郭佳麗, 張岑鈺, 張 猛, 唐光輝, 張正青

(西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院, 楊凌 712100)

花絨寄甲Dastarcushelophoroides屬鞘翅目(Coleoptera)寄甲科(Bothrideridae),是蛀干類害蟲天牛的重要寄生性天敵(李孟樓等, 2007)。野外條件下,花絨寄甲初孵幼蟲依靠胸足爬行尋找寄主,咬破寄主表皮取食其體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì);成蟲食性較雜,喜好取食樹皮枝條、昆蟲尸體、天牛幼蟲和真菌等(雷瓊等, 2003; 路紀(jì)芳等, 2016)?，F(xiàn)階段,在生物防治天牛為害的過程中,主要通過大量人工飼養(yǎng)花絨寄甲并釋放以達(dá)到有效控制目的。在林間釋放試驗中, 釋放花絨寄甲對光肩星天牛Anoplophoraglabripennis的蟲口減退率可達(dá)90.98%,對黃斑星天牛Aeolestheschrysothrix的防治效果高達(dá)70.70%,對松褐天牛Monochamusalternatus總校正寄生效率為65.90%(董廣平等, 2013; 仇蘭芬等, 2019)。目前,花絨寄甲已經(jīng)實現(xiàn)室內(nèi)人工飼養(yǎng)。人工飼養(yǎng)花絨寄甲主要利用替代寄主和人工飼料,尚梅等(2009)依據(jù)寄主光肩星天牛體內(nèi)氨基酸成分及含量,改變?nèi)斯わ暳现邪被岜壤?發(fā)現(xiàn)可以提高花絨寄甲的老熟幼蟲的體長體寬以及羽化率,并研發(fā)出室內(nèi)有效擴繁花絨寄甲種群的人工飼料。顏學(xué)武等(2015)比較分別以黃粉蟲Tenebriomolitor、大麥蟲Zophobasatratus和松墨天牛Monochamusalternatus幼蟲為主要營養(yǎng)物質(zhì)制作的人工飼料的飼養(yǎng)效果差異,發(fā)現(xiàn)各組之間無顯著差異,證明了配方人工飼料在室內(nèi)養(yǎng)殖的適用性。王志華等(2018)綜合比對不同種人工飼料對花絨寄甲生長發(fā)育及繁殖歷期等的影響,發(fā)現(xiàn)加入黃粉蟲干粉、大麥蟲幼蟲干粉和氨基酸配制的飼料更有利于花絨寄甲的生長發(fā)育。然而,根據(jù)花絨寄甲成蟲在野外條件下食物來源配制的人工飼料是否適用于現(xiàn)階段長期室內(nèi)飼養(yǎng)種群生長發(fā)育有待進一步研究。不同配方飼料對花絨寄甲成蟲及后代生長發(fā)育影響顯著,因此,優(yōu)化飼料配方以利于花絨寄甲生長發(fā)育和繁育成為人工擴繁花絨寄甲種群用于釋放的迫切需求。

昆蟲體內(nèi)棲居著大量微生物以腸道菌群的形式定殖在消化道內(nèi)。前人研究表明,飼料的轉(zhuǎn)變會導(dǎo)致昆蟲的腸道微生物也發(fā)生變化,間接影響昆蟲的健康(Shietal., 2010)。其中,腸道細(xì)菌廣泛參與宿主食物消化,在幫助宿主合成營養(yǎng)物質(zhì)、參與宿主免疫防御和生殖代謝中發(fā)揮主要作用,為保證宿主正常生長發(fā)育提供保障(Kaltenpothetal., 2014)。研究發(fā)現(xiàn),蝗蟲腸道含有多種分泌纖維素酶的微生物,具有較高的纖維素分解活性(Suetal., 2014)。核桃果峰斑蛾Acrobasisnuxvorella腸道內(nèi)的一種細(xì)菌可以產(chǎn)生單寧酶以降解單寧中的沒食子酸酯鍵,成為該蟲可以消化單寧的重要原因(Consueloetal., 2022)。利用抗生素清除或剝離腸道細(xì)菌后,昆蟲的免疫能力、生長發(fā)育、產(chǎn)卵量和存活率均顯著下降(Muhammadetal., 2019)。昆蟲取食食物不同對其腸道菌群結(jié)構(gòu)影響顯著,消化吸收不同的食物成分會有不同的細(xì)菌參加其中(楊云秋等, 2018)。梨小食心蟲Grapholitamolesta在取食蘋果、桃、油桃、梨、李子等果實后,腸道細(xì)菌存在差異,取食李子的腸道群落多樣性最高,取食蘋果的腸道群落多樣性最低(Yuanetal., 2021)。斜紋夜蛾Spodopteralitura在取食自然食物與人工飼料后,腸道群落的優(yōu)勢菌目明顯不同(Xiaetal., 2018)。花絨寄甲成蟲在人工飼養(yǎng)的條件下壽命可達(dá)3年之久,成蟲羽化后20 d開始產(chǎn)卵,產(chǎn)卵高峰期持續(xù)兩個月,新羽化成蟲取食繭殼補充營養(yǎng)后破繭而出,隨后取食飼料,然而,取食不同配方的人工飼料是否會對花絨寄甲成蟲腸道菌產(chǎn)生影響,腸道細(xì)菌與其生長發(fā)育和繁殖間存在怎樣的關(guān)系還有待進一步研究。

