劉潔，潘嘉，張力涵

阿爾茨海默?。ˋD）在中醫(yī)學屬于“呆病”、“健忘”、“癲病”等范疇，主要病機特點是由于年邁體虛，久病不復(fù)等導(dǎo)致五臟精氣虛衰，痰瘀阻痹，漸使腦髓虧虛，腦髓失養(yǎng)，神機失用所致。其病位在腦，歸于心，與五臟功能失調(diào)密切相關(guān)。根據(jù)中醫(yī)虛者補之，實則瀉之的原則，補益虛損，解郁散結(jié)為治則。還神至圣湯出自《辨證錄》卷四，處方記載為，人參一兩，白術(shù)一兩，茯神5錢、生棗5錢，廣木香3錢、制天南星3錢、荊芥3錢，甘草1錢、良姜1錢、附子1錢、枳殼1錢，菖蒲5分。主治呆病，具有開郁逐痰，健胃通氣之功效。本研究采用大鼠海馬區(qū)注射Aβ25-35淀粉酶建立AD模型，研究還神至圣湯對AD大鼠學習記憶能力的影響、探討其可能的作用機制，為臨床上本方劑用于治療AD患者提供可靠的理論依據(jù)及實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實驗藥物

根據(jù)《中國科學技術(shù)史·度量衡卷》考證的明清時期一兩約36.8 g，一錢約3.68 g，一分約0.37 g折算，參考《中華人民共和國藥典》（2020版）第一部推薦處方的用法用量并結(jié)合臨床醫(yī)師用藥經(jīng)驗，將還神至圣湯處方調(diào)整如下：人參5 g，白術(shù)20 g，茯神20 g、生棗20 g，廣木香3 g、制天南星3 g、荊芥9 g，甘草3 g、良姜3 g、附子3 g、枳殼3 g，菖蒲10 g。處方共計藥材102 g為成人一天用量。依據(jù)陳奇主編《中藥藥理研究方法學》（1993年）第1版附錄二“實驗動物與人用藥量換算”，以及黃繼漢發(fā)表的《藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算》，設(shè)定本實驗研究藥物低、中、高劑量分別為10.2、20.4、40.8 g·kg-1，相當于臨床劑量6倍，12倍，24倍。上述藥材均為免煎顆粒，購于成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，生產(chǎn)商：四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司。

1.2 動物

SD大鼠，50只，雄性♂，180-200 g，購自四川省中醫(yī)藥科學院。動物生產(chǎn)許可證號SCXK(川)2018-19，實驗動物使用許可證SYXK(川)2018-100。所有大鼠飼養(yǎng)于符合SPF的環(huán)境中（溫度20±2℃、濕度50%-70%、晝夜各12 h）。本研究經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學院動物中心倫理委員會批準，決議編號SYLL(2022)-054，實驗設(shè)計及實施過程中嚴格遵循動物實驗3R原則。

1.3 試劑

AKT，P-AKT，GSK3β，PI3K（abcam，ab179463，ab192623，ab280376，ab191606）。P-GSK3β(ser9)（CST， 5558T）。BCA蛋白定量試劑盒（Thermo， PICPI23223）。Aβ25-35淀粉酶(Sigma， 0000113656）-20℃避光保存，使用前溶解在0.9%的無菌的生理鹽水，配成濃度2.0 g.L-1，37℃孵育1周，使其成聚集態(tài)，然后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。戊巴比妥鈉(國藥集團化學試劑有限公司，WS20051129)。

1.4 儀器

68000系列大鼠腦定位儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；78001微型手持顱鉆(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；Morris水迷宮及視頻分析系統(tǒng)(成都泰盟公司， WMT-100)；電泳儀(美國BIORAD，mini protean 3 cell)。電轉(zhuǎn)儀（美國HOEFER，TE77XP）；酶標儀（美國PE, Victor Nivo）；成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，Tanon-5200）。

