功效,用于跌打損傷、筋傷骨折、血瘀經(jīng)閉、產(chǎn)后瘀阻腹痛、癥痕痞塊等。近代藥理學(xué)研究表明土鱉蟲有抗凝血、抗腫瘤、調(diào)血脂、鎮(zhèn)痛、抗炎殺菌等活性,甚至被稱為“調(diào)節(jié)血液流動的首選藥物”[4],臨床上應(yīng)用較廣(據(jù)藥智網(wǎng)數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計,共收載含有土鱉蟲的中成藥處方151個),用量亦較大。目前,市場上銷售的土鱉蟲分為野生和人工飼養(yǎng)兩種,但由于野生土鱉蟲數(shù)量逐年減少,人工飼養(yǎng)品在臨床應(yīng)用中占極大比例,人為摻假使雜的行為時有發(fā)生,僅通過性狀對其進行鑒別可能會出現(xiàn)誤判現(xiàn)象[5,6]。整體而言,2020年版中國藥典土鱉蟲項下收載的檢測項目較為簡單,無法全面準(zhǔn)確地反映土鱉蟲真?zhèn)魏唾|(zhì)量優(yōu)劣。

土鱉蟲主要含有氨基酸、蛋白質(zhì)、揮發(fā)油類化合物等,現(xiàn)階段其質(zhì)量相關(guān)研究也多圍繞這些成分展開[5-8]。近年來,也有學(xué)者采用分子生藥學(xué)方法對土鱉蟲的真?zhèn)舞b別進行了研究,如:Chen等[9]也通過色譜及分子生物學(xué)建立地鱉及其偽品金邊土鱉的鑒別方法,通過DNA條形碼在與數(shù)據(jù)庫比對后,即給出最接近物種的序列及其比對情況,可明確地判定出品種來源;Lu等[10]采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法,分別對三種及同種不同產(chǎn)地的土鱉蟲蛋白質(zhì)進行鑒別研究,該法分辨率高、重現(xiàn)性良好。然而,分子生藥學(xué)技術(shù)對實驗室要求較高,難以推廣,具有一定的局限性。2020年版《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)中,土鱉蟲藥材鑒別項下僅有顯微鑒別及薄層鑒別,且該方法僅適用于原料鑒別,對經(jīng)煎煮后的土鱉蟲提取物及含土鱉蟲成方制劑,方法傳遞性較差,無法有效區(qū)分。

特征肽作為具有物種差異性的生物標(biāo)志物,在動物藥研究中日趨成熟,已有學(xué)者通過特征肽技術(shù),實現(xiàn)了龜鱉甲類[11,12]、羚羊角[13,14]、阿膠[14,15]、鹿角膠[16]、蜈蚣[17]、鹿角[18]等研究,其專屬性好、操作簡便的特點,更易于在日常檢驗中進行推廣?；谫|(zhì)譜檢測的特征肽技術(shù)可同時設(shè)定多個物種特征肽離子信息作為檢測指標(biāo),有望在實現(xiàn)真?zhèn)舞b別的同時,進一步準(zhǔn)確判定摻偽成分并對摻偽成分相對定量,具有廣泛和明朗的應(yīng)用前景?！吨袊幍洹?020年版中阿膠、鹿角膠、龜甲膠的鑒別項中已收載離子對測定。特征多肽作為質(zhì)量指標(biāo)出現(xiàn)在我國的官方法典中,也結(jié)束了法定標(biāo)準(zhǔn)中動物藥無專屬性質(zhì)量控制成分的局面。其中提取物多采用水為溶媒,土鱉蟲等動物藥經(jīng)煎煮、熬制后,膠原蛋白發(fā)生非特異性降解,形成水溶性良好的肽類成分,部分肽類可透過生物膜吸收入血而發(fā)揮多種生物效應(yīng)。然而,目前國內(nèi)外尚未見有關(guān)土鱉蟲藥材及其制劑特征離子鑒別的報道。本研究通過借鑒上述特征離子鑒別技術(shù),將其應(yīng)用于土鱉蟲真?zhèn)纹疯b別,為土鱉蟲及其制劑的質(zhì)量研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料