本研究以花絨寄甲成蟲為研究對象,分析取食不同配方飼料對花絨寄甲親代成蟲體重、體長、體寬、產(chǎn)卵前期、持續(xù)產(chǎn)卵量及子一代孵化率、幼蟲歷期、寄生效率、結(jié)繭率、繭期和羽化率的影響;同時利用16S rDNA基因測序,分析長期取食不同配方飼料后花絨寄甲成蟲腸道細(xì)菌群落的變化情況,并對腸道細(xì)菌核心群落豐度與宿主生長發(fā)育和繁殖的關(guān)聯(lián)性進行分析。為優(yōu)化人工飼料配方,建立適合于室內(nèi)長期飼養(yǎng)花絨寄甲種群的人工飼料,實現(xiàn)室內(nèi)大量擴繁花絨寄甲種群奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx及飼育處理

所用花絨寄甲均來自于西部森林生物災(zāi)害治理國家林業(yè)局重點實驗室。全齡飼養(yǎng)條件為:溫度(23±2) ℃,相對濕度75%±5%,光周期16L∶8D。共配制6種人工飼料(飼料Ⅴ為現(xiàn)有人工飼料配方),飼料配方如表1所示。

表1 室內(nèi)飼養(yǎng)花絨寄甲飼料配方

按配方分別配制6種飼料置于-20 ℃保存?zhèn)溆?飼喂前取出,放置室溫下30 min后使用,隨機挑選24頭新羽化花絨寄甲成蟲(雌∶雄=1∶1)放入一個養(yǎng)蟲盒內(nèi)(長×寬×高=10 cm×10 cm×6.5 cm),每隔2 d以不同的配方飼料分別飼喂成蟲,每飼料處理3個重復(fù);以新羽化未飼喂飼料成蟲為對照。

1.2 花絨寄甲生長發(fā)育和繁殖參數(shù)測定

每5 d分別統(tǒng)計1.1節(jié)取食不同飼料花絨寄甲親代成蟲體重(g)、體長(cm)和體寬(cm);飼喂64 d時,統(tǒng)計花絨寄甲成蟲累計死亡率(%);從成蟲羽化后至每個飼養(yǎng)盒中雌成蟲開始產(chǎn)卵時為止,統(tǒng)計親代雌成蟲產(chǎn)卵前期(d); 從產(chǎn)卵盒發(fā)現(xiàn)第1粒卵開始持續(xù)觀察64 d,統(tǒng)計親代單雌日均產(chǎn)卵量 (每2 d統(tǒng)計1次求平均) 及觀察期內(nèi)單雌總產(chǎn)卵量。以未取食飼料的新羽化成蟲為對照組,每個處理進行3次重復(fù)。

將取食不同飼料花絨寄甲親代產(chǎn)的卵孵化后人工接種至替代寄主大麥蟲蛹上,統(tǒng)計取食不同配方飼料花絨寄甲子一代孵化率、幼蟲寄生率、結(jié)繭率、幼蟲歷期、繭期和羽化率。將含有卵塊的卵片放置培養(yǎng)皿中,在解剖鏡下統(tǒng)計卵的孵化率[孵化率(%)=(孵化孔數(shù)量/總卵數(shù)量)×100],隨機選取10頭花絨寄甲初孵幼蟲接種在大小一致的大麥蟲蛹上,統(tǒng)計寄生率[寄生率(%)=(成功寄生幼蟲數(shù)量/接種幼蟲數(shù)量)×100],觀察結(jié)繭率[結(jié)繭率(%)=(幼蟲結(jié)繭數(shù)量/成功寄生幼蟲數(shù))×100],記錄幼蟲歷期[幼蟲歷期(d)=幼蟲接種至結(jié)繭的時間]、繭期[繭期(d)=幼蟲結(jié)繭至羽化成蟲的時間]及羽化率[羽化率(%)=(羽化成蟲數(shù)量/幼蟲結(jié)繭數(shù)量)×100]。以未取食飼料的新羽化成蟲為對照組,各處理進行20個生物學(xué)重復(fù)。