2 方法與結(jié)果

2.1 動物分組建模與給藥

50只SD大鼠按體重隨機分成5組，每組10只，設(shè)正常對照A組、模型對照B組、實驗藥物低劑量10.2 g.kg-1（C組）、中劑量20.4 g.kg-1（D組）、高劑量40.8 g.kg-1（E組）。動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，除正常對照A組外，其余各組動物按如下操作建立老年癡呆AD大鼠模型。各組動物腹腔注射60 mg.kg-1戊巴比妥鈉麻醉，將麻醉大鼠固定于腦立體定位儀，剪開頭部皮膚，暴露頭骨。于前囟后3.5 mm，中線旁開2 mm，硬腦膜下2.9 mm定位雙側(cè)海馬，并用顱骨鉆鉆孔。除假手術(shù)組外，采用微量注射泵于5 min內(nèi)緩慢注射5 μL（10 μg）老化1周的Aβ25-35淀粉樣蛋白溶液于大鼠右側(cè)大腦海馬組織，假手術(shù)組注射等量無菌生理鹽水。采用齒科水門汀封閉顱骨，縫合皮膚。每日連續(xù)腹腔注射青霉素鈉10萬U.只-1，連續(xù)3日，防止感染。模型建立后14天，實驗動物進行Morris水迷宮實驗。模型建立第2天，各組動物常規(guī)灌胃給藥，每日按照100 g.mL-1常規(guī)灌胃給予大鼠，連續(xù)給藥30天，正常對照組、模型組給予等體積生理鹽水。每周對實驗大鼠稱重1次，并根據(jù)體重調(diào)整給藥體積。給藥結(jié)束后24 h，大鼠用戊巴比妥鈉麻醉腹股溝放血處死，并剖取大鼠大腦的左右側(cè)海馬組織，并置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 Morris水迷宮實驗

Morris 水迷宮實驗分為前5 d的定位航行實驗和第 6 d 的空間探索實驗。將水迷宮圓形水池分為四個象限， 逃生平臺置于其中一個象限內(nèi)。第 1 d 至第 5 d 進行訓(xùn)練實驗，每天上午和下午的固定時間訓(xùn)練一次， 將大鼠面向池壁從除平臺之外的其它三個象限隨機放入水中，記錄大鼠在120 s內(nèi)找到平臺的時間即逃避潛伏期，大鼠找到平臺后或120 s內(nèi)找不到平臺（潛伏期記為120 s），則由實驗者將其引導(dǎo)到平臺，在平臺上停留20 s。連續(xù)訓(xùn)練4天觀察記錄大鼠從入水到找到安全平臺所需的潛伏時間，每日以大鼠2次訓(xùn)練的潛伏期平均值作為當日的學習成績。實驗第5 d，進行定位巡航實驗，記錄每只大鼠從入水到找到平臺所需的潛伏期時間。實驗第6 d進行空間探索實驗，撤掉安全平臺，大鼠從任一入水點放入水中，記錄大鼠在目標象限停留時間百分比。

2.3 免疫印跡Western blot實驗

將大鼠右側(cè)海馬組織勻漿加入RAPI裂解液至細胞完全裂解后充分震蕩。裂解后的樣品于4℃，12000 r·min-1離心15 min，取上清液，進行蛋白質(zhì)定量后貯存于-80℃冰箱。根據(jù)BCA方法檢測蛋白濃度，蛋白變性。按照上樣量為15 μg蛋白，計算上樣量。電泳結(jié)束后用PVDF膜轉(zhuǎn)印。5%脫脂奶粉液封閉1 h，一抗，根據(jù)說明書稀釋抗體，抗體加入封閉液中稀釋到所需濃度，和膜室溫孵育2 h或4℃孵育過夜。 二抗，孵育一抗的膜用TBST洗滌3次，每次5 min。隨后根據(jù)用量，按照1:1000稀釋HRP標記的二抗，與膜37℃孵育1 h。用TBST洗滌3次，每次5 min。滴加 ECL 工作液并曝光拍照， 用 Image J 軟件定量分析目的蛋白條帶，進行灰度分析。

2.4 統(tǒng)計學方法

2.5 結(jié)果

2.5.1 還神至圣湯對AD大鼠學習記憶功能的影響 Mor-ris 水迷宮實驗結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型對照組大鼠平臺逃避潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)和目標象限停留時間的百分比明顯減少( P＜0.05) 。與模型對照組相比，還神至圣湯（相當于原生藥）10.2、20.4、40.8 g.kg-1劑量組平臺逃避潛伏期明顯減少，穿越平臺次數(shù)和目標象限停留時間百分比明顯增加( P＜0.05)。說明還神至圣湯各劑量可改善由Aβ25-35淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的AD模型大鼠的學習記憶能力。見表 1，表2。

