繆迪季， 徐龍水， 徐衛(wèi)紅

西南大學 資源環(huán)境學院，重慶 400715

硼是高等植物必需的微量營養(yǎng)元素之一,參與植物的光合作用、細胞壁的合成、糖的轉(zhuǎn)化和運輸?shù)榷喾N生物代謝過程[1]．我國缺硼的耕地土壤多達3 000萬hm2以上,其中土壤的硼含量由北向南、由西向東逐漸降低．在降雨量充沛的南方,土壤缺硼現(xiàn)象更為嚴重,這也是限制地區(qū)作物高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的因素之一[2-3]．然而,在硼缺乏和硼過量之間存在一個相對狹窄的范圍[4]．適宜的硼用量才能促進作物生長發(fā)育,獲得更高產(chǎn)量和品質(zhì)．

甜度作為水果風味的重要組成部分,由糖含量、糖酸比和糖的類型決定．果實中可溶性糖主要包括蔗糖、果糖和葡萄糖,3種糖的組成與比例對果實甜度有很大影響[5]．番茄果實的甜度主要由葡萄糖和果糖的含量決定,果糖的甜度是葡萄糖的2倍,提高番茄中果糖的含量可以增加果實甜度,從而改善番茄果實風味[6]．糖代謝涉及各種酶的復雜網(wǎng)絡調(diào)節(jié),蔗糖代謝是糖積累的關(guān)鍵因素,受蔗糖磷酸合酶(SPS)、蔗糖合酶(SS)和蔗糖酶(Ivr)的調(diào)控．有反應的糖類及其衍生物主要參與糖酵解或糖轉(zhuǎn)運,包括1-磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖和蔗糖等[7]．有研究發(fā)現(xiàn)缺硼處理后參與碳水化合物的琥珀酸脫氫酶鐵硫亞基、酮還原酶家族中的氧化還原酶上調(diào)表達; 在高硼處理后參與碳水化合物代謝的肌醇單磷酸酶家族蛋白上調(diào)表達,主要參與了抗壞血酸和磷酸肌醇代謝[8]．另外有學者在硼缺乏處理后的根中鑒定出389個差異表達的蛋白質(zhì),根據(jù)生物學功能特性,參與碳水化合物和能量代謝的蛋白質(zhì)有53個,占比為13.6%．其中大多數(shù)與碳水化合物代謝相關(guān)的差異表達蛋白在硼缺乏中上調(diào),這些上調(diào)的蛋白質(zhì)主要參與碳水化合物(淀粉和蔗糖)生物合成、糖降解、磷酸戊糖途徑、三羧酸循環(huán)、乳酸發(fā)酵、乙醇發(fā)酵等過程．這與硼缺乏會增加高等植物和藻類中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 (G6PDH),6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6PGDH)和β-葡萄糖苷酶的活性結(jié)果一致[9-10]．其中所有下調(diào)的蛋白質(zhì)都位于糖酵解的下游,這意味著糖酵解在硼缺乏的根中受到抑制[11]．

番茄紅素是成熟水果中的主要色素,在抗氧化、清除自由基方面具有重要的作用[12]．在高等植物的果實中,番茄紅素的生物合成和代謝是一個復雜的過程,涉及一系列生理生化反應和各種基因的參與,其中類胡蘿卜素生物合成途徑基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是番茄紅素積累的關(guān)鍵機制[13]．從轉(zhuǎn)錄組水平上研究硼對作物營養(yǎng)和風味品質(zhì)的影響,有助于從宏觀上整體把握硼對作物風味品質(zhì)的影響及主要分子機制．有研究發(fā)現(xiàn),硼缺乏導致12種與碳水化合物代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)改變,這些蛋白質(zhì)主要參與糖酵解、三羧酸循環(huán)和戊糖磷酸途徑,在與糖酵解相關(guān)的9種改變的蛋白質(zhì)中,有6種蛋白質(zhì)下調(diào),3種蛋白質(zhì)上調(diào)[11]．缺硼處理下嫁接在不同砧木上的紐荷爾臍橙參與葉綠素分解的基因、類胡蘿卜素合成的基因、葡萄糖合成的基因等表達差異非常顯著[14]．硼毒脅迫下的大麥大部分差異表達產(chǎn)物與細胞壁、蛋白激酶[15]等有關(guān)．以上研究結(jié)果都為從轉(zhuǎn)錄水平對植物響應硼處理的機制研究拓展了思路．本試驗基于課題組前期研究,以重慶地區(qū)番茄應用較為廣泛的2個品種‘凱豐’和‘紅麗’為試驗材料,采用大田試驗研究了硼誘導下2個番茄品種的轉(zhuǎn)錄代謝信息差異,以及硼對番茄果實糖代謝關(guān)鍵酶基因、番茄紅素合成代謝關(guān)鍵酶基因表達水平的影響．同時,采用Pearson分析方法,研究番茄果實糖代謝關(guān)鍵酶基因、番茄紅素合成代謝關(guān)鍵酶基因表達與糖和番茄紅素含量之間的相關(guān)性,以期為番茄品質(zhì)改良提供資料積累．