Waters Xevo TQ-S Micro三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀(沃特世公司);Infinity II-6470LC/TQ三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀(安捷倫公司);HWS-28型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);SHH-250SD藥品穩(wěn)定性驗箱(重慶市永生實驗儀器廠);ME204E萬分之一天平(梅特勒-托利多公司);XP26百萬分之一天平(梅特勒-托利多公司);Milli-Q Direct超純水系統(tǒng)(默克股份有限公司)。

土鱉蟲(地鱉)對照藥材(批號:121533-201704)由中國食品藥品檢定研究院提供;胰蛋白酶(批號:SLCC9020)由Sigma公司提供。乙腈、碳酸氫銨、甲酸為色譜級;水為超純水(實驗室自制);其他試劑為分析純。

本研究選取24批市售土鱉蟲藥材樣品,經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)黃海波副教授鑒定,21批為鱉蠊科昆蟲地鱉EupolyphagasinensisWalker的雌蟲干燥體,3批為冀地鱉Steleophagaplancyi(Boleny)的雌蟲干燥體,并收集其偽品(金邊土鱉、金邊龍虱、美洲大蠊)及其他動物藥(地龍、龜甲、僵蠶、雞內(nèi)金、蟬蛻、水蛭)等樣品,信息見表1。另外收集土鱉蟲提取物21批及成方制劑6批,信息見表2。

表1 藥材信息表Table 1 Information of medicinal materials

表2 土鱉蟲提取物及成方制劑信息表Table 2 Information of Eupolyphaga Steleophaga extract and prescription preparation

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

將樣本研磨后,取0.1 g粉末(過三號篩),加入100 mL 1%碳酸氫銨溶液,稱定重量,加熱回流30 min,放冷,稱定重量,再用1%碳酸氫銨溶液補足減失重量,搖勻,之后用0.22 μm微孔濾膜過濾作為母液備用。取母液1 mL置于進樣瓶中,加入50 μL1 mg/mL胰蛋白酶溶液(1%碳酸氫銨溶液與胰蛋白酶混合配制而成),搖勻,37 ℃恒溫酶解12 h,作為供試品溶液。

1.2.2 特征離子分析測定條件

色譜條件:采用Waters ACQUITY HSS T3(150 mm×2.1 mm,1.8 μm)色譜柱;以乙腈為流動相A,以0.1%甲酸溶液為流動相B,梯度洗脫:0～3 min,3%→8%A;3～45 min,8%→22%A;45～54 min,22%→32%A;54～54.1 min,32%→100%A;54.1～58 min,100%A;流速為0.3 mL/min;柱溫為30 ℃;進樣量2 μL。

質(zhì)譜條件:使用Thermo Q-Exactive Focus高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀,電噴霧正離子模式(ESI+),設(shè)置為Full-MS-ddMS2模式,鞘氣流速為30 L/min;輔助氣流速為10 L/min;噴霧電壓為3.30 kV;毛細(xì)管溫度為320 ℃;輔助氣溫度為320 ℃。

1.2.3 專屬性測定條件

色譜條件同“1.2.2”項下 。

質(zhì)譜條件:采用三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀進行多反應(yīng)監(jiān)測(MRM),以質(zhì)荷比(m/z)415.72(雙電荷)→406.72、415.72(雙電荷)→667.34作為檢測離子對進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 特征離子的選擇

通過使用Thermo Q-Exactive Focus 高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀采集經(jīng)胰蛋白酶酶解后溶液的一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù),將所采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)在Thermo Xcalibur質(zhì)譜軟件上進行篩選對比,發(fā)現(xiàn)m/z=415.72(+2)特征離子在不同批次土鱉蟲樣品中均能檢測到(一級與二級圖譜見圖1),顯示出較高的響應(yīng)。

圖1 土鱉蟲特征離子提取質(zhì)譜圖(m/z=415.72)Fig.1 Characteristic ion extraction mass spectrometry (m/z=415.72) of Eupolyphaga Steleophaga

