張癸乾，王寧，榮耀，唐明政，蔡輝

（1.甘肅中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院臨床普外中心，蘭州 730000；3.國家衛(wèi)生健康委胃腸腫瘤診治重點實驗室，甘肅省人民醫(yī)院，蘭州 730000；4.甘肅省外科腫瘤分子診斷與精準治療重點實驗室，甘肅省人民醫(yī)院，蘭州 730000）

癌癥在大多數(shù)國家是70歲以下人群主要或次要的死亡原因［1］，由于存在藥物耐受性和癌癥復(fù)發(fā)等問題，患者的生存率低［2］。泛癌分析可以用來區(qū)分人類惡性腫瘤的特征，為臨床治療提供新思路。

CD276（B7-H3）是B7超家族的分子之一，該基因所編碼的蛋白屬于免疫球蛋白家族［3］，參與調(diào)節(jié)T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)［4］。CD276被認為是T細胞的刺激蛋白，但許多研究［5］表明，CD276作為T細胞的抑制因子，能夠促進腫瘤的侵襲和增殖，CD276與細胞之間以及細胞與細胞外基質(zhì)之間的黏附有關(guān)。盡管該基因的轉(zhuǎn)錄本在正常組織和實體瘤中都很常見，但該蛋白只在腫瘤組織中優(yōu)先表達［6］。因此，本研究綜合分析了泛癌中CD276的表達水平，旨在探究CD276與腫瘤預(yù)后及免疫浸潤的相關(guān)性，從而為癌癥治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 樣本數(shù)據(jù)收集

通過癌癥基因組圖譜（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載臨床數(shù)據(jù)。通過UCSC Xena（https：//xena.ucsc.edu/）從TCGA數(shù)據(jù)庫下載33種不同癌癥類型的信息。通過GTEx（https：//gtexportal.org/）下載來自449例健康捐贈者的7 000余份樣本，涵蓋44種組織。

1.2 CD276在泛癌中的表達及預(yù)后分析

從TCGA數(shù)據(jù)集（https：//portal.gdc.com）下載了泛癌的RNA測序表達（3級）譜和相應(yīng)的臨床信息?？偵嫫冢╫verall survival，OS）、疾病特異性生存期（disease specific survival，DSS）、無病生存期（disease-free survival，DFS）和無進展生存期（progression-free survival，PFS）用來研究CD276表達與患者生存之間的關(guān)系。以CD276表達水平的中位數(shù)為閾值，將患者分為高表達組和低表達組。采用R語言survival和survminer包來顯示患者的生存情況。

1.3 CD276與腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）、腫瘤突變負荷（tumor mutation burden，TMB）和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）相關(guān)性分析

利用R語言ggplot2、ggpubr和 ggExtra包來分析CD276表達和TME之間的相關(guān)性（以相關(guān)系數(shù)|r|＞0.2且P＜0.001為標準）。TMB、MSI和CD276表達之間的相關(guān)性用Spearman方法計算。R語言fmsb包用于圖像可視化。

1.4 CD276與免疫細胞浸潤相關(guān)性分析

采用CIBERSORT評估泛癌免疫細胞浸潤情況。R軟件包 “ggplot2”“ggpubr”和 “ggExtra”被用來分析CD276表達和細胞免疫浸潤之間的相關(guān)性（以相關(guān)系數(shù)|r|＞0.2且P＜0.001為標準）。為了獲得可靠的免疫評分，使用R語言immuneeconv包［7］。

1.5 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）

GSEA（https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/downloads.jsp）提供了基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）的基因集。使用R語言limma、org.Hs.eg.db、clusterProfiler和 enrichplot包對GO和KEGG進行功能注釋和路徑富集分析。

1.6 細胞培養(yǎng)和實時PCR

胃癌細胞（HGC-27、MGC-803和MKN-45）和正常細胞（GES-1），結(jié)腸癌細胞（HCT116、SW620和SW480）及正常細胞（NCM460）來自中國科學院細胞資源中心。用含有10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。

采用TRIzol法從細胞中分別提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將純化的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板，然后對目標基因進行實時PCR，最后用2-ΔΔCt法計算CD276的相對表達量，并以GAPDH為內(nèi)參照。CD276引物序列，正向，5’-TCACTGCAAAGATTTAC CATCAGC-3’，反向，5’-TGTCTTGGAGCCTTCTCCC-3’。GAPDH引物序列，正向，5’-GGAAGCTTGTCATCAA TGGAAATC-3’，反向，5’-TGATGACCCTTGGCTCCC-3’。

1.7 統(tǒng)計學分析

所有基因數(shù)據(jù)都通過對數(shù)轉(zhuǎn)換進行歸一化。CD276的差異表達采用Wilcox測試檢測。數(shù)據(jù)的可視化由R語言（4.1.1版）處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CD276在泛癌中高表達

利用TCGA數(shù)據(jù)庫和GTEx數(shù)據(jù)庫研究了CD276在不同腫瘤組織和正常組織中的表達水平。結(jié)果顯示，CD276在腎上腺皮質(zhì)癌（adrenocortical carcinoma，ACC）、膀胱癌（bladder urothelial carcinoma，BLCA）和乳腺癌（breast invasive carcinoma，BRCA）等腫瘤中均高表達，見圖1。

圖1 CD276在泛癌中的表達Fig.1 CD276 expression in pan-cancer

2.2 CD276對泛癌預(yù)后的影響

生存分析結(jié)果顯示，在ACC、BLCA和結(jié)腸癌（colon adenocarcinoma，COAD）等腫瘤患者中，CD276的高表達與不良OS和DSS相關(guān)（圖2A、2B）；在ACC、BLCA和低度膠質(zhì)瘤（lower grade glioma，LGG）等腫瘤中，CD276的高表達與低PFS相關(guān)，但在大B細胞淋巴瘤（large B-cell lymphoma，DLBC）中則相反（圖2C）；在ACC、宮頸癌（cervical cancer，CESC）和膽管癌（cholangiocarcinoma，CHOL）等腫瘤中CD276的高表達與不良DFS有關(guān)（圖2D）。

