隋 麗, 路 楊, 謝 敏, 鄒曉威, 李啟云,,3,*, 張正坤,*

(1. 吉林省農業(yè)科學院植物保護研究所, 吉林省農業(yè)微生物重點實驗室, 農業(yè)農村部東北作物有害生物綜合治理重點實驗室,公主嶺 136100; 2. 吉林農業(yè)大學農學院, 長春 130118; 3. 吉林農業(yè)科技學院, 吉林 132101)

昆蟲的取食行為是生理代謝中的第一個環(huán)節(jié),是指昆蟲攝取食物以及與此相關的一系列活動(Bernays, 1998)。一般同種昆蟲個體的取食行為主要受兩個因素的影響:營養(yǎng)需求和食物適合度(Dusetal., 2011)。昆蟲借視覺、嗅覺、味覺等感覺通道對植物及環(huán)境所產生的刺激進行編碼內導,最后通過神經中樞的綜合和解碼,并根據遺傳所形成的模板和生理形態(tài),對植物做出選擇(彩萬志等, 2001)。植物氣味在植食性昆蟲和天敵的生境定位、寄生或捕食行為中發(fā)揮著關鍵的作用,寄主植物的氣味是植食性昆蟲確定寄主身份的主要感官刺激物,能夠對植食性昆蟲的寄主搜索、取食和產卵行為產生影響(Bruceetal., 2005; Turlings and Erb, 2018)。例如,李俊龍等(2019)研究表明,棉花揮發(fā)物中兩種化合物對紅火蟻Solenopsisinvicta具有顯著的引誘作用,是紅火蟻定位棉蚜Aphisgossypii、建立共生關系中的關鍵因素;張萌萌等(2021)研究發(fā)現,桃樹揮發(fā)物中的反-3-己烯醇和順-3-己烯醇對東方絹金龜Sericaorientalis雌成蟲有顯著的吸引作用,能夠為植物源引誘劑的開發(fā)奠定基礎。因此,研究昆蟲的選擇性行為對于明確植物-昆蟲互作關系,二者的生態(tài)適應性和害蟲防治方面有著重要意義。

昆蟲必須通過采食植物或其他動物所產生的有機物以取得生命活動過程所需要的能源,同時能夠利用高度敏感的嗅覺系統(tǒng)用以檢測并定位賴以生存的寄主(Bruce and Pickett, 2011)。植物作為自然生態(tài)系統(tǒng)中重要的生物類群,與周圍環(huán)境變化有著密切的聯系,也和同一生態(tài)系統(tǒng)中的其他生物(如微生物、昆蟲)的存在緊密的相關性(Shikanoetal., 2017)?，F有研究表明,很多有益微生物能夠對寄主植物的表型和生理生化指標產生重要影響,例如叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)、外生菌根真菌(ectomy corrhizal fungi, ECM)和內生真菌等(Compantetal., 2010)。在植物與微生物協(xié)同進化的過程中,有益微生物能夠促進寄主植物產生有利于保護自己或有利于寄主植物種群擴散的一系列性狀,以調控昆蟲的個體行為,這些性狀包括植物的顏色、形狀、大小等物理特性(王政等, 2014),同時也會產生多種不同的揮發(fā)性物質,以及一些次生代謝產物,對前來取食的昆蟲產生驅避或拒食作用(Zhuetal., 2023)?？梢?微生物能夠通過對寄主植物性狀的調控,進而影響植食性昆蟲的行為,這種作用對于農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中合理利用種間關系開展綠色防控具有重要指導意義。

