陳思羽，王越，林麗婷，文飛燕，裴瑾

肺經(jīng)草始見于《天寶本草》，載：“肺經(jīng)草即半邊錢[1]。”經(jīng)考證《天寶本草》中肺經(jīng)草為傘形科Umbelliferae薄片變豆菜Sanicula lamelligeraHance的干燥全株[2]。肺經(jīng)草在《中國(guó)民族藥辭典》、《中國(guó)民族藥志》、《中藥大辭典》、《中華本草》、《四川省中藥資源志要》等也均有記載?！吨兴幋筠o典》和《中華本草》記載為：大肺筋草為“傘形科變豆菜屬Sanicula薄片變豆菜Sanicula lamelligeraHance和天藍(lán)變豆菜Sanicula coerulescensFranchet[3,4]。”同時(shí)，《四川中藥飲片炮制規(guī)范》1977年版和1984年版收載的“肺筋草”，均為傘形科植物薄片變豆菜干燥全株。生長(zhǎng)在海拔500～2000m的陰濕山坡，溝邊，路旁及林下的濕潤(rùn)砂質(zhì)土壤，溪邊濕地路旁竹林或陰濕雜木林下[5,6]。產(chǎn)于四川樂山、峨眉、都江堰、涼山州等地區(qū)。依據(jù)大量文獻(xiàn)記載和實(shí)地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，雖然四川省民間作肺經(jīng)草使用的有變豆菜屬6種2變種，但形成商品品種流通的僅有薄片變豆菜和天藍(lán)變豆菜[7,8]，故將薄片變豆菜和天藍(lán)變豆菜作為肺經(jīng)草基原種。

肺經(jīng)草中主要含黃酮、三萜皂苷、倍半萜類成分[9-13]，其中黃酮類成分可能與其化痰止咳，活血調(diào)經(jīng)的藥理作用有關(guān)。周小江對(duì)肺經(jīng)草品質(zhì)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，肺經(jīng)草的乙酸乙酯提取部位的主要成分為總黃酮成分，具有良好的祛痰作用[14,15]。有研究表明，肺經(jīng)草中總黃酮成分具有一定的抑制流感病毒增殖的作用[16]，Liu[17]從肺經(jīng)草中提取得到一個(gè)新的黃酮苷元—saniculamin C，對(duì)人胃癌細(xì)胞有強(qiáng)效抗增殖活性，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，《天寶本草》記載：“肺經(jīng)草即半邊錢，專包臍風(fēng)又化痰哮吼咳嗽，稱第一，四時(shí)感冒，散風(fēng)寒[18]?！薄吨袊?guó)民族藥辭典》記載：“全草治風(fēng)濕疼痛；全草（燉肉）治瘦弱；全草（泡酒）治跌打損傷[19]?！彼员緦?shí)驗(yàn)依據(jù)古籍和現(xiàn)代研究，擬將總黃酮作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制物。

規(guī)范化的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立是肺經(jīng)草現(xiàn)代化研究的重要內(nèi)容，本研究按照《中國(guó)藥典》2020年版中相關(guān)規(guī)定、參照藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定方法，對(duì)來自不同產(chǎn)地、基原的11批肺經(jīng)草藥材進(jìn)行形態(tài)、性狀、顯微特征和薄層色譜鑒別，對(duì)其水分、灰分、浸出物等進(jìn)行檢查，并以總黃酮成分和黃酮類化合物槲皮素為指標(biāo)建立提取和HPLC含量測(cè)定方法，以期建立肺經(jīng)草藥材規(guī)范化的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為其質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Ulti Mate 3000型高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、SOP型電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）、DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、ZF-90型紫外分析儀（溫州奧利生物醫(yī)學(xué)儀器廠）、HWS24型電子恒溫水浴鍋（上海一恒）、Spectra Max iD3型酶標(biāo)儀（美谷分子儀器上海有限公司）、Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 250mm×150 mm，5μm（安捷倫科技中國(guó)有限公司）、DM2500型萊卡電子顯微鏡（青島泰斯鼎科技有限公司）。

1.2 藥物與試劑

蘆丁對(duì)照品（純度≥9 8%，批號(hào)M U S T-21101104，成都市科恩化學(xué)品有限公司），槲皮素對(duì)照品（純度≥98%，批號(hào)MUST-21101104，成都市科恩化學(xué)品有限公司）；甲醇、甲酸、乙醇、甲苯、乙酸乙酯等為分析純，均購(gòu)于成都市科恩化學(xué)品有限公司。Silica gel 60型鋁箔板（德國(guó)Merck公司）；Silica gel 60型高效硅膠薄層層析板（德國(guó)Merck公司）；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）。