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

該試驗在日光溫室進行．供試土壤的基礎(chǔ)理化性質(zhì)包括: pH(水/土=1/1)為6.86,土壤有機質(zhì)為10.78 g/kg,全氮為1.20 g/kg,堿解氮為161.00 mg/kg,有效磷為410.20 mg/kg,速效鉀為397.30 mg/kg,有效硼為0.14 mg/kg; 番茄品種為‘凱豐’和‘紅麗’,‘凱豐’和‘紅麗’的外形橫徑、縱徑大小相似,在不同時期其果實糖含量相差很小,番茄紅素含量亦相差不大．

1.2 試驗方法

本試驗硼元素質(zhì)量濃度參照郭世榮[16]研究,設(shè)置了5個質(zhì)量濃度的硼砂(0、1、2、4和8 mg/L),硼元素質(zhì)量濃度分別為0 mg/L、0.11 mg/L、0.23 mg/L、0.45 mg/L和0.90 mg/L,記作CK、B1、B2、B3和B4．采用葉面噴施,硼砂噴施量為當?shù)剞r(nóng)戶常規(guī)葉面肥用量,約為750 mg/hm2[17]．每個處理重復3次,隨機排列,每個重復1株．

番茄栽培種植日常管理由當?shù)厝藛T負責,管理一致．在第一穗果膨大期開始噴施第一次,以后間隔2周噴施1次,總共噴施3次,所有處理中的噴灑都由同一個人進行．在3次噴施過后,取第三穗成熟期果實,先用自來水沖洗干凈,然后用去離子水清洗3次．一部分鮮樣用于糖和番茄紅素測定; 一部分放于超低溫冰箱-80 ℃保存,用于測定果實硼形態(tài); 剩余樣品在實驗室干燥器105 ℃下殺青15 min,分離根、莖、葉和果實,60 ℃下烘干稱質(zhì)量,然后在配有塑料外殼和不銹鋼刀片的家用混合器中均質(zhì)粉碎,用于測得硼含量．經(jīng)實驗分析,B2處理對番茄果實生長、營養(yǎng)及風味綜合影響最大．故選用CK、B2處理的‘凱豐’和‘紅麗’2個品種番茄成熟期果實用于轉(zhuǎn)錄組分析．

1.3 測定指標與方法

1.3.1 土壤基本理化性質(zhì)、番茄糖組分、番茄紅素及硼含量分析

pH采用土水比1∶1的方法測定; 土壤有機質(zhì)、全氮、堿解氮、有效磷、速效鉀等基本理化指標用常規(guī)方法測定[18]．采用高效液相色譜法測定糖組分及番茄紅素含量[19-20]．

1.3.2 轉(zhuǎn)錄組測序

1.3.2.1 總RNA提取、cDNA文庫構(gòu)建及Illumina測序

成熟期番茄果實用于總RNA提取、mRNA純化、cDNA文庫構(gòu)建及高通量測序,cDNA文庫構(gòu)建及高通量測序由深圳華大基因股份有限公司支持完成．基本過程為: 用mRNA富集法對總RNA進行處理,用打斷buffer把獲得的RNA片段化,結(jié)合cDNA二鏈形成雙鏈DNA,雙鏈DNA處理過后進行PCR擴增、熱變形成單鏈得到單鏈環(huán)狀DNA文庫,將檢測合格的文庫進行Illumina測序．

1.3.2.2 RNA-seq分析

原始測序數(shù)據(jù)首先通過SOAPnuke 1.4.0軟件去除接頭及低質(zhì)量的序列,之后利用Hisat 2.1.0將獲得clean reads比對到番茄參考基因組,使用Bowtie 2將clean reads比對到基因組序列上,然后使用RSEM計算各個樣品的基因表達水平．通過DESeq 2軟件進行樣品組間差異表達分析,將滿足|log2Fold Change|>1且FDR<0.05的基因定義為差異表達基因(DEG),并對差異表達基因進行GO(Gene Ontology)功能注釋及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析[21]．