表1 還神至圣湯對AD大鼠平臺逃避潛伏期的影響（± s，n=10）

表1 還神至圣湯對AD大鼠平臺逃避潛伏期的影響（± s，n=10）

注：與正常對照組比較，模型對照組△P＜0.05；與模型對照組比較，*P＜0.05

平臺逃避潛伏期（s）D1D2D3D4D5正常對照組NS57.8±16.050.6±14.841.3±9.732.9±10.926.3±8.6模型對照組NS69.9±5.5△65.10±6.6△57.4±15.2△46.90±11.5△38.2±10.6△藥物低劑量組10.261.5±8.4*52.9±13.5*43.1±8.5*33.4±12.3*27.5±6.5*藥物中劑量組20.461.1±8.1*53.5±14.2*44.00±7.8*32.9±11.7*28.4±10.2*藥物高劑量組40.853.5±7.2*52.60±15.9*43.20±12.0*33.1±13.2*27.1±7.8*組別劑量g.kg-1

表2 還神至圣湯對AD大鼠穿越平臺次數(shù)和目標象限停留時間百分比的影響（± s，n=10）

表2 還神至圣湯對AD大鼠穿越平臺次數(shù)和目標象限停留時間百分比的影響（± s，n=10）

注：與對照組比較，模型對照組△P＜0.05；與模型對照組比較，*P＜0.05

組別劑量g.kg-1穿越平臺次數(shù)/n 目標象限停留時間/%正常對照組NS5.2±1.536.8±11.4模型對照組NS2.8±1.6△22.2±6.4△藥物低劑量組10.24.4±1.0*29.3±8.1*藥物中劑量組20.44.5±1.4*29.7±9.1*藥物高劑量組40.84.3±1.2*30.1±8.4*

2.5.2 還神至圣湯對AD大鼠PI3K、Akt、p-Akt、GSK3 β、p-GSK3β蛋白表達的影響 Western blot實驗結(jié)果可知，與對照組比較，模型對照組PI3K、p-Akt、p-GSK3β在ser9位點蛋白表達明顯降低（P＜0.05）,而AKT、GSK3β蛋白含量無明顯變化（P＞0.05）。與模型對照組比較，還神至圣湯各劑量組AKT、GSK3β蛋白表達無明顯變化（P＞0.05）; 而20.4 、40.8 g.kg-1劑量組PI3K、p-Akt蛋白含量增加明顯，20.4 g.kg-1劑量組p-GSK3β在ser9位點蛋白含量也明顯增加（P＜0.05）。模型對照組p-Akt/AKT、p-GSK3β/GSK3β比值明顯降低（P＜0.05），而20.4 g.kg-1、40.8 g.kg-1劑量組比值相對模型對照組有明顯增加（P＜0.05），表明還神至圣湯中、高劑量可上調(diào)由Aβ25-35淀粉樣蛋白引起的AD模型大鼠海馬組織PAkt、p-GSK3β在ser9位點蛋白含量表達（表3、4、圖1-3）

圖1 PI3K/Akt/GSK-3β信號通路及其相關(guān)蛋白表達情況

圖3 各組大鼠GSK-3β磷酸化/GSK-3β比較

表3 還神至圣湯對AD大鼠PI3K、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β蛋白含量的影響（± s，n=10）

表3 還神至圣湯對AD大鼠PI3K、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β蛋白含量的影響（± s，n=10）

注：與正常對照組比較，△P＜0.05；與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

p-GSK3β/β-actin正常對照組NS0.496±0.0090.852±0.0110.446±0.0270.844±0.0450.394±0.030模型對照組NS0.377±0.015△0.892±0.0720.287±0.015△0.843±0.0260.289±0.055△藥物低劑量組10.20.389±0.0090.860±0.0200.317±0.0370.838±0.0550.397±0.156藥物中劑量組20.40.439±0.035*0.868±0.0200.382±0.056*0.752±0.0960.410±0.134藥物高劑量組40.80.452±0.029*0.849±0.0070.396±0.034**0.845±0.0030.441±0.077*組別劑量g.kg-1PI3K/β-actinAkt/β-actinp-Akt/β-actinGSK3β/β-actin

表4 還神至圣湯對AD大鼠p-Akt/AKT、p-GSK3β/GSK3β蛋白含量比值的影響（± s，n=10）

表4 還神至圣湯對AD大鼠p-Akt/AKT、p-GSK3β/GSK3β蛋白含量比值的影響（± s，n=10）

注：與正常對照組比較，△P＜0.05；與模型對照組比較，*P＜0.05，*P＜0.01

組別劑 量g.kg-1p-Akt/AKTp-GSK3β/GSK3β正常對照組NS0.533±0.0390.461±0.011模型對照組NS0.328±0.013△0.345±0.056△藥物低劑量組10.20.356±0.0360.517±0.160藥物中劑量組20.40.440±0.064*0.560±0.103*藥物高劑量組40.80.476±0.040**0.495±0.092*