1.3 花絨寄甲成蟲腸道DNA提取及16S rDNA測序

對照組和分別取食不同飼料10, 20和40 d成蟲隨機挑選5頭成蟲饑餓24 h后進行腸道無菌解剖, 5條腸道為1組進行基因組DNA提取,每處理3個生物學(xué)重復(fù),利用通用引物515F(5′-GTGCCAG CMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVG GGTWTCTAAT-3′)(Itohetal., 2014)對16S rDNA V4-V5區(qū)進行擴增。PCR擴增體系(25 μL): 2×ES Taq MasterMix (北京康為世紀(jì)生物公司)12.5 μL, ddH2O 9.5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, DNA模板1 μL。PCR反應(yīng)程序: 94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性1 min, 48 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min, 30個循環(huán);72 ℃終延伸10 min。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后用膠回收試劑盒切膠回收。純化的擴增子采用Illumina NovaSeq 6000平臺進行雙末端測序。

1.4 花絨寄甲成蟲腸道細(xì)菌序列分析

使用fastq(v0.14.1)軟件對測序原始序列雙端的原始讀段數(shù)據(jù)進行質(zhì)量剪裁(-W4-M20),并根據(jù)序列兩端的引物信息利用cutadapt (v4.1)軟件去除引物,得到質(zhì)控后的paired-end Clean Reads(PE reads)。根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系,利用usearch-fastq_mergepairs (V10)進行雙端序列拼接,再根據(jù)不同區(qū)域的長度范圍對拼接后數(shù)據(jù)過濾,獲得最終Effective Tags。利用Uparse(v7.0.1001)對所有樣本Effective Tags進行聚類,默認(rèn)以97%的一致性(identity)將序列聚類成為可操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs)(Haasetal., 2011)。

利用Mothur(v1.40.45)軟件OTU代表序列與Silva138數(shù)據(jù)庫(http:∥www.arb-silva.de/)比對進行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8～1),在各分類水平下(門、綱、目、科、屬、種和OTU)統(tǒng)計各樣品群落組成(Edgar, 2013)。使用R繪制成樣品各分類學(xué)水平下的群落結(jié)構(gòu)圖?；贠TU豐度表,取每處理3個重復(fù)的平均值,統(tǒng)計OTU在各處理中出現(xiàn)的情況并繪制Venn圖,同時選取取食同種飼料不同時間腸道細(xì)菌在屬水平上平均豐度前15物種,生成ternaryplot(三元相圖),以反映不同環(huán)境下優(yōu)勢物種的差異?；贠TU豐度表,使用usearch-alpha_div(V10)評估個樣品腸道細(xì)菌組成的豐富度和均勻性(Alpha多樣性),包括Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)等,并利用usearch -alpha_div_rare (V10)繪制在不同深度時的上述多樣性指數(shù)的稀釋曲線?；贠TU豐度表,使用R vegan軟件進行Beta多樣性分析,比較各樣品在物種多樣性方面的相似性,并基于weighted unifrac距離算法進行主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis, PCoA),并使用R語言ggplot2包進行繪圖。使用PICRUSt(v1.1.0)軟件對OTU豐度表進行標(biāo)準(zhǔn)化,通過每個OTU對應(yīng)的greengene id比對到KEGG(Kyoto Encylopaedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫,對花絨寄甲新羽化成蟲和取食飼料不同時間成蟲腸道內(nèi)細(xì)菌功能進行預(yù)測(Parksetal., 2014)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS(v23.0)軟件分析花絨寄甲生長發(fā)育和繁殖等數(shù)據(jù),結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,多組比較采用one-way ANOVA中Duncan氏多重檢驗(鄒垚, 2022)。利用R中的Pearson分析單雌日均產(chǎn)卵量隨時間變化情況,置信區(qū)間95%。使用R Vegan軟件進行兩組間和多組間的Alpha多樣性指數(shù)比較,分別進行Welch’st檢驗和Tukey氏HSD檢驗。基于Bray-Curtis距離算法,利用Adonis分析檢定新羽化成蟲與取食飼料后成蟲腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著性?；贙EGG level 2表,利用Wilcox秩和檢驗進行兩組間通路差異分析。使用R中的Pearson相關(guān)系數(shù)分析取食不同飼料后花絨寄甲成蟲腸道核心細(xì)菌屬相對豐度與生長發(fā)育和繁殖參數(shù)的相關(guān)性,并以熱圖表示。