1.3.2.3 數(shù)據(jù)的質(zhì)控與比對

分別取‘凱豐’(代號KF)、‘紅麗’(代號HL)2個品種番茄在CK、B2處理后的成熟期果實進行轉(zhuǎn)錄組測序．KF-CK、KF-B2、HL-CK和HL-B2分別獲得47.33、47.33、47.33和46.74百萬條Raw Reads．原始測序數(shù)據(jù)去除接頭及低質(zhì)量的數(shù)據(jù)后,每個文庫分別獲得43.84～45.47百萬條Clean Reads,進一步的高質(zhì)量堿基統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)Clean Reads的Q20和Q30分別在96.78%～97.80%和91.60%～94.15%之間．將Clean Reads比對到番茄參考基因組上,比對率在86.63%～94.91%之間(表1)．以上結(jié)果說明,測序數(shù)據(jù)對比較好,質(zhì)量較好,可以進行下一步分析．

表1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的過濾及比對統(tǒng)計分析

1.3.3 番茄果實糖代謝及番茄紅素合成代謝關(guān)鍵酶基因表達研究

1.3.3.1 總RNA提取與質(zhì)量檢測

本試驗番茄果實材料的總RNA采用北京全式金生物技術(shù)股份有限公司TransZol Up Plus RNA Kit抽提試劑盒提取,提取出的一部分RNA用于RNA的質(zhì)量檢測,剩余的RNA保存在-80 ℃冰箱中以待進一步純化和反轉(zhuǎn)錄．

1.3.3.2 RNA的純化與反轉(zhuǎn)錄

使用北京全式金生物技術(shù)股份有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransCript One-Step Gdna Removal and cDNA Synthesis SuperMix)進行RNA反轉(zhuǎn)錄．首先去除殘存基因組DNA,再按照試劑盒進行RNA反轉(zhuǎn)錄反應．反轉(zhuǎn)錄所合成的cDNA置于-20 ℃條件下保存．

1.3.3.3 引物及目標基因的qRT-PCR分析

番茄糖代謝關(guān)鍵酶基因和番茄紅素合成關(guān)鍵酶基因的qRT-PCR引物如表2．用ddH2O將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA稀釋3倍,熒光定量PCR采用Power Up TM SYBRTM Green Master Mix(Applied Bio systems,Vilnius,Lithuania)試劑盒以及熒光定量PCR儀(Quant Studio TM 1 System,USA)進行測量．具體PCR反應程序為: 95 ℃預變性10 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,40個循環(huán); 60 ℃上升至95 ℃檢測產(chǎn)物溶解曲線．所有試驗重復3次．用2-ΔΔCT的方法計算目標基因的相對表達量,CT值表示熒光信號達到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的反應循環(huán)數(shù)．其中PCR反應體系如表3所示．

表2 引物序列

表3 qRT-PCR反應體系

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示．利用SPSS 25.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA),采用Fisher least significant difference(LSD)檢測法進行不同處理均值的差異顯著性比較,顯著差異水平為p≤0.05．

2 結(jié)果分析

2.1 供硼水平對番茄果實糖分組分及含量的影響

糖是重要的營養(yǎng)成分,糖分的不同種類、含量、分布的時序和空間定位的變化對果蔬風味品質(zhì)的形成具有非常重要的作用[6]．由圖1a可知,在綠熟期,隨著供硼水平的增加,‘凱豐’和‘紅麗’2個品種番茄的蔗糖含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢．在B2處理條件下,‘凱豐’蔗糖含量達到最大值,為25.71 mg/L,是對照的1.56倍; ‘紅麗’在B3處理下達到最大值,為25.66 mg/L,是對照的1.36倍．在成熟期,低濃度硼處理B1對‘凱豐’蔗糖含量有增加作用,其他濃度的處理降低了蔗糖含量．‘紅麗’在B2處理下蔗糖含量低于對照,在其他處理下蔗糖含量都高于對照,在B3處理下達到最大值．由圖1b可知,在綠熟期對‘凱豐’和‘紅麗’的果糖含量的影響不一致．‘凱豐’的果糖含量先增加后減少,在B3時達到最大值,為29.46 mg/L,是對照的1.20倍; ‘紅麗’的果糖含量先增加再減少然后再增加,在高濃度處理時,其果糖含量顯著高于對照．在成熟期隨著供硼水平的增加,‘凱豐’和‘紅麗’的果糖含量分別呈現(xiàn)先減少再增加后減少和先增加后減少再增加的趨勢,‘凱豐’果糖含量在B3時達到最大值,為43.83 mg/g,是對照的1.12倍,‘紅麗’果糖含量在B1時達到最大值,為39.03 mg/g．由圖1c和圖1d可知,隨著供硼水平的增加,番茄綠熟期果實的可溶性總糖含量和淀粉含量都呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,與對照相比較,‘凱豐’的可溶性總糖含量在B2處理下具有顯著性差異,是對照的1.09倍．在成熟期,番茄的可溶性總糖含量和淀粉含量整體上都呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,與對照相比,‘凱豐’和‘紅麗’的淀粉含量各處理之間沒有顯著性差異．以上結(jié)果表明,適宜的硼處理可以增加綠熟期、成熟期的番茄果實蔗糖、果糖、可溶性總糖和淀粉含量,且兩個時期的變化趨勢相似．從整體上來看,B2處理對綠熟期、成熟期的‘凱豐’整體效果最好,B3處理對綠熟期、成熟期的‘紅麗’整體效果最好．