3 討論

阿爾茨海默病(Alzheimer，s disease，AD)是一種以進行性記憶減退和認知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是中老年癡呆的主要原因。臨床上以近似記憶力下降為明顯特征，并逐步發(fā)展為注意力、計算力、執(zhí)行力等下降的全面癡呆，同時伴有精神人格改變及日常生活能力下降，給患者、家庭及社會帶來了嚴重困擾及負擔。隨著全球人口老齡化的快速進展，AD的發(fā)病率逐年增加。據(jù)2021年《中國阿爾茨海默病報告2021》，我國AD發(fā)病率已超過1000萬人口，全球超5000萬，預(yù)計到2050年，全球AD患者數(shù)量將上升至1.52億。

目前比較認可AD的發(fā)病機制為：①Tau蛋白異常聚集，成對的螺旋狀纖維轉(zhuǎn)化為 NFTs，微管穩(wěn)定性降低導(dǎo)致突觸丟失，神經(jīng)元功能受損，最終導(dǎo)致大腦神經(jīng)退行性病變和神經(jīng)元死亡。②大腦海馬區(qū)β-淀粉樣蛋白在細胞外沉積形成老年斑SP。③突觸連接丟失及突觸功能異常；④相關(guān)基因?qū)W說，如APP、PSEN1/2、ApoE基因等；⑤免疫異常學說，大腦中過度的炎性反應(yīng)激活引起神經(jīng)元損害和死亡；⑥早期細胞因子功能障礙。[1,2]

還神至圣湯出自《辨證錄》卷四，主治呆病，具有開郁逐痰，健胃通氣之功效。方中諸藥合用，扶正祛邪，標本兼顧，為呆病治療之良方。本課題基于方劑治療呆病的中醫(yī)理論及臨床經(jīng)驗，研究方劑對AD大鼠學習記憶能力的影響。Morris水迷宮實驗研究表明，還神至圣湯10.2 g.kg-1、20.4 g.kg-1、40.8 g.kg-1劑量組可明顯減少AD模型動物平臺逃避潛伏期，增加穿越平臺次數(shù)和目標象限停留時間百分比 ( P＜0.05)，表明藥物可改善由 Aβ25-35淀粉樣蛋白致AD模型大鼠的學習記憶能力。

PI3K /Akt 信號通路是細胞內(nèi)抗凋亡，參與細胞增殖、分化的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Akt是PI3K信號通路下游靶分子，在PI3K依賴激酶( PI3K-dependent kinase，PDK) 的作用下，Akt的磷酸化被激活調(diào)節(jié)細胞生長和遷移細胞的生存功能，調(diào)控下游蛋白。GSK3β是Akt主要下游靶分子之一，也是Tau蛋白磷酸化關(guān)鍵的調(diào)節(jié)酶[3,4]，GSK-3β在Ser9位點磷酸化能抑制Tau蛋白磷酸化，從而抑制 Aβ的聚集[5]。PI3K /Akt /GSK3β信號通路與AD神經(jīng)元的形態(tài)及功能結(jié)構(gòu)改變具有相關(guān)性，并能夠維持神經(jīng)干細胞存活，影響AD的發(fā)生和發(fā)展[7,8]。Western blot實驗結(jié)果表明，模型對照組PI3K、p-Akt、p-GSK3β在Ser9位點蛋白表達明顯降低（P＜0.05）, 而AKT、GSK3β蛋白含量無明顯變化（P＞0.05），導(dǎo)致Aβ聚集增加，模型動物腦內(nèi)PI3K/AKT/GSK-3β信號通路活性明顯降低。還神至圣湯20.4、40.8 g.kg-1中、高劑量可上調(diào)PI3K、p-Akt、p-GSK3β在Ser9位點蛋白含量，從而上調(diào)p-Akt/AKT、p-GSK3β/GSK3β的比值，抑制Aβ聚集，降低其神經(jīng)毒性作用。

綜上所述，還神至圣湯可改善 AD 大鼠學習記憶能力，其改善AD大鼠學習記憶能力的作用機制與PI3K /Akt /GSK3β信號通路有關(guān)，但更具體的機制還有待更加深入的研究。