曹雪峰，趙亮，方波，劉旭東，段鳳梅，姬云飛

（1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，河北 承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，河北 承德 067000；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，沈陽(yáng) 110001；4.承德市中心醫(yī)院麻醉疼痛科，河北 承德 067000）

心肌肥厚是重要心血管疾病的高危因素，是心功能惡化及心源性死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，會(huì)增加冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、充血性心力衰竭等其他心血管疾病的發(fā)生率，而這些疾病都易導(dǎo)致患者病死率的增加甚至猝死的發(fā)生［1-2］。對(duì)于心肌肥厚的治療，目前仍局限于降低心肌收縮力、擴(kuò)張血管和降低后負(fù)荷等手段，很少直接針對(duì)心肌肥大的形成過(guò)程進(jìn)行干預(yù)。心肌肥厚的改善可以降低心血管疾病的危險(xiǎn)性，深入研究心肌肥厚的發(fā)生機(jī)制，將為藥物干預(yù)及防治心肌肥厚開(kāi)拓全新的思路。

右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）是一種α2-腎上腺素能受體（α2-adrenergic receptor，α2-AR）激動(dòng)劑，對(duì)心血管有直接作用，目前研究［3-7］主要針對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。DEX具有抗交感和穩(wěn)定循環(huán)的功能，圍手術(shù)期使用DEX可改善行心臟手術(shù)患者的預(yù)后［8］，目前關(guān)于DEX對(duì)病理性心肌肥大的保護(hù)作用研究甚少。本研究旨在探究DEX通過(guò)誘發(fā)代償性心肌肥大來(lái)改善病理性心肌肥大的過(guò)程。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本三洋株式會(huì)社PHCbi公司）；倒置顯微鏡（日本奧林巴斯株式會(huì)社Olympus公司）；低溫恒速變速離心機(jī)（德國(guó)艾本德股份公司Eppendorf公司）；ECL化學(xué)發(fā)光儀（中國(guó)天能科技責(zé)任有限公司Tanon公司）；激光掃描共聚焦顯微成像系統(tǒng)FV3000（日本奧林巴斯株式會(huì)社）。

1.2 主要藥品與試劑

DEX（批號(hào) HY-12719，純度 99.63%）購(gòu)自美國(guó)新澤西MedChemExpress生物科技有限公司；高糖培養(yǎng)基（批號(hào) C11330500BT）購(gòu)自中國(guó)武漢普諾賽生命科技有限公司（規(guī)格：500 mL/瓶）；南美胎牛血清（批號(hào) 10270106）購(gòu)自中國(guó)Gibco賽默飛世爾科技股份有限公司（規(guī)格：500 mL/瓶）；胰蛋白酶含EDTA（批號(hào) 10039232）購(gòu)自中國(guó)Phygene飛凈生物高新技術(shù)股份有限公司（規(guī)格：100 mL/瓶）；二甲基亞砜（批號(hào) KMO0697）購(gòu)自中國(guó)天津科密歐化學(xué)試劑有限公司（規(guī)格：500 mL/瓶）。心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）抗體（批號(hào) ab189921）購(gòu)自英國(guó)Abcam生物科技有限公司（規(guī)格：100 μL/支）；腦尿鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）（批號(hào) ab19646）、肌球蛋白重鏈（β- myosin heavy chain，β-MHC）抗體和α-actinin抗體（批號(hào) EP2528Y）均購(gòu)自英國(guó)Abcam生物科技有限公司（規(guī)格：100 μL/支）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為6組，無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h作為對(duì)照組（C組）；無(wú)血清培養(yǎng)液中加血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，Ang Ⅱ，1 μmol/L），細(xì)胞培養(yǎng)24 h作為模型組（A組）；無(wú)血清培養(yǎng)液中加入Ang Ⅱ（1 μmol/L）+ DEX（5 μmol/L），培養(yǎng)24 h作為右美托咪定組（AD組）；無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞48 h作為C’組；無(wú)血清培養(yǎng)液加入Ang Ⅱ（1 μmol/L），培育24 h，停藥24 h作為A’組；無(wú)血清培養(yǎng)液加入DEX（5 μmol/L）+Ang Ⅱ（1 μmol/L），培育24 h，停藥24 h作為AD’組。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 新生大鼠心室肌細(xì)胞（neonatal rat ventricle myocytes，NRVMs）分離培養(yǎng)：無(wú)菌環(huán)境下，將新生大鼠心室肌剪成1 mm3，用DMEM沖洗。棄去上清液，加入含0.25%胰蛋白酶消化，37 ℃進(jìn)行5 min，棄去消化液，細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有20 mL DMEM 培養(yǎng)液的試管中，以1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，細(xì)胞沉淀再次用培養(yǎng)液重懸。重懸液經(jīng)篩網(wǎng)過(guò)濾，用差速貼壁分選法分離2 h后計(jì)數(shù)，以1×105/cm2細(xì)胞濃度接種于培養(yǎng)皿中，3 d后可以用于實(shí)驗(yàn)。本研究獲得承德醫(yī)學(xué)院動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)批準(zhǔn)，并按照《國(guó)家衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心小動(dòng)物區(qū)動(dòng)物使用》要求執(zhí)行。