KF-L: 凱豐-綠熟期; KF-C: 凱豐-成熟期; HL-L: 紅麗-綠熟期; HL-C: 紅麗-成熟期．不同小寫字母表示不同供硼處理間的差異顯著性(p<0.05)．下同．圖1 供硼水平對番茄果實蔗糖、果糖、可溶性總糖和淀粉含量的影響

2.2 供硼水平對番茄果實番茄紅素含量的影響

番茄紅素是成熟水果中的主要色素,在抗氧化、清除自由基方面具有重要的作用[12]．有研究認為,番茄紅素作為類胡蘿卜衍生的香氣化合物,可能是決定一些香氣的關(guān)鍵代謝物質(zhì)[24]．為此進一步通過HPLC法研究硼處理對2個品種番茄的番茄紅素含量的影響．由圖2可知,隨著供硼水平的增加,‘凱豐’在綠熟期和‘紅麗’在成熟期的番茄紅素含量都呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢．在綠熟期,2個品種的番茄紅素含量在各處理間都沒有達到顯著性差異,在成熟期,‘紅麗’的番茄紅素各處理間有顯著性差異．在綠熟期,與對照相比,‘凱豐’的番茄紅素含量都在增加,在B2處理下達到最大值,為29.96 μg/g,整體上增加了0.1%～1.3%; ‘紅麗’在B2、B4處理下分別增加了0.6%和1.1%,然而‘紅麗’的番茄紅素含量在B1和B3處理下低于對照,但差異不顯著．在成熟期,‘凱豐’和‘紅麗’的番茄紅素含量都在B2處理下達到最大值,分別為245.80 μg/g和277.13 μg/g．

圖2 供硼水平對番茄果實綠熟期和成熟期番茄紅素含量的影響

2.3 差異表達基因的分析

以|log2Fold Change|>1且FDR<0.05為差異基因篩選標準進行篩選,對差異基因進行統(tǒng)計分析(圖3a),結(jié)果表明,在‘凱豐’CK和‘凱豐’B2之間有20個差異基因(13個上調(diào)表達,7個下調(diào)表達),‘紅麗’CK和‘紅麗’B2之間有261個差異基因(100個上調(diào)表達,161個下調(diào)表達),‘凱豐’CK和‘紅麗’CK之間有59個差異基因(45個上調(diào)表達,14個下調(diào)表達),‘凱豐’B2和‘紅麗’B2之間有158個差異基因(73個上調(diào)表達,85個下調(diào)表達)．利用Veen圖對差異基因進行分析,結(jié)果表明(圖3b),KF-CK-vs-KF-B2與HL-CK-vs-HL-B2存在共有差異表達,KF-CK-vs-HL-CK和KF-B2-vs-HL-B2存在2個差異基因表達．

圖3 番茄果實響應硼誘導的差異表達基因

2.4 差異表達基因GO分析

為了進一步研究差異基因參與的代謝通路及生物學功能,對所有樣本間差異基因進行GO分析．GO分類分析結(jié)果表明(圖4),在2個番茄品種中,這些差異表達基因均主要富集在代謝過程(Metabolic process)、細胞過程(Cellular process)、膜(Membrane)、膜組分(Membrane part)、催化活性(Catalytic activity)、結(jié)合(Binding)、生物調(diào)控(biological regulation)和生物過程調(diào)控(regulation of biological process)．如圖4a,在‘凱豐’品種中,差異基因富集在代謝過程、細胞過程、生物調(diào)控、生物過程調(diào)控、膜、膜組分、催化活性和結(jié)合的差異表達基因分別有4、4、2、1、6、6、9和7個; 如圖4b,在‘紅麗’品種中,差異基因富集在代謝過程、細胞過程、生物調(diào)控、生物過程調(diào)控、膜、膜組分、催化活性和結(jié)合的差異表達基因分別有45、38、20、16、42、38、65和75個．