蟲生真菌作為昆蟲的病原性天敵,在防治農業(yè)、林業(yè)和衛(wèi)生害蟲領域發(fā)揮了巨大作用(Pedrinietal., 2007; Vega, 2009; Zhaoetal., 2023)。近年來,國內外有大量研究表明,球孢白僵菌Beauveriabassiana可以在自然狀態(tài)或人工接種條件下定殖在植物組織內,對植物生長發(fā)育、抗性和耐逆性產生一系列影響(Vega, 2018; Mantzoukasetal., 2022)。此外,球孢白僵菌在植物內定殖,還能夠對植食性昆蟲產生一定的驅避性(隋麗等, 2020),并引起昆蟲取食量降低,種群數量下降(Rasooletal., 2021)。然而,大部分研究關注的是球孢白僵菌分生孢子在植物中的定殖特性。本團隊前期研究發(fā)現,球孢白僵菌不同類型孢子均能在植物中定殖且能提高寄主植物抗性(Suietal., 2022),但關于球孢白僵菌其他類型孢子在植物內定殖、間接調控昆蟲的研究仍然欠缺。為明確球孢白僵菌分生孢子和芽生孢子定殖玉米對亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis個體行為的影響,本研究測試了亞洲玉米螟響應這兩種孢子類型球孢白僵菌-玉米共生體的取食選擇和嗅覺反應,旨在揭示不同類型球孢白僵菌在玉米-亞洲玉米螟互作過程中的調控作用,以期為合理利用種間關系開發(fā)高效、環(huán)保的生物防治產品提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

供試蟲源為孵化后不超過12 h的亞洲玉米螟初孵幼蟲,以及用人工飼料飼養(yǎng)的蛻皮后不超過24 h的3齡幼蟲。供試幼蟲為吉林省農業(yè)科學院植物保護研究所提供。

1.2 供試植物

本研究選取玉米品種為墾粘一號,播種花盆規(guī)格為直徑20 cm×高14.5 cm,土壤選用丹麥進口泥炭土,每盆裝土2 kg,根據玉米幼苗生長的需求定時定量澆水。

1.3 供試菌種

球孢白僵菌菌株BbOFDH1-5由本實驗室于2008年從吉林省德惠市采集的亞洲玉米螟僵蟲蟲體上分離得到。該菌株保藏在中國農業(yè)微生物菌種保藏中心(ACCC No.32726)。本實驗選取實驗室培養(yǎng)的分生孢子和芽生孢子開展實驗(Suietal., 2022)。

1.4 球孢白僵菌-玉米共生體構建

玉米生長至3～5葉期,采用灌根法構建球孢白僵菌-玉米共生體(隋麗等, 2020)。每整株玉米接種球孢白僵菌孢子懸液20 mL,孢子懸液濃度為1.0×108個孢子/mL,每隔24 h灌根1次,共灌根3次,第3次灌根24 h后取樣。玉米幼苗共分為3組處理,分別為:處理1:對照組,以0.05% Tween-80代替球孢白僵菌孢子懸液;處理2:球孢白僵菌分生孢子(aerial conidia, AC)處理組;處理3:球孢白僵菌芽生孢子(blastospore, BS)處理組。

1.5 亞洲玉米螟取食選擇性和非選擇性試驗

采用葉碟法(隋麗等, 2020)測定亞洲玉米螟初孵和3齡幼蟲對1.4節(jié)構建的AC和BS處理組球孢白僵菌-玉米共生體取食選擇率(圖1)。

圖1 葉碟法測定亞洲玉米螟初孵幼蟲和3齡幼蟲在非選擇性(A)和選擇性(B)條件下對球孢白僵菌-玉米共生體玉米葉片的取食選擇率

1.5.1非選擇性試驗:選取直徑為15 cm塑料培養(yǎng)皿,放置1張直徑14 cm濾紙于培養(yǎng)皿底部, 加2 mL 蒸餾水保持濾紙濕潤,每個培養(yǎng)皿沿四周等距離分別放置9片1 cm×1 cm的1.4節(jié)構建的對照組、AC處理組和BS處理組玉米新鮮葉片,在培養(yǎng)皿中心接入9頭亞洲玉米螟初孵幼蟲或3齡幼蟲(3齡幼蟲以人工飼料飼喂,試驗前做2 h的饑餓處理)(圖1: A),初孵幼蟲和3齡幼蟲分別重復10次。接蟲后立即將培養(yǎng)皿用遮光布覆蓋,移入(26±1) ℃、相對濕度(60±10)%、光周期14L∶10D的養(yǎng)蟲室,分別在接蟲后1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10和12 h時統(tǒng)計幼蟲所在位置(葉片、培養(yǎng)皿壁或濾紙)及幼蟲數量,計算幼蟲取食選擇率,分析亞洲玉米螟幼蟲在不同處理組中,取食行為的變化情況。取食選擇率(%)=(取食該處理組植物葉片的幼蟲數/幼蟲總數)×100。