2 結(jié)果

2.1 取食不同飼料對花絨寄甲親代成蟲生長發(fā)育和繁殖的影響

取食不同飼料的花絨寄甲成蟲體寬無顯著差異(P>0.05),體重及體長差異顯著(P<0.05)(表2)。其中,取食飼料Ⅵ的花絨寄甲成蟲體重最大,為0.0287 g;取食飼料Ⅳ的次之,為0.0271 g;取食飼料Ⅰ的體重、體長最小,分別為0.0248 g和7.6250 cm。取食飼料Ⅰ、飼料Ⅱ、飼料Ⅲ、飼料Ⅳ和飼料Ⅵ花絨寄甲成蟲64 d內(nèi)累計死亡率差異不顯著(P>0.05),取食飼料Ⅱ的64 d內(nèi)累計死亡率最高,為18.05%,取食飼料Ⅴ的64 d內(nèi)累計最低,為6.94%。取食飼料Ⅳ和飼料Ⅵ的花絨寄甲成蟲產(chǎn)卵前期最短,從羽化后21 d開始產(chǎn)卵;而取食飼料Ⅰ的花絨寄甲成蟲產(chǎn)卵前期較長,羽化后24 d才開始產(chǎn)卵。在整個觀察周期中,取食飼料Ⅳ和飼料Ⅵ的花絨寄甲成蟲64 d內(nèi)單雌總產(chǎn)卵量最多,分別為1 068.19和1 199.03粒, 取食飼料Ⅲ的花絨寄甲64 d內(nèi)單雌總產(chǎn)卵量最低,為732.61粒,整個觀察周期內(nèi),取食飼料與日均產(chǎn)卵量的相關(guān)性分析表明,取食飼料Ⅰ、飼料Ⅳ、飼料Ⅴ和飼料Ⅵ的單雌日均產(chǎn)卵量隨取食時間顯著增加(P<0.05),而取食飼料Ⅱ和Ⅲ的單雌產(chǎn)卵量隨取食時間逐漸降低(圖1)。

圖1 取食不同飼料后花絨寄甲成蟲單雌日均產(chǎn)卵量與取食時間的相關(guān)性

表2 取食不同飼料后花絨寄甲親代成蟲生長發(fā)育與繁殖參數(shù)

飼料配方見表1。表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤;同一行數(shù)據(jù)后標(biāo)注不同小寫字母表示經(jīng)Duncan氏多重比較后在0.05水平差異顯著;表3同。For diet formulae, see Table 1. Data in the table are mean±SE. Different letters following the data in the same row indicate significant difference at the 0.05 level by Duncan’s multiple comparisons. The same for Table 3.

表3 取食不同飼料后花絨寄甲成蟲的子一代的生長發(fā)育與繁殖參數(shù)

2.2 取食不同飼料對花絨寄甲子一代生長發(fā)育的影響

取食不同飼料的花絨寄甲成蟲子一代幼蟲歷期和繭期無顯著差異(P>0.05),而孵化率、幼蟲寄生率、結(jié)繭率和羽化率差異顯著(P<0.05)(表2)。取食飼料Ⅵ的花絨寄甲子一代孵化率最高, 為92.53%;取食飼料Ⅳ和飼料Ⅴ的次之,分別為90.03%和88.85%;取食飼料Ⅰ的最低,為86.91%。取食不同飼料成蟲的子一代結(jié)繭率由高到低為:取食飼料Ⅲ>取食飼料Ⅵ>取食飼料Ⅴ>取食飼料Ⅳ>取食飼料Ⅱ>取食飼料Ⅰ;取食不同飼料成蟲的子一代羽化率由高到低為:取食飼料Ⅵ>取食飼料Ⅴ>取食飼料 Ⅳ>取食飼料 Ⅲ>取食飼料 Ⅱ>取食飼料 Ⅰ。