圖4 差異表達基因的GO功能富集分析

2.5 差異表達基因KEGG通路分析

為了分析DEG在果實發(fā)育過程中的功能,基于 KEGG 數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行 KEGG 富集分析(圖5)．如圖5a,KF-CK-vs-KF-B2的差異基因被富集到12個通路中,除了主要富集在氨基酸的生物合成(Biosynthesis of amino acids),黃酮類生物合成(Flavonoid biosynthesis),苯丙烷生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis),甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(Glycine,serine and threonine metabolism),其他聚糖降解(Other glycan degradation)等代謝通路外,與番茄紅素合成代謝相關(guān)的通路也呈現(xiàn)出顯著富集,如泛醌和其他萜類醌的生物合成(Ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis)．如圖5b,HL-CK-vs-HL-KF的差異基因被富集在20個通路中,除了主要富集在植物-病原體相互作用(Plant-pathogen interaction),苯丙烷生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis),氨基糖和核苷酸糖代謝(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism),黃酮類生物合成(Flavonoid biosynthesis),丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(Alanine,aspartate and glutamate metabolism)等代謝通路外,與番茄紅素合成代謝相關(guān)的通路也出現(xiàn)顯著富集,如二萜生物合成(Diterpenoid biosynthesis)．與糖合成代謝相關(guān)的通路也呈現(xiàn)出顯著富集,如戊糖磷酸途徑(Pentose phosphate pathway)、檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))(Citrate cycle)和半乳糖代謝(Galactose metabolism)等．

2.6 供硼水平對番茄糖代謝關(guān)鍵酶基因表達水平的影響

通過轉(zhuǎn)錄組分析,結(jié)合番茄果實中糖組分含量差異,進一步檢測了與糖分合成代謝相關(guān)酶基因AA、BA、NI、AI、SPS和SS的表達水平．如圖6所示,在綠熟期,與對照相比,‘凱豐’AA基因表達量在B3處理時下調(diào); ‘紅麗’的AA基因表達量整體上調(diào),在B3、B4處理下提高了1.52、1.19倍．與對照相比,綠熟期2個品種番茄的BA基因表達量都整體上調(diào)表達,是對照的1～3.43倍(‘凱豐’)和1～3.13倍(‘紅麗’)．在成熟期,與對照相比,‘凱豐’AA基因整體上調(diào)表達,表達量先增加后減少,在B1、B2處理下分別是對照的2.06倍和3.33倍; ‘紅麗’的表達量先后減少增加,在B3下調(diào)表達．成熟期2個品種番茄的BA基因都呈下調(diào)表達趨勢．

圖5 差異表達基因KEGG pathway富集分析

圖6 不同供硼水平對番茄果實AA、BA基因表達量的影響

由圖7可知,在綠熟期,2個品種的AI基因表達水平均隨著供硼水平的增加而先上調(diào)再下調(diào),分別在B3和B2處理下表達量最大,分別較對照提高了0.61、0.84倍; 與對照相比,2個品種番茄的NI基因表達量均整體上調(diào),表達量是對照的0.76～3.01倍(‘凱豐’)和0.5～1.79倍(‘紅麗’)．在成熟期,2個品種番茄的AI基因、NI基因表達量整體下調(diào),品種間差異顯著．

由圖8可知,在綠熟期,與對照相比,‘凱豐’的SPS基因表達下調(diào),‘紅麗’表達上調(diào); 2個品種番茄的SS基因表達均上調(diào),分別是對照的1～2.86倍(‘凱豐’)和1～6.3倍(‘紅麗’)．在成熟期,‘凱豐’SPS基因表達量整體下調(diào); ‘紅麗’的SPS基因表達水平在成熟期隨著供硼水平的增加呈先降低后增加的趨勢．成熟期2個品種番茄的SS基因表達量均下調(diào),分別在B1達到最小值0.56(‘凱豐’),B2達到最小值0.11(‘紅麗’)．

2.7 供硼水平對番茄紅素合成代謝關(guān)鍵酶基因表達水平的影響

進一步檢測與類胡蘿卜素生物合成代謝途徑相關(guān)的PSY、PDS、Z-ISO、ZDS、CrtISO、LYCB、LYCE基因的表達情況．通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn),硼對2個品種番茄果實綠熟期和成熟期的PSY、PDS、Z-ISO、ZDS、CrtISO、LYCB、LYCE基因的表達量有顯著影響．由圖9可知,在綠熟期,2個品種番茄的PSY表達量隨供硼水平的增加整體呈先增加后減少的趨勢(‘紅麗’的B4除外)．與對照相比,‘紅麗’PSY基因表達量在B2、B4分別上調(diào)了1.23倍和1.56倍．在成熟期,2個番茄品種的PSY基因表達量變化趨勢一致,基本趨于穩(wěn)定．在綠熟期,2個品種番茄的PDS基因表達量隨供硼水平的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢．在綠熟期,與對照相比,‘紅麗’PDS基因表達量上調(diào),在B2處理時表達量上調(diào)了2.40倍,而‘紅麗’PDS基因表達量在B3、B4處理下出現(xiàn)了下調(diào)．在成熟期,2個品種番茄PDS基因表達量均下調(diào),除了‘紅麗’在B1處理外,但各處理變化不顯著．在綠熟期,2個品種番茄的ZDS基因表達量隨供硼水平的增加均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢．在綠熟期,與對照相比,2個品種番茄的ZDS基因表達量分別上調(diào)了1～3.51倍(‘凱豐’),1～2.16倍(‘紅麗’),‘凱豐’在B3達到最大值,‘紅麗’在B2值達到最大值．在成熟期,除了‘凱豐’‘紅麗’的ZDS基因表達量分別在B2、B1處理時上調(diào)外,其余處理下調(diào)．綜上可知,2個品種番茄的PSY、PDS、ZDS基因表達量在綠熟期變化顯著．