2.3 CD276在TME、TMB和MSI中的作用

TME通過刺激腫瘤細胞間的異質(zhì)性并使其具有多藥耐藥性來促進腫瘤細胞的進展和轉(zhuǎn)移。結(jié)果顯示，在BLCA、COAD和LGG等腫瘤中，CD276的表達與基質(zhì)細胞（圖3A）和免疫細胞（圖3B）得分呈正相關(guān)，說明基質(zhì)細胞或免疫細胞的含量隨著CD276表達水平的提高而增加。TMB是指100萬個堿基中的堿基突變率。MSI是指與正常組織相比，由于基因的插入或缺失而在腫瘤的微衛(wèi)星位點出現(xiàn)新的微衛(wèi)星等位基因的現(xiàn)象。本研究結(jié)果顯示，在ACC、BRCA和CESC等腫瘤中，CD276與TMB之間有明顯的關(guān)聯(lián)（圖3C）；在COAD、急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，LAML）、直腸癌（rectal cancer，READ）和睪丸癌（testicular cancer，TGCT）中，CD276與MSI之間有明顯的關(guān)聯(lián)（圖3D）。

2.4 CD276與免疫細胞浸潤

采用CIBERSORT算法研究CD276表達與22種免疫相關(guān)細胞的浸潤水平之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，CD276與不同癌癥的免疫細胞浸潤密切相關(guān)（圖4）。CD276的表達與免疫細胞的浸潤密切相關(guān)，從而解釋了患者生存率的差異。

2.5 GSEA結(jié)果

為了驗證CD276在泛癌中的生物學功能，采用R語言對其進行了GSEA。結(jié)果表明CD276主要富集在抗原處理和遞呈、細胞膜感應(yīng)通路、免疫移植物抗宿主病、類似I型受體的信號傳導(dǎo)途徑等（圖5）。

2.6 驗證CD276在泛癌中的表達

分別使用胃癌和結(jié)腸癌細胞對CD276在泛癌中的表達做了實時PCR檢測mRNA驗證。結(jié)果表明CD276在胃癌和結(jié)腸癌中均呈高表達（圖6）。

圖6 體外驗證CD276的表達Fig.6 In vitro validation of CD276 expression

3 討論

本研究探討了CD276在泛癌中的表達、預(yù)后以及CD276與TME、TMB、MSI和免疫細胞浸潤之間的關(guān)系。利用GSEA富集了CD276在泛癌中的相關(guān)通路，并對CD276在泛癌中的表達進行了體外實時PCR檢測mRNA驗證。

TME對免疫系統(tǒng)識別和介導(dǎo)自發(fā)性惡性腫瘤有很大影響。本研究結(jié)果顯示，間質(zhì)細胞或免疫細胞的數(shù)量隨著CD276表達水平的提高而增加。CD276是一種與免疫有關(guān)的分子，能增強癌癥的進展。研究［8］表明，CD276能阻斷免疫細胞的抗腫瘤反應(yīng)，促進細胞分化。Treg誘導(dǎo)白細胞介素-10的表達和CD276在樹突狀細胞（dendritic cell，DC）中的表達，這使得DC具有免疫抑制性。接觸Treg后，DC使CD276上調(diào)，MHC肽復(fù)合物的數(shù)量減少，導(dǎo)致T細胞刺激受損。因此，CD276在介導(dǎo)T細胞對DC的抑制起著關(guān)鍵作用。CD276對αβ T細胞和Vδ2 T細胞都有抑制作用，但其調(diào)節(jié)機制仍不清楚。CD276上調(diào)TAMs促進腫瘤M2極化和CAFs的侵襲和遷移。此外，CD276還與PI3K/AKT、NF-KB、Ras/Raf/MEK/MAPK、JAK2/STAT3和葡萄糖代謝信號通路有關(guān)［8］。

CD276是一個免疫家族相關(guān)的基因，其在免疫方面具有重要的作用。利用CIBERSORT算法研究了CD276表達與22種免疫相關(guān)細胞的浸潤水平之間的關(guān)系［9］。結(jié)果顯示，CD276參與了22種免疫相關(guān)細胞在各種癌癥中的表達，其進一步說明了CD276在免疫方面對癌癥的進展有重要影響。梁嘉瑜等［10］發(fā)現(xiàn)免疫檢查點因子CD276是腎上腺皮質(zhì)癌的個體預(yù)后和潛在治療目標。CD276嵌合抗原受體T細胞可以成為治療某些致命性或難治性小兒惡性腫瘤患者的治療選擇［11］。CD276廣泛存在于各個系統(tǒng)的腫瘤中，在所有階段的尿路內(nèi)皮癌細胞中都明顯升高。CD276在正常尿路內(nèi)皮細胞中的表達減少可能意味著這些細胞將受到CD276介導(dǎo)的免疫療法的保護［12］。

雖然本研究對于CD276的泛癌研究結(jié)合了多個數(shù)據(jù)庫中的信息，但仍具有局限性。本研究仍停留在理論層面上，且得到的分析結(jié)果可能存在系統(tǒng)誤差，仍需通過研究進一步驗證。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，CD276的表達水平與多種腫瘤的預(yù)后有關(guān)，且與腫瘤中不同程度的免疫浸潤有關(guān)，進一步揭示了CD276作為腫瘤免疫治療靶點生物標志物的潛力。