2.3 取食不同飼料花絨寄甲成蟲腸道細(xì)菌16S rDNA序列拼接組裝與OTU聚類

取食不同飼料花絨寄甲成蟲腸道16S rDNA基因V4-V5區(qū)序列測定共得到5 037 493條有效讀段序列,進一步優(yōu)化得到4 781 552條高質(zhì)量有效序列。整體有效序列所占比例97%以上,滿足后續(xù)分析要求。對OTU進行聚類得到758個OTUs,分別注釋到11門22綱40目63科90屬。其中,對照組腸道細(xì)菌OTU數(shù)量高于取食不同配方飼料成蟲的。取食不同配方飼料后花絨寄甲腸道細(xì)菌屬水平種類隨取食時間均有增加。

將同處理下新羽化未取食飼料對照組成蟲與取食不同飼料不同時間成蟲3個重復(fù)的腸道細(xì)菌OTU取平均值后進行聚類分析,發(fā)現(xiàn)共有的OTU 為 34個,而對照組細(xì)菌特有OTU最多,為32個(圖2)。隨取食時間增加,取食不同飼料成蟲腸道內(nèi)特有細(xì)菌OTU數(shù)量逐漸增加,其中取食飼料Ⅰ、飼料Ⅱ和飼料Ⅲ 40 d時的花絨寄甲成蟲腸道特有細(xì)菌OTU數(shù)最多,取食飼料Ⅳ、飼料Ⅴ和飼料Ⅵ 20 d 時的特有細(xì)菌OTU數(shù)最多。分別選取持續(xù)取食不同配方飼料10-40 d時花絨寄甲腸道細(xì)菌在屬水平上平均豐度排名前15的物種,生成的ternaryplot結(jié)果表明,優(yōu)勢菌屬隨著取食時間增加逐漸形成。此外,部分優(yōu)勢菌屬如乳球菌屬Lactococcus、不動桿菌屬Acinetobacter和Hafnia-Obesumbacterium等的豐度隨取食時間逐漸增加。

圖2 取食不同飼料不同時間點花絨寄甲成蟲腸道細(xì)菌可操作分類單元(OTU)分布Venn圖

2.4 取食不同飼料花絨寄甲成蟲腸道細(xì)菌Alpha和Beta多樣性

Alpha 多樣性分析結(jié)果表明,與對照組相比,取食飼料后成蟲腸道細(xì)菌豐富度均顯著降低(P<0.05)(圖3: A)。取食飼料Ⅰ、飼料Ⅱ、飼料Ⅲ和飼料Ⅳ的成蟲腸道細(xì)菌Chao 1指數(shù)隨著取食天數(shù)的增加漸漸升高;其中取食飼料Ⅳ成蟲腸道細(xì)菌豐富度隨取食時間顯著增加(P<0.05)。Shannon指數(shù)用于反映群落的多樣性,取食飼料導(dǎo)致腸道細(xì)菌多樣性與對照組比顯著降低(P<0.01)(圖3: B)。除取食飼料Ⅰ成蟲外,取食其他飼料不同時間成蟲腸道細(xì)菌多樣性無顯著差異。

圖3 取食不同飼料不同時間點花絨寄甲成蟲腸道細(xì)菌Alpha多樣性Chao 1指數(shù)(A)和Shannon指數(shù)(B)

PCoA結(jié)果表明(圖4),基于weighted_unifrac距離矩陣的坐標(biāo)軸PCoA1和PCoA2的解釋度分別為59.2%和34.8%,利用Adonis分析對照組和取食不同飼料成蟲腸道細(xì)菌各樣本間的差異性,得到R2=0.679,P=0.001,說明取食不同飼料顯著改變了花絨寄甲成蟲腸道細(xì)菌群落組成。此外,取食不同飼料不同時間成蟲腸道細(xì)菌組成聚類接近,可能表明取食現(xiàn)有不同飼料對成蟲腸道群落組成影響較小。

圖4 取食不同飼料不同時間點花絨寄甲成蟲腸道細(xì)菌β多樣性主坐標(biāo)分析(PCoA)

2.5 取食不同飼料花絨寄甲成蟲腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

對照組花絨寄甲成蟲腸道的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes),相對豐度0.588,其次為變形菌門(Protebacteria)和放線菌門(Actinobacteria),相對豐度分別為0.205和0.169(圖5: A)。取食不同飼料不同時間成蟲間腸道細(xì)菌菌群相似,以厚壁菌門和變形菌門為主,與對照組比放線菌門相對豐度降低。此外,隨著取食時間增加,相比于取食10 d時,取食飼料Ⅳ-Ⅵ 40 d時的成蟲腸道內(nèi)厚壁菌門豐度分別增加0.224, 0.171和0.170。