圖7 不同供硼水平對番茄果實AI、NI基因表達量的影響

圖8 不同供硼水平對番茄果實綠熟期、成熟期SPS、SS基因表達量的影響

由圖10可知,與對照相比,‘凱豐’在兩個時期CrtISO基因表達量下調(diào),‘紅麗’在綠熟期B2和B4上調(diào),在成熟期B1上調(diào),各處理間差異明顯．2個品種番茄的Z-ISO基因表達量在綠熟期隨供硼水平的增加均先增加后減少．2個品種番茄Z-ISO基因表達量分別在B1、B2處理時上調(diào),在B4處理時下調(diào); 在成熟期,2個品種番茄果實Z-ISO基因表達量上調(diào),其表達量分別在B3、B2處理下達到最大值,是對照的2.10倍(‘凱豐’)、2.11倍(‘紅麗’)．

圖9 不同供硼水平對番茄果實PSY、PDS、ZDS基因表達量的影響

由圖11可知,‘凱豐’的LYCB基因表達水平除了在B1和成熟期B4上調(diào),其余都下調(diào)．‘紅麗’的LYCB基因表達量在綠熟期較對照提高了0.45～1.29倍,在成熟期LYCB基因表達水平只有在B1、B4上調(diào)．2個品種番茄的LYCE基因表達量變化趨勢與LYCB基因相似．

綜上所述,在適宜的硼處理后,綠熟期番茄的PSY、PDS、ZDS、CrtISO基因表達量上調(diào),Z-ISO表達量在成熟期上調(diào),LYCB和LYCE基因表達量整體上在綠熟期、成熟期下調(diào),進而提高了番茄紅素合成速率,降低了番茄紅素轉(zhuǎn)化速率,使番茄紅素含量增加．

2.8 番茄糖代謝關(guān)鍵酶基因表達與果實糖含量的相關(guān)性研究

由表4可知,在硼處理過后,番茄果實糖含量和糖代謝關(guān)鍵酶基因表達水平之間存在不同程度的相關(guān)性．蔗糖與糖代謝關(guān)鍵酶相關(guān)基因表達水平呈負相關(guān)(-0.505≤r≤-0.360,AA除外),尤其與BA(r=-0.505)、NI(r=-0.504)和SPS(r=-0.476)呈顯著負相關(guān)．果糖與AA(r=0.259)呈相關(guān),與其他基因表達水平呈負相關(guān)(-0.508≤r≤-0.332)．可溶性總糖與BA(r=0.626)、NI(r=0.567)的相關(guān)系數(shù)較高,呈極顯著正相關(guān)．可溶性總糖與AI、SPS和SS呈正相關(guān)(0.386≤r≤0.473),與AI(r=0.473)、SPS(r=0.463)呈顯著相關(guān)．淀粉與BA(r=0.711)呈極顯著正相關(guān),與NI(r=0.532)、AI(r=0.538)呈顯著正相關(guān),只與AA(r=-0.218)呈負相關(guān)．

表4 番茄糖代謝關(guān)鍵酶基因表達與果實糖含量間的相關(guān)系數(shù)

2.9 番茄紅素合成代謝相關(guān)基因與番茄紅素含量的相關(guān)性研究

為了探討在硼處理下番茄紅素含量與番茄紅素合成代謝相關(guān)基因的表達量的相關(guān)性,本文進行了Person分析,相關(guān)結(jié)果如表5所示．番茄紅素含量與PSY、CrtISO、LYCB和LYCE相對表達量呈正相關(guān)關(guān)系,其相關(guān)系數(shù)分別為0.154、0.147、0.265和0.123,但相關(guān)性都未達到顯著水平．番茄紅素含量與PDS、ZDS和Z-ISO相對表達量呈負相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)分別為-0.128、-0.347和-0.024,同時其相關(guān)性也都未達到顯著水平．

表5 番茄紅素合成代謝相關(guān)基因表達量與番茄紅素含量間的相關(guān)系數(shù)