1.5.2選擇性試驗:將一張直徑14 cm濾紙鋪在培養(yǎng)皿底部中央并浸潤,等距離交替放置1.4節(jié)構建的對照組、AC處理組和BS處理組1 cm×1 cm分生玉米葉片,共6片(圖1: B),試驗設20次重復。其余處理及調查方法同1.5.1節(jié),分析不同處理玉米葉片對亞洲玉米螟幼蟲取食行為的影響。

1.6 亞洲玉米螟嗅覺選擇試驗

利用Y型嗅覺儀(XLM3-30-300XLM3-30-150,南京雪萊生物科技有限公司)測定亞洲玉米螟初孵幼蟲和3齡幼蟲對不同孢子類型球孢白僵菌-玉米共生體的嗅覺選擇性(圖2)。測試前,用75%的無水乙醇和正己烷對嗅覺儀管道、中央活動室和味源瓶進行沖洗,檢查裝置的氣密性,確保轉子流量計氣體流速穩(wěn)定,然后打開抽氣泵,通氣5 min使氣體揮發(fā),保持內部空氣無污染。選取1.4節(jié)構建的對照組、AC處理組和BS處理組長勢一致、葉面積大致相同、無病害、無害蟲的玉米葉片,剪成面積為1 cm×1 cm的小葉片。實驗時將等重量的玉米葉片放置在樣品裝載器位置,三臂分別放入對照組、AC處理組和BS處理組的玉米新鮮葉片。打開中央活動室的頂蓋,將亞洲玉米螟初孵幼蟲或3齡幼蟲(3齡幼蟲以人工飼料飼喂,實驗前做2 h的饑餓處理)從中央端口引入,然后蓋上頂蓋,打開氣泵,氣體流速控制在300 mL/min,通氣3 min,使氣味充滿Y型管道。當幼蟲在越過某臂2/3處判定該試蟲對該側氣味源作出選擇。計時20 min未做出選擇,記錄為0(不計數)。每組20頭幼蟲,重復10次。每組完成后,用乙醇和正己烷清洗中央活動室,并隨機交換3個處理位置,以免產生位置效應。其中,嗅覺選擇系數大于0,表示試蟲對味源物質有趨性,數值越大、趨性越強,最大值為1;嗅覺選擇系數小于0,則表示試蟲對味源物質有負趨性。嗅覺選擇系數=(味源管中蟲數-對照管中蟲數)/總的反應昆蟲的數量;嗅覺選擇反應率(%)=(味源管中蟲數/總的測試昆蟲數量)×100。

圖2 本研究使用的Y型嗅覺儀

1.7 數據分析

采用IBM SPSS Statistics 25軟件進行描述性統(tǒng)計及方差齊性檢測,并通過Duncan氏新復極差法進行多重比較及顯著性差異分析,運用LSD法進行多重比較分析,利用GraphPad 8.0.2軟件做圖。

2 結果

2.1 不同類型球孢白僵菌-玉米共生體對亞洲玉米螟取食選擇的影響

在非選擇性條件下,亞洲玉米螟初孵幼蟲對分生孢子(AC)處理組和芽生孢子(BS)處理組玉米葉片的取食選擇率與對照組玉米葉片的取食選擇率差異顯著(圖3: A),接蟲后3～12 h時初孵幼蟲對BS處理組玉米葉片的取食選擇率顯著低于對對照組的取食選擇率(P<0.05),接蟲后4～12 h時初孵幼蟲對AC處理組玉米葉片的取食選擇率顯著低于對對照組的取食選擇率(P<0.05),3～5 h時初孵幼蟲對BS處理組玉米葉片的取食選擇率顯著低于對AC處理組的取食選擇率(P<0.05)。3齡幼蟲對AC和BS處理組玉米葉片的取食選擇率總體低于對對照組的取食選擇率(圖3: B),其中接蟲后3～5 h時3齡幼蟲對BS處理組玉米葉片的取食率顯著低于對照組的(P<0.05),6～7 h時3齡幼蟲對AC和BS處理組玉米葉片的取食選擇率差異不顯著,8～10 h時 3齡幼蟲對AC和BS處理組中玉米葉片的取食選擇率顯著低于對照組(P<0.05);接蟲后1, 2, 3, 5, 6, 7, 8和12 h時3齡幼蟲對AC和BS處理組間玉米葉片的取食選擇率差異不顯著。