11批肺經(jīng)草藥材由野外采集和藥材市場(chǎng)購(gòu)買，經(jīng)由成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室裴瑾教授鑒定為傘形科變豆菜屬植物薄片變豆菜Sanicula lamelligeraHance和天藍(lán)變豆菜Sanicula coerulescensFranchet的干燥全草。11批樣品的詳細(xì)信息（見表1）。

表1 肺經(jīng)草樣品采集信息表

2 方法

2.1 植物形態(tài)

薄片變豆菜Sanicula lamelligera Hance 多年生矮小草本，高15～50cm。全株無毛。根莖粗短，多數(shù)細(xì)長(zhǎng)的側(cè)根，棕褐色。莖3～17，直立，花葶狀、上部分；基生葉葉柄長(zhǎng)5～18cm，葉片橢圓形或心形，長(zhǎng)2～6cm，寬3～9cm，掌狀三裂，中裂片楔狀倒卵形或橢圓狀倒卵形至菱形，上部3淺裂，基部楔形、有短柄；最上部的莖生葉小，三裂至不分裂，裂片線狀披針形，葉片背面有較明顯的葉脈，淡紫紅色或淺綠色，表面綠色?；ㄐ蛲ǔ６了幕囟绶种Γ~緣有刺毛；花瓣白色。果實(shí)為雙懸果，長(zhǎng)卵形或卵形，長(zhǎng)2.5mm，寬2mm，幼果表面有嚙蝕狀或微波狀薄層，成熟后成短直皮刺、基部連成薄片；花、果期4～11月。

天藍(lán)變豆菜Sanicula coerulescens Franch. 本品與薄片變豆菜的區(qū)別為：側(cè)生的傘形花序無柄，花序呈假總狀花序，萼齒線形或呈刺毛狀?；ā⒐?～7月（見圖1）。

圖1 肺經(jīng)草原植物圖1-薄片變豆菜；2-天藍(lán)變豆菜

2.2 藥材性狀鑒別

藥材多皺縮成團(tuán)，根莖短，須根多呈黑褐色?；~葉柄長(zhǎng)至近20cm；葉片常破碎，完整者展平后呈心狀卵形、圓心形或近五角形，長(zhǎng)2～7cm，寬3～10cm，掌狀三裂，葉緣具缺刻或圓鋸齒；葉上表面灰綠色、黃綠色至黃褐色，下表面黃綠色、黃褐色或紫褐色，可見明顯的紫褐色或深褐色的葉脈。帶花者，傘形花序或呈假總狀花序，細(xì)小。可見雙懸果，球形、長(zhǎng)卵形或卵形，長(zhǎng)2～3mm，果實(shí)表面具短而直的皮刺。質(zhì)脆易碎，氣微，味淡，微苦。

天藍(lán)變豆菜與薄片變豆菜的區(qū)別：側(cè)生的傘形花序無柄，花序呈假總狀花序；萼齒線形或呈刺毛狀（見圖2）。

圖2 肺經(jīng)草藥材圖1-薄片變豆菜；2-天藍(lán)變豆菜

2.3 粉末顯微特征鑒別

薄片變豆菜的粉末為灰黃綠色至灰褐色，氣微，味淡，微苦。草酸鈣簇晶，直徑15～40μm，棱角多銳尖。淀粉粒單?；蚨嗔４嬖冢瑱E圓形或圓形，直徑5～10μm，復(fù)粒由2～4個(gè)分粒組成導(dǎo)管多為螺紋導(dǎo)管，少見網(wǎng)紋導(dǎo)管，長(zhǎng)40～400μm，直徑8～10μm。纖維成束存在，微木化或木化。木栓細(xì)胞淡黃色，長(zhǎng)方形或類圓方形，排列緊密，垂周壁微波狀增厚。表皮細(xì)胞垂周壁波狀彎曲，氣孔不定式或不等式。（見圖3）

圖3 肺經(jīng)草粉末顯微特征圖1-簇晶；2-導(dǎo)管；3-纖維束；4-表皮細(xì)胞及氣孔；5-木栓細(xì)胞

天藍(lán)變豆菜粉末顏色、氣味、顯微特征與薄片變豆菜類似，只是在長(zhǎng)度大小方面有差異，天藍(lán)變豆菜導(dǎo)管長(zhǎng)度平均值小于薄片變豆菜，簇晶雖有但數(shù)量不及薄片變豆菜。

2.4 薄層色譜鑒別

2.4.1 供試品溶液制備 取本品粉末1g，加80%甲醇50ml，加熱回流1h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0ml使溶解，用乙醚萃取2次，每次20ml，棄去乙醚液，水液加乙酸乙酯振搖提取2次，每次20ml，棄去水液，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液。另取肺經(jīng)草對(duì)照藥材粉末1g，同法制成對(duì)照藥材溶液[20-23]。