3 討論

甜度作為水果風味的重要組成部分,番茄果實的甜度主要由葡萄糖和果糖的含量決定,果糖的甜度是葡萄糖的2倍,提高番茄中果糖的含量可以增加果實甜度,從而改善果實風味[5-6]．不同發(fā)育期番茄果實糖分含量差異較大,為此對番茄果實在綠熟期、成熟期糖分含量進行了相關(guān)研究．結(jié)果表明,適宜的硼處理(2 mg/L)能夠提高綠熟期番茄果實中蔗糖、果糖和可溶性總糖的含量,而在成熟期,‘凱豐’和‘紅麗’番茄果實中糖組分含量受到硼影響有差異,但總體上都是先增加后減少．這與徐龍水[25]研究發(fā)現(xiàn)適宜硼肥能提高番茄中可溶性糖含量結(jié)論一致．Hegazi等[26]對橄欖果實噴施不同濃度硼肥,發(fā)現(xiàn)適宜的硼肥能提高可溶性總糖含量,其研究也與本文試驗結(jié)果相同．

番茄紅素是番茄果實的關(guān)鍵成分,因為它與番茄果實對人類健康的保護作用有關(guān),并且主要負責番茄果實的紅色．番茄果實的番茄紅素含量受栽培品種[27]、成熟期[13]、農(nóng)藝因素[28]和加工的影響．番茄紅素裂解后會影響揮發(fā)性物質(zhì)的合成,為此進一步檢驗了番茄果實中番茄紅素的含量．已有研究發(fā)現(xiàn),葉面噴施硼肥會導致番茄果實中番茄紅素含量、類胡蘿卜素含量都呈先增加后減低的趨勢[29]．本文研究發(fā)現(xiàn),在不同供硼水平處理下‘凱豐’和‘紅麗’的番茄紅素含量在綠熟期和成熟期表現(xiàn)出相似的變化趨勢,均為先增后降,適宜的硼處理B2下能明顯增加番茄紅素含量,這與上述已有研究結(jié)果一致．邵旭日等[30]在番茄葉面噴施不同濃度硒肥后,發(fā)現(xiàn)隨著供硒水平的增加,番茄紅素含量先增加(0～7 g)后減少(7～10 g),番茄紅素也隨著發(fā)育期的進行而積累,這與本研究結(jié)果一致．另外Mallick等[31]通過基施硼肥也發(fā)現(xiàn)不同硼水平對番茄果實番茄紅素含量的影響極顯著(p<0.01),其中適宜硼處理(2.0 kg/ hm2)的番茄果實中番茄紅素含量最高,為3.39 mg/100 g．

轉(zhuǎn)錄組代謝信息分析發(fā)現(xiàn) ‘凱豐’(KF-CK-vs-KF-B2)和‘紅麗’(HL-CK-vs-HL-KF)存在20和261個差異基因,在GO分析中,這些差異基因主要富集在生物過程,說明施硼后對番茄果實成熟期的物質(zhì)代謝影響較大．此外,差異基因還主要富集在催化活性、代謝過程和膜．這與李巍[32]在低硼和正常硼處理的油菜品種差異表達基因研究中發(fā)現(xiàn)其主要富集在細胞膜、細胞核,分子功能主要涉及催化活性、轉(zhuǎn)移酶活性一致．KEGG分析發(fā)現(xiàn),差異基因共同富集在黃酮類生物合成、苯丙烷生物合成、氨基酸的合成代謝中．番茄氨基酸合成代謝主要富集在甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,番茄紅素合成代謝主要富集在泛醌和其他萜類醌的生物合成中,與糖合成代謝相關(guān)的通路也出現(xiàn)富集,如其他聚糖降解．有研究發(fā)現(xiàn),葡萄糖的合成基因(CsSIP、CsCWINV、CsTREH和CsTPS)、類胡蘿卜素合成基因(CsCrtR-b和CsCrtL-e)表達的差異都非常顯著,說明這些基因與臍橙應對缺硼脅迫有關(guān)[14]．另有國外學者對硼毒脅迫下的大麥進行轉(zhuǎn)錄組學分析發(fā)現(xiàn),根、葉組織中有16%～107%的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是差異表達的,大多數(shù)與細胞壁、膜、蛋白激酶的形成及脅迫反應、轉(zhuǎn)運機制有關(guān)[15]．