為了進一步確認(rèn)該特征離子的重現(xiàn)性。首先對土鱉蟲特征離子的二級離子的質(zhì)譜條件進行優(yōu)化和選擇,篩選出響應(yīng)較高的二級離子,分別為m/z415.72(雙電荷)→406.72、415.72(雙電荷)→667.34。之后取樣品粉末約0.1 g,平行稱定6份,按“1.2.1”項下制備供試品溶液,按“1.2.3”項下色譜條件及質(zhì)譜條件,以土鱉蟲特征分子離子峰m/z415.72(雙電荷)→406.72、415.72(雙電荷)→667.34作為檢測離子對,重復(fù)測試6次。6份土鱉蟲供試品溶液中均檢出相應(yīng)的土鱉蟲特征離子峰。

2.2 穩(wěn)定性試驗

按上述方法重新配制了6份供試溶液,并分別對放置于常溫0、2、4、8、10、12 h的供試溶液進行測定,從質(zhì)譜提取流圖發(fā)現(xiàn)該特征離子均能被檢測到。

2.3 樣品測定及定性鑒別

取24批土鱉蟲藥材(21批地鱉、3批冀地鱉)、6種不同動物藥(地龍、龜甲、僵蠶、雞內(nèi)金、蟬蛻、水蛭)藥材和3種土鱉蟲混偽品(金邊土鱉、金邊龍虱、美洲大蠊)藥材樣品,按“1.2.1”項下供試品制備方法制備供試品溶液和“1.2.3”項下色譜與質(zhì)譜條件分別進行測定,結(jié)果見表3及圖2,土鱉蟲(地鱉)與土鱉蟲(冀地鱉)特征離子色譜圖見圖3,土鱉蟲與其他動物藥特征離子色譜圖見圖4,以及土鱉蟲與其他3種非藥典土鱉蟲品種特征離子色譜圖見圖5。結(jié)果顯示,在相應(yīng)的保留時間處,以土鱉蟲對照藥材為參照,不同基原土鱉蟲藥材均檢出明顯色譜峰,不同動物藥(地龍、龜甲、僵蠶、雞內(nèi)金、蟬蛻、水蛭)和土鱉蟲混偽品(金邊土鱉、金邊龍虱、美洲大蠊)均未檢出色譜峰,因此該特征離子可有效區(qū)別土鱉蟲及其混偽品和其他動物藥。

圖2 21批土鱉蟲(地鱉)藥材提取流圖(m/z=415.72)Fig.2 Extracted ion chromatogram (m/z=415.72) of 21 batches of Eupolyphaga Steleophaga

圖3 土鱉蟲(地鱉)與土鱉蟲(冀地鱉)藥材提取流圖(m/z=415.72)Fig.3 Extracted ion chromatogram (m/z=415.72) between E.sinensis Walker and S.plancyi (Boleny)

圖4 土鱉蟲及其偽品提取流圖(m/z=415.72)Fig.4 Extracted ion chromatogram (m/z=415.72) of Eupolyphaga Steleophaga and its counterfeits

圖5 不同品種動物藥提取流圖(m/z=415.72)Fig.5 Extracted ion chromatogram (m/z=415.72) of different species of animal medicine

表3 藥材樣品質(zhì)譜測定結(jié)果Table 3 Mass spectrometry results of medicinal materials

2.4 土鱉蟲提取物及制劑測定應(yīng)用

取土鱉蟲提取物及市售含土鱉蟲成方制劑,按“1.2.1”項下供試品制備方法制備供試品溶液和“1.2.3”項下色譜與質(zhì)譜條件進行測定,結(jié)果見表4。土鱉蟲提取物和含土鱉蟲成方制劑特征離子色譜圖見圖6、圖7。結(jié)果顯示,在相應(yīng)的保留時間處,以土鱉蟲對照藥材為參照,21批土鱉蟲提取物及含土鱉蟲成方制劑均檢出明顯色譜峰,該特征離子可有效從土鱉蟲藥材傳遞至其相關(guān)提取物及成方制劑。

表4 土鱉蟲提取物及制劑樣品質(zhì)譜測定結(jié)果Table 4 Mass spectrometry results of Eupolyphaga Steleophaga extract and its preparations