1.4.2 離體心肌肥厚模型建立：細(xì)胞貼壁3 d后，用含有1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液替換正常細(xì)胞培養(yǎng)液，加入濃度為1 μmol/L的Ang Ⅱ，于37 ℃、5%CO2、95%濕度環(huán)境中培養(yǎng)，培養(yǎng)1 d后，通過(guò)檢測(cè)心肌細(xì)胞面積、體積、肥大相關(guān)基因（ANP、BNP和β-MHC）蛋白含量來(lái)判斷模型是否成功。

1.4.3 免疫熒光化學(xué)染色：心肌細(xì)胞用PBS洗3 遍，冷甲醇固定30 min，加入TritonX2100，1%BSA室溫孵育1 h，封閉羊血清封閉5 h，一抗37 ℃孵育，熒光二抗37 ℃孵育，共聚焦成像系統(tǒng)觀察蛋白表達(dá)和定位。

1.4.4 心肌細(xì)胞面積測(cè)量：將細(xì)胞接種于6孔板（3×105/孔）上，不同組別分別加入生理鹽水，Ang Ⅱ和DEX（5 μmol/L）孵育24 h，應(yīng)用醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量單個(gè)細(xì)胞表面積，確認(rèn)心肌細(xì)胞肥大的發(fā)生情況。

1.4.5 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性：當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，用胰酶消化，收集貼壁細(xì)胞后計(jì)數(shù)，制成5×104/mL密度的細(xì)胞懸液，在96孔板中配置100 μL的細(xì)胞懸液。在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h（37 ℃，5%CO2）。更換1%FBS+DMEM低血清培養(yǎng)液，隨機(jī)分為6組，并設(shè)置空白對(duì)照孔。分別在常氧和低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL CCK溶液。在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h，2 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。

1.4.6 Western blotting檢測(cè)：心肌細(xì)胞（細(xì)胞數(shù)量約2×106～3×106）吸管吹打后冰里放置30 min，離心（20 000 r/min、4 ℃、10 min），取上清液，按Bradford法測(cè)定蛋白濃度。稀釋后100 ℃變性5 min，8%～10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，半干式電轉(zhuǎn)膜60～120 min，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。分別加入ANP、BNP、β-MHC抗體，4 ℃過(guò)夜，加入二抗室溫孵育1 h后DAB 顯影，凝膠成像儀分析系統(tǒng)掃描，計(jì)算各條帶與內(nèi)參照（β-actin）的相對(duì)灰度值作為各蛋白表達(dá)的相對(duì)含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以±s表示。2組間差異比較采用t檢驗(yàn)。采用單因素方差分析（ANOVA）比較多組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠心肌細(xì)胞的形態(tài)變化

與C組比較，A組和AD組細(xì)胞面積均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。提示Ang Ⅱ和DEX能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。見(jiàn)圖1。

圖1 Ang Ⅱ、DEX誘發(fā)心肌細(xì)胞發(fā)生肥大Fig.1 Cardiomyocyte hypertrophy induced by AngⅡand DEX

2.2 3組大鼠心肌細(xì)胞ANP、BNP和β-MHC蛋白的表達(dá)

與C組比較，A組和AD組的ANP、BNP和β-MHC蛋白表達(dá)均增加，且AD組增加更為顯著（圖2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 DEX增加心肌肥大相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.2 DEX increased the expression of cardiac hypertrophy associated protein

2.3 CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果

為了檢測(cè)不同藥物濃度對(duì)細(xì)胞活性的影響，加入高濃度DEX（10 μmol/L和20 μmol/L）組，結(jié)果顯示，與C組比較，A組細(xì)胞活性明顯降低；而與A組比較，AD組以及Ang Ⅱ+DEX（10 μmol/L）、Ang Ⅱ+DEX（20 μmol/L）細(xì)胞活性明顯升高。為了研究藥物作用時(shí)長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞活性的影響，同樣的組別，繼續(xù)孵育細(xì)胞至36 h再次檢測(cè)CCK-8，結(jié)果顯示細(xì)胞趨勢(shì)與24 h一致（圖3）。證實(shí)Ang Ⅱ誘導(dǎo)心肌肥大，細(xì)胞活性降低；而DEX誘導(dǎo)心肌肥大，細(xì)胞活性明顯升高。DEX明顯改善了Ang Ⅱ引起的細(xì)胞活性降低，與A組比較，AD組與C組細(xì)胞活性差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖3 DEX增加病理性心肌肥大細(xì)胞的活性Fig.3 DEX increased the activity of pathological myocardial mast cells