圖3 非選擇性條件下亞洲玉米螟初孵幼蟲(A)和3齡幼蟲(B)對球孢白僵菌-玉米共生體及對照組玉米葉片的取食選擇率

在選擇性條件下,亞洲玉米螟初孵幼蟲對分生孢子(AC)處理組和芽生孢子(BS)處理組玉米葉片的取食選擇率與對對照組玉米葉片的取食選擇率差異顯著(圖3: A),接蟲1～12 h時初孵幼蟲對AC和BS處理組玉米葉片的取食選擇率均顯著低于對對照組玉米葉片的取食選擇率(P<0.05),且對BS處理組玉米葉片的取食選擇率顯著低于對AC處理組玉米葉片的取食選擇率(P<0.05)。3齡幼蟲對AC和BS處理組玉米葉片的取食選擇率總體低于對對照組玉米葉片的取食選擇率,隨著接蟲時間的延長各組取食選擇率均呈現上升趨勢(圖3: B);3齡幼蟲對AC和BS處理組間玉米葉片取食選擇率差異不顯著(P>0.05)。

2.2 不同類型球孢白僵菌-玉米共生體對亞洲玉米螟初孵幼蟲和3齡幼蟲嗅覺反應的影響

亞洲玉米螟初孵幼蟲對分生孢子(AC)處理組和芽生孢子(BS)處理組與對對照組玉米葉片的嗅覺選擇系數和選擇反應率存在顯著差異(圖5)。初孵幼蟲對于對照組玉米葉片的嗅覺選擇系數為0.2599,對AC和BS處理組玉米葉片的嗅覺選擇系數分別為-0.6155和-0.4676(圖5: A),對AC和BS處理組玉米葉片的選擇反應率顯著低于對對照組玉米葉片的(P<0.01),分別降低69.5%和71.2%,對AC和BS處理組之間玉米葉片選擇反應率差異不顯著(P>0.05)(圖5: B)。

圖5 Y型嗅覺儀檢測亞洲玉米螟初孵幼蟲對球孢白僵菌-玉米共生體及對照組玉米葉片的嗅覺選擇系數(A)和嗅覺選擇反應率(B)

亞洲玉米螟3齡幼蟲對分生孢子(AC)處理組和芽生孢子(BS)處理組與對對照組玉米葉片的嗅覺選擇系數和選擇反應率存在顯著差異(圖6),3齡幼蟲對于對照組玉米葉片的嗅覺選擇系數為0.2113,表明對照組氣味源物質對于亞洲玉米螟3齡幼蟲有趨性;對于AC和BS處理組玉米葉片的嗅覺選擇系數分別為-0.5950和-0.6170(圖6: A),表明玉米螟3齡幼蟲對于AC處理組和BS處理組氣味源物質有負趨性。3齡幼蟲對AC和BS處理組玉米葉片的選擇反應率顯著低于對對照組玉米葉片的(P<0.01),分別降低66.5%和68.3%,對AC和BS處理組之間的選擇反應率差異不顯著(P>0.05)(圖6: B)。

圖6 Y型嗅覺儀檢測亞洲玉米螟3齡幼蟲對球孢白僵菌-玉米共生體及對照組玉米葉片的嗅覺選擇系數(A)和嗅覺選擇反應率(B)

3 討論

蟲生真菌的植物內生性已經得到國內外研究者的廣泛關注。近年來有一系列研究表明,蟲生真菌在植物中定殖能夠減少植食性昆蟲對植株的危害,并間接對昆蟲的生長發(fā)育產生不利影響,包括抑制昆蟲生長、延長發(fā)育時期、降低存活率等(Mantzoukas and Grammatikopoulos, 2020; 秦華偉等, 2021)。本團隊前期研究表明,球孢白僵菌不同類型孢子定殖能夠提高植物抗病性(Suietal., 2022),本研究結果表明,不同類型球孢白僵菌孢子在玉米植株中定殖,能夠對亞洲玉米螟取食行為和嗅覺反應產生顯著影響,提高植物抗蟲性,提示球孢白僵菌內生定殖在生物防治領域具有應用潛力。