2.4.2 薄層色譜條件及結(jié)果 照薄層色譜法（中國(guó)藥典2020年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上。以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5:4:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在Rf值0.2～0.7范圍內(nèi)，應(yīng)呈現(xiàn)1個(gè)淺藍(lán)色主斑點(diǎn)（見圖4）。

圖4 肺經(jīng)草樣品TLC圖

2.5 藥材檢查項(xiàng)

對(duì)藥材進(jìn)行常規(guī)檢查可以有效評(píng)價(jià)藥材的優(yōu)劣。水分照《中國(guó)藥典》2020年版水分測(cè)定法通則0832第二法測(cè)定[24]；總灰分和酸不溶性灰分照《中國(guó)藥典》2020年版灰分測(cè)定法通則2302測(cè)定[25]；浸出物根據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版浸出物測(cè)定法通則2201項(xiàng)下的熱浸法進(jìn)行測(cè)定[26]。11批樣品的水分、總灰分、酸不溶性灰分和浸出物的測(cè)定結(jié)果（見表2）。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，11批樣品的水分在11.162%～13.178%，平均為12.056%；總灰分在13.932%～28.570%，平均為17.692%；酸不溶性灰分在1.063%～6.551%，平均為2.638%；水浸出物（熱浸法）在15.707%～22.827%，平均為19.027%。

表2 肺經(jīng)草樣品檢查項(xiàng)測(cè)定結(jié)果（n=3）

2.6 總黃酮含量測(cè)定

2.6.1 蘆丁對(duì)照品溶液制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品5mg，用50%乙醇定容溶解并定容至25ml，配成0.2mg·ml-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6ml，分別置25ml量瓶中，各加水至6.0ml，加5%亞硝酸鈉溶液1ml，混勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液1ml，搖勻，放置6min，加氫氧化鈉試液10ml，再加水至刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法（2020年版《中國(guó)藥典》四部，通則0401[27]），在500nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以濃度（X，mg·ml-1）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.6.3 供試品溶液制備和測(cè)定方法 取薄片變豆菜粉末（過三號(hào)篩）0.5g，采用超聲提取的方法，選取體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液、料液比1:20（g·ml-1）、提取時(shí)間30min、超聲功率（100W，100HZ），過濾，精密量取0.5ml濾液，置25ml容量瓶中，加蒸餾水定容，搖勻，即得。照“2.6.2”項(xiàng)下，自“加水至6ml”起，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取供試品溶液中含蘆丁的濃度（mg·ml-1），計(jì)算，即得[28,29]。

2.6.4 加樣回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，對(duì)已知濃度的藥材粉末提取液6份，分別加入已知濃度50%的對(duì)照品溶液，按“2.6.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，計(jì)算得RSD為1.674%（n=6）（見表3）。

表3 肺經(jīng)草樣品加樣回收率結(jié)果（n=6）

2.6.5 線性關(guān)系考察 以濃度（X，mg·ml-1）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程Y =10.593X+0.0044（r=0.9991，n=6）。結(jié)果表明，蘆丁對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度在0.0083～0.0495 mg·ml-1的范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.6.6 測(cè)定結(jié)果 稱取11批樣品，按“2.6.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定吸光度。11批樣品的總黃酮含量測(cè)定結(jié)果（見表4）。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，總黃酮含量在1.658%～6.598%之間，平均值為3.420%。

表4 肺經(jīng)草樣品總黃酮含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

2.7 槲皮素含量測(cè)定

2.7.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18（250mm×150 mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50）；檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm；流速1mL min-1；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：25℃。

2.7.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取槲皮素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含10μg的溶液。

2.7.3 供試品溶液制備 精密稱取藥材粉末（過三號(hào)篩）約2g，置于250ml具塞錐形瓶中，精密加入50ml 80%甲醇，稱定質(zhì)量，加熱回流1.5h，取出，放冷，80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25ml，加濃鹽酸5ml，加熱回流1.5h，放涼，轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.7.4 系統(tǒng)適應(yīng)性考察 取對(duì)照品、供試品溶液適量，在“2.7.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定（見圖5）。由此可知，各成分色譜峰周圍無干擾峰，與其它峰完全分離（分離度＞1.5），理論塔板數(shù)以槲皮素計(jì)，不低于5000。

圖5 對(duì)照品和肺經(jīng)草供試樣品HPLC圖

2.7.5 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液適量，逐級(jí)稀釋，定容，制得6個(gè)質(zhì)量濃度，在“2.7.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以槲皮素峰面積（y）對(duì)樣品濃度（x）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：y=2.5097x-0.4215，R2=0.9929，表明槲皮素含量在1μg·ml-1～6μg·ml-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7.6 方法學(xué)考察 對(duì)該方法進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)所得結(jié)果均符合分析要求。