2.4 C’、A’和AD’各組肥大相關(guān)蛋白的表達(dá)

將大鼠心肌細(xì)胞分成3組驗(yàn)證肥大相關(guān)蛋白ANP、BNP和β-MHC的表達(dá)。與C’組比較，A’組ANP、BNP、β-MHC蛋白表達(dá)明顯增加。與A’組比較，AD’組肥大相關(guān)蛋白ANP和BNP的表達(dá)明顯減少，β-MHC并無(wú)明顯改變（圖4）。停藥24 h后，DEX能明顯減少Ang Ⅱ引起的病理性心肌肥大相關(guān)蛋白的表達(dá)，而停藥后A’組肥大相關(guān)蛋白未見(jiàn)減少。證實(shí)DEX通過(guò)誘導(dǎo)代償性、類似于生理性心肌肥大來(lái)產(chǎn)生心肌保護(hù)作用。

圖4 DEX對(duì)病理性心肌肥大發(fā)生的影響Fig.4 Effect of DEX on pathological cardiac hypertrophy

3 討論

DEX具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和抗焦慮的臨床作用［9-11］。DEX與其他全身麻醉藥物合用可以減少麻醉藥物的用量，復(fù)合局部麻醉藥物的使用可以延長(zhǎng)麻醉作用時(shí)間。與苯二氮卓類鎮(zhèn)靜藥物相比，DEX能鎮(zhèn)靜且不抑制呼吸，患者進(jìn)入類似于生理睡眠的狀態(tài)，大大提升了麻醉的安全性和患者的舒適度。DEX應(yīng)用范圍廣且不良反應(yīng)輕，近年研究重點(diǎn)已轉(zhuǎn)移至臟器保護(hù)方面，包括對(duì)心肌的保護(hù)作用。DEX可以減少心肌缺血/再灌注損傷中的促炎細(xì)胞因子和氧化產(chǎn)物，從而減輕心肌損傷［12］。DEX通過(guò)抑制線粒體活性氧生成減輕阿霉素心臟毒性［13］。本研究結(jié)果顯示，與C組比較，A組細(xì)胞面積增大，心肌肥大相關(guān)蛋白ANP、BNP和β-MHC表達(dá)增加，證明離體心肌肥大模型建立成功。AD組細(xì)胞面積進(jìn)一步增大，肥大相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加，提示DEX促進(jìn)了心肌肥大的發(fā)生。既往研究［3-4］發(fā)現(xiàn)DEX有心肌保護(hù)作用，提示DEX可能誘發(fā)生理性心肌肥大的發(fā)生。

生理性心肌肥厚是指體育鍛煉或妊娠等所致的心肌肥厚，隨著體育鍛煉終止或妊娠結(jié)束生理性心肌肥厚將恢復(fù)［14］。生理性肥厚引起左心室容積增加、室壁厚度增大，但室壁厚度與心臟質(zhì)量成比例增加，不發(fā)生心肌纖維化，是一種良性的適應(yīng)性改變，有助于提高心功能，對(duì)病理性的心肌損傷具有保護(hù)效應(yīng)。為探究DEX引起的心肌肥大的性質(zhì)，本研究模擬了體外實(shí)驗(yàn)C’組、A’組和AD’組。其中AD’組類似于身體鍛煉或妊娠結(jié)束，隨著加藥終止，肥大相關(guān)蛋白ANP、BNP明顯減少，接近C’組，而A’組沒(méi)有隨加藥的終止而減少。這說(shuō)明DEX誘發(fā)的心肌細(xì)胞肥大是可逆的且為代償性，對(duì)肥大心肌細(xì)胞是一種保護(hù)作用。

本研究存在一定局限性，缺少體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，未來(lái)將開(kāi)展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究DEX誘發(fā)生理性心肌肥厚保護(hù)心肌細(xì)胞的分子機(jī)制。探討心肌肥厚發(fā)生機(jī)制對(duì)心血管領(lǐng)域研究具有重要的理論價(jià)值和臨床意義，有望為臨床診療提供新思路。