本研究發(fā)現,在亞洲玉米螟取食選擇和非選擇條件下,初孵幼蟲和3齡幼蟲在未接種球孢白僵菌葉片對照組中的選擇率均高于接種球孢白僵菌處理組(圖3, 4),該結果與本團隊前期研究結果(隋麗等, 2020)相似,即球孢白僵菌在植物中定殖能夠減少植食性昆蟲的侵食。Russo等(2019)的昆蟲選擇性試驗也表明,玉米螟幼蟲對球孢白僵菌內生定殖玉米葉片的消耗量較少;還有研究利用昆蟲選擇性試驗明確了蟲生真菌定殖植物對不同種類昆蟲[例如,蚜科昆蟲(Aphididae),玉米葉蛾Helicoverpazea]取食行為的驅避作用?，F有研究結果證明,球孢白僵菌-玉米共生體能夠通過減少昆蟲采食量,對昆蟲產生負效應,從蟲生真菌定殖植物影響昆蟲取食行為的角度解析了蟲生真菌對植食性昆蟲的間接調控作用。影響昆蟲取食植物最主要的是植物的化學成分,其次是形態(tài)和結構(欽俊德, 1987)。Behie等(2017)的研究發(fā)現,蟲生真菌在植物中定殖能夠增加植株內氮元素以及一些微量元素的含量;還有研究發(fā)現蟲生真菌定殖能夠提高寄主植物對養(yǎng)分的利用率(Shrivastava, 2015; Quesada-Moraga, 2020)。我們推測,植物組織內養(yǎng)分含量的變化是影響昆蟲取食行為的主要原因。此外,植物次生代謝物和超氧化物的產生、植物甾醇譜的變化以及間接系統(tǒng)反應的誘導也可能是引起昆蟲行為改變的關鍵因素(Castillo Lopez and Sword, 2015),但關于這些方面的研究較少,在后續(xù)研究中仍有待于驗證。

植物揮發(fā)物的組成成分與比例構成了植物具有種屬特異性的“化學氣味指紋譜”,這與昆蟲定位取食植物有很大相關性(欽俊德,1995)。植物揮發(fā)性物質的化學組分及釋放易隨著季節(jié)、植物的年齡、生理狀況、空間分布及環(huán)境因子(如光照、土壤等)的不同而發(fā)生組分的改變(李建光, 2001),同時植物受到機械損傷、害蟲侵害、病原微生物及鄰近植物誘導等也會影響揮發(fā)性物質的釋放和組分變化,進而起到化學防御作用,這正是植物與環(huán)境協(xié)同進化的結果(Hartmann, 1996; Sharifietal., 2018)。本研究通過Y型管實驗分析明確了球孢白僵菌定殖玉米對亞洲玉米螟幼蟲嗅覺反應的影響,結果表明球孢白僵菌芽生孢子和分生孢子定殖葉片對亞洲玉米螟幼蟲均具有負趨性(圖5, 6)。鑒于揮發(fā)物是形成植物氣味的主體,我們推測球孢白僵菌定殖改變了寄主植物揮發(fā)物的組成,進而引起昆蟲的嗅覺反應發(fā)生改變。Zhu等(2023)的研究也證明了這一結論,該研究發(fā)現,球孢白僵菌在玉米中定殖,能夠通過改變玉米植株揮發(fā)物成分,影響亞洲玉米螟的產卵行為,明確了蟲生真菌能夠通過調節(jié)植物揮發(fā)物組成,提升植物防御性能,誘導植物-昆蟲之間的互作關系發(fā)生變化。本團隊在前期研究中發(fā)現,球孢白僵菌定殖能夠增加植物防御酶活性(Suietal., 2020),本研究則證明了球孢白僵菌定殖能夠引起昆蟲嗅覺反應發(fā)生改變,對植食性昆蟲產生驅避作用,從而提高植物抗蟲性。

綜上所述,球孢白僵菌芽生孢子和分生孢子在玉米植株中定殖均能對亞洲玉米螟的取食行為和嗅覺反應產生負效應,說明球孢白僵菌能夠通過調控昆蟲的個體行為,對寄主植物起到保護作用。本研究進一步明確了蟲生真菌-植物-昆蟲三者之間的生態(tài)適應性,為開發(fā)安全、高效的生防微生物制劑奠定了基礎,同時能夠為農田生態(tài)系統(tǒng)中綠色防控技術提供技術支持。