2.7.7 樣品含量測(cè)定 取11批藥材，按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.7.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量結(jié)果（見表5）。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，槲皮素含量在0.0000168～0.000104 mg·g-1之間。因其平均值含量小于千分之一，不納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

表5 供試品中槲皮素含量測(cè)定結(jié)果（ˉx±SD, n = 3）

3 討論

本文依據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版四部通則，分別從性狀鑒別、顯微鑒別、薄層色譜鑒別對(duì)肺經(jīng)草藥材進(jìn)行了定性鑒別，從水分、總灰分、酸不溶灰分、水熱浸法對(duì)肺經(jīng)草藥材進(jìn)行了檢查，以蘆丁為對(duì)照品進(jìn)行了總黃酮含量測(cè)定，同時(shí)以槲皮素為對(duì)照品進(jìn)行了HPLC含量測(cè)定，系統(tǒng)開展了肺經(jīng)草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。通過研究發(fā)現(xiàn)，薄片變豆菜與天藍(lán)變豆菜之間在根、莖、葉有極大的相似性，2者之間的區(qū)別為：薄片變豆菜花序?yàn)槎绶种?，天藍(lán)變豆菜側(cè)生的傘形花序無柄，花序呈假總狀花序；萼齒線形或呈刺毛狀。綜合評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地及批次的11批樣品結(jié)果。

肺經(jīng)草現(xiàn)主產(chǎn)于成都平原及周邊地區(qū)，夏秋季節(jié)雨水較多，故應(yīng)保持藥材干燥，規(guī)定水分不得過14.000%。根據(jù)測(cè)定結(jié)果FJC-3的總灰分含量為28.570%，F(xiàn)JC-5的酸不溶灰分為6.551%，均高于平均值。查看原藥材性狀可知，市場(chǎng)購(gòu)買的藥材為直接采挖曬干，并未進(jìn)行過任何清洗加工，所以含的泥沙較多；考慮此標(biāo)準(zhǔn)有著規(guī)范市場(chǎng)的作用，故規(guī)定總灰分不得過20.000%，酸不溶性灰分不得過4.000%。浸出物測(cè)定時(shí)，對(duì)冷浸法和熱浸法進(jìn)行考察，其中熱浸法中以水為溶劑含量最高，這也與民間民族常用用法水煎煮相吻合，因此擬定浸出物含量不得少于15.000%?？傸S酮與肺經(jīng)草的藥效息息相關(guān)，根據(jù)測(cè)定的數(shù)據(jù)，擬定總黃酮含量以蘆?。–27H30O16）計(jì)，不得少于2.000%，但由于槲皮素含量較少，作者不建議將槲皮素作為質(zhì)量標(biāo)志控制物。因此，確定肺經(jīng)草藥用基原植物為傘形科變豆菜屬薄片變豆菜Sanicula lamelligeraHance和天藍(lán)變豆菜Sanicula coerulescensFranchet的干燥全草。

本實(shí)驗(yàn)采取的方法經(jīng)過多次篩選獲得。薄層色譜鑒別比較了甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5:5:1、5:4:1、5:3:1）、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸-水（6:12:5:2）等展開系統(tǒng)，經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，確定甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5:4:1）為展開系統(tǒng)，最終得到的薄層色譜斑點(diǎn)分離度較好，還增加了2種基原的對(duì)照藥材，提高了TLC法的專屬性。同時(shí)比較了不同廠家，不同類型的薄層色譜板和鋁箔板并進(jìn)行耐用性考察，結(jié)果均表明本方法的專屬性和耐用性良好。本實(shí)驗(yàn)在對(duì)肺經(jīng)草總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定時(shí)，考察了三種因素—乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和提取時(shí)間對(duì)其提取率的影響，設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)：50、60、70、80、90%；料液比：1:20、1:30、1:40、1:50、1:60；提取時(shí)間：30、45、60、75、90min。最終確定肺經(jīng)草總黃酮提取料液比為20:1，乙醇濃度為50%，提取時(shí)間為30min。

本研究為四川省藥品監(jiān)督管理局《四川省民族藥材標(biāo)準(zhǔn)》品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定科研項(xiàng)目?jī)?nèi)容之一，綜合評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地及批次的11批樣品結(jié)果。根據(jù)研究結(jié)果擬定了肺經(jīng)草質(zhì)量控制指標(biāo)，填補(bǔ)了肺經(jīng)草作為藥材入藥無相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的空白，區(qū)別于現(xiàn)行藥典日漸提高精細(xì)化的標(biāo)準(zhǔn)制定方向，本標(biāo)準(zhǔn)是實(shí)用性和適用性兼?zhèn)涞膶?shí)用標(biāo)準(zhǔn)，落地可實(shí)施，能很好地規(guī)范市場(chǎng)，同時(shí)也為肺經(jīng)草資源的進(jìn)一步綜合利用與開發(fā)奠定基礎(chǔ)。