果實成熟是一個復雜的過程,以碳水化合物的積累為特征,碳水化合物為果實提供能量并影響風味[33-34]．糖是植物生長能量的碳源,在果實中轉(zhuǎn)化為各種代謝物[35]．各種生理、代謝和遺傳過程綜合導致糖分積累[36]．蔗糖磷酸合酶(sucrose-phosphate synthase,SPS)通過糖代謝途徑在控制蔗糖通量方面發(fā)揮著重要作用[37],它有助于番茄中蔗糖的積累和高糖含量的建立,在蔗糖積累過程中SPS表達水平增加進一步支持了這一結(jié)果[38]．當蔗糖水解酶(AI、NI和SS)活躍時,蔗糖代謝增加,相應基因的表達水平受到調(diào)節(jié)[39]．本研究進行適宜的硼處理后,在綠熟期,2個品種番茄的SS、NI、AI、BA和AA基因表達水平上調(diào); 在成熟期,這些基因表達量下調(diào),但變化不顯著．這與已有的研究,不同酶的活性和與蔗糖代謝相關(guān)基因的表達水平與番茄收獲后成熟過程中不同的糖水平(蔗糖、果糖和葡萄糖)一致的結(jié)果相同[40],這說明適宜的硼能夠誘導糖分相應基因的表達水平．同時,在本研究中發(fā)現(xiàn)糖含量與糖代謝關(guān)鍵酶基因表達水平之間的相關(guān)性是多種多樣的,果糖、蔗糖整體上與相關(guān)基因的表達水平呈負相關(guān),可溶性總糖與相關(guān)基因的表達水平呈正相關(guān)．

在高等植物的果實中,番茄紅素的生物合成和代謝是一個復雜的過程,涉及一系列生理生化反應和各種基因的參與[41],其中類胡蘿卜素生物合成途徑基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是番茄紅素積累的關(guān)鍵機制[13]．在本研究的前期,發(fā)現(xiàn)適宜的供硼處理明顯增加了番茄紅素含量的積累．硼對番茄果實中番茄紅素積累的分子機制尚未闡明,為此進一步研究了類胡蘿卜素生物合成途徑基因表達,發(fā)現(xiàn)適宜硼處理后番茄果實在綠熟期的PSY、PDS、ZDS和CrtISO的表達量增加,而在成熟期,各個基因表達量變化不大．Z-ISO基因表達量在綠熟期變化不顯著,在成熟期顯著上調(diào)表達,從而一定程度上促進番茄紅素的積累．此外,當番茄果實完全成熟時,全反式番茄紅素轉(zhuǎn)化為β-胡蘿卜素和α-胡蘿卜素,分別由番茄紅素β-環(huán)化酶(LCY-β)和番茄紅素ε-環(huán)化酶(LCY-ε)催化[42-43]．在本研究中,適宜的硼處理(B2-B3)下調(diào)LYCB和LYCE的表達,降低了番茄紅素的轉(zhuǎn)化效率,從而減少了β-胡蘿卜素和α-胡蘿卜素的含量．有其他的研究也證明了只有適宜的脅迫才能明顯上調(diào)番茄紅素合成基因的表達,同時會下調(diào)LYCB和LYCE基因的表達[44]．在本試驗中番茄果實番茄紅素含量與PSY和CrtISO基因表達呈正相關(guān),與PDS、ZDS和Z-ISO基因表達呈負相關(guān)．這與劉英明等[45]研究結(jié)果一致,番茄果實中番茄紅素含量與PSY基因表達量呈顯著正相關(guān)(p<0.05),對于番茄紅素和PDS、ZDS和Z-ISO基因表達呈負相關(guān),這可能與硼脅迫水平有關(guān)．

4 結(jié)論

微量元素硼參與作物的光合作用、細胞壁的合成、糖的轉(zhuǎn)化和運輸?shù)榷喾N生物代謝過程．本試驗中,隨著供硼水平的增加,2個品種番茄的小區(qū)產(chǎn)量均呈現(xiàn)增加趨勢,‘凱豐’和‘紅麗’產(chǎn)量分別較對照提高了27.3%～67.2%和22.2%～86.2%．‘凱豐’蔗糖含量在1 mg/L硼砂處理時達到最大值,而 ‘紅麗’在2 mg/L硼砂處理時達到最大值．在成熟期,‘凱豐’和‘紅麗’的番茄紅素含量在1 mg/L硼砂處理時達到最大值．轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),硼誘導下2個番茄品種的差異表達基因主要富集在生物過程中,涉及黃酮類生物合成、苯丙烷生物合成和氨基酸的代謝,部分差異基因還富集在番茄紅素合成代謝通路和糖分合成代謝通路上．在綠熟期,2個品種番茄的糖代謝關(guān)鍵酶基因AA、BA、NI、AI、SPS和SS基因表達量整體上調(diào),番茄紅素合成關(guān)鍵酶基因PSY、PDS、ZDS、CrtISO基因表達量在綠熟期上調(diào),Z-ISO基因表達量在成熟期上調(diào),相關(guān)分析顯示,可溶性總糖與BA、NI基因的表達水平呈正相關(guān),番茄紅素含量與PSY、CrtISO基因表達量呈正相關(guān)．