圖6 21批土鱉蟲提取物提取流圖(m/z=415.72)Fig.6 Extracted ion chromatogram (m/z=415.72) of 21 batches of Eupolyphaga Steleophaga extract

圖7 含土鱉蟲成方制劑提取流圖(m/z=415.72)Fig.7 Extracted ion chromatogram (m/z=415.72) of formula containing Eupolyphaga Steleophaga extract

3 討論與結(jié)論

土鱉蟲已被證實具有治療各種疾病的功效[19],例如癌癥[20]、抑制血栓形成[21]、增強免疫[22]和治療股骨頭缺血性壞死[23]等。最近,報道發(fā)現(xiàn)土鱉蟲與水蛭和蜈蚣一起在子宮內(nèi)膜炎方面顯示出了明顯的臨床療效[24]。然而,正確識別土鱉蟲及含有土鱉蟲的方劑是困難的。目前,關(guān)于動物藥的質(zhì)量檢測多集中在性狀、顯微、薄層等檢測手段,且大多數(shù)動物藥含有的氨基酸、核苷類成分組成較為類似,也造成了目前動物藥品種鑒定和品質(zhì)分析的模糊性。因此,開發(fā)建立一系列具有專屬性的動物藥識別鑒定的分析方法對動物藥質(zhì)量控制和評價是至關(guān)重要的[25]。近年來,基于特征肽定性/定量分析的動物類中藥質(zhì)量控制模式已逐步推廣應(yīng)用,2020年版《中國藥典》中收載了阿膠、鹿角膠、龜甲膠的專屬肽鑒別方法,但尚無土鱉蟲中特征離子鑒別的方法。

本研究建立的特征離子通過蛋白質(zhì)酶切技術(shù),以1%碳酸氫銨溶液作為提取溶劑,以胰蛋白酶對樣品進行酶解后檢測;并對樣品分別進行提取方式、提取酶用量及提取時間等因素考察,確定最佳提取考察項分別為加熱回流(提取方式)、50 μL(提取酶用量)和30 min(提取時間)。

由于《中華人民共和國藥典》收載土鱉蟲質(zhì)量控制方法較為單一,導(dǎo)致在土鱉蟲市場上制假售假、以次充好的現(xiàn)象屢見不鮮。目前市場上土鱉蟲的價格持續(xù)上漲,不法分子為了經(jīng)濟利益,在土鱉蟲藥材中摻雜白礬和食鹽等成分增重獲利,甚至用偽品替代正品[1]。此外,金邊土鱉[26]亦收載至廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)中,作為地方習(xí)用品一直沿用,但研究顯示金邊土鱉與地鱉、冀地鱉的成分確有差異[27];同時不同動物藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑已失去飲片形態(tài)、難以鑒別,因此本研究建立了一種基于質(zhì)譜的特征離子鑒別技術(shù),發(fā)現(xiàn)m/z415.72(雙電荷)→406.72、415.72(雙電荷)→667.34能作為土鱉蟲鑒別的特征離子。通過對24批不同來源的土鱉蟲藥材、21批土鱉蟲提取物、6批含土鱉蟲成方制劑、6種不同動物藥及3種土鱉蟲混偽品進行應(yīng)用檢測,該檢測方法可適用于2種不同基原土鱉蟲,證實了該特征離子的專屬性,即使是對已失去原本藥材性狀的含土鱉蟲的中間體及制劑也有明顯區(qū)分。

同時,該方法簡單易用、重現(xiàn)性高,且無復(fù)雜的前處理流程,大大降低了該方法的實施門檻。雖然,大量研究表明以特征肽鑒別動物類中藥的方法是合理可行的,但相關(guān)質(zhì)量評價方法尚需要進一步豐富與完善,這也是未來中藥質(zhì)量控制研究的重要方向。綜上所述,本研究建立的方法將有效的補充土鱉蟲藥材及其飲片檢驗標(biāo)準(zhǔn)上的不足,解決了土鱉蟲長期以來僅能通過傳統(tǒng)經(jīng)驗來鑒別真?zhèn)蔚膯栴},提高其質(zhì)量控制水平,為土鱉蟲相關(guān)藥品臨床用藥的安全性和有效性提供參考依據(jù)。