圖5 取食不同飼料不同時間點花絨寄甲成蟲腸道細(xì)菌門(A)和屬水平(B)相對豐度

在屬水平,對照組新羽化成蟲腸道豐度排名前6的優(yōu)勢菌屬分別為乳球菌屬Lactococcus、棒狀桿菌屬Corynebacterium、芽孢桿菌屬Bacillus、葡萄球菌屬Staphylococcus、乳桿菌屬Lactobacillus和腸球菌屬Enterococcus,相對豐度分別為0.183, 0.165, 0.126, 0.089, 0.092和0.054(圖5: B)。取食不同飼料后成蟲腸道細(xì)菌主要由乳球菌屬組成,相對豐度較對照組顯著增加0.084～0.549 (P<0.05)。其中,取食飼料Ⅳ-Ⅵ成蟲腸道乳球菌屬的相對豐度隨時間逐漸上升,取食飼料Ⅰ和飼料Ⅲ 20 d時成蟲腸道乳球菌屬相對豐度最高。與對照組相比,取食飼料后未鑒定菌屬(unassigned)的相對豐度占比增加,表明成蟲在取食飼料后具有較多新物(種)發(fā)揮了功能,具有深入挖掘的潛力。此外,取食飼料Ⅰ 20 d時成蟲腸道(S12)不動桿菌屬Acinetobacter相對豐度最高,為0.073;取食飼料Ⅱ和飼料Ⅲ的成蟲腸道中Hydrotalea相對豐度隨取食時間增長在取食40 d時的相對豐度占比分別為0.016和0.0149;取食飼料Ⅳ的成蟲腸道Hafnia-Obesumbacterium相對豐度隨著取食時間增大,取食10, 20和40 d時相對豐度占比分別為0.0052, 0.0463和0.0558。

2.6 取食不同飼料花絨寄甲成蟲腸道細(xì)菌基因功能

花絨寄甲成蟲腸道細(xì)菌基因在KEGG level 2共注釋到15種代謝通路(圖6)。對照組成蟲腸道細(xì)菌80.74%基因參與新陳代謝相關(guān)通路,包括參與碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)(占14.54%)、氨基酸代謝(amino acid metabolism)(占12.55%)以及輔因子和維生素代謝(metabolism of cofactors and vitamins)(占11.89%)。取食不同飼料不同時間成蟲腸道細(xì)菌基因參與代謝通路與對照組相似,代謝通路數(shù)量差異不顯著(P>0.05)。

圖6 取食不同飼料不同時間點花絨寄甲成蟲腸道細(xì)菌基因KEGG level 2通路相對豐度分布

2.7 取食不同飼料成蟲腸道核心細(xì)菌屬相對豐度與花絨寄甲生長發(fā)育和繁殖的相關(guān)性

花絨寄甲成蟲腸道核心細(xì)菌屬水平相對豐度與其親代繁殖及子代生長發(fā)育相關(guān)指標(biāo)關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果表明(圖7),核心細(xì)菌相對豐度與親代成蟲體重、體長、體寬、產(chǎn)卵前期、64 d內(nèi)累計死亡率、64 d內(nèi)單雌總產(chǎn)卵量以及子一代孵化率、幼蟲寄生率、結(jié)繭率和羽化率呈現(xiàn)出不同的相關(guān)性。其中,親代成蟲體重與乳桿菌屬相對豐度顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),而與Mesorhizobium、Phreatobacter、 沙雷氏菌屬Serratia、Bradyrhizobium、Boseae和Hydrotalea相對豐度顯著正相關(guān)(P<0.05)。64 d內(nèi)單雌總產(chǎn)卵量與Bradyrhizobium和腸球菌屬相對豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。子一代孵化率與片球菌屬Pediococcus相對豐度極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),與Lentimicrohium相對豐度顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),幼蟲寄生率與腸球菌屬相對豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)?；ńq寄甲親代成蟲產(chǎn)卵前期與乳桿菌屬相對豐度極顯著正相關(guān)(P<0.01),但與腸球菌屬相對豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。子一代羽化率與芽孢桿菌屬相對豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),但與腸球菌屬相對豐度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。綜上,片球菌屬可能會降低子一代孵化率,腸球菌屬可能縮短親代成蟲產(chǎn)卵前期、降低子一代幼蟲寄生率增加羽化率,腸球菌屬分別與乳桿菌屬在產(chǎn)卵前期以及與芽孢桿菌屬在羽化率方面作用相反。

圖7 取食不同飼料花絨寄甲成蟲腸道核心細(xì)菌屬與生長發(fā)育和繁殖相關(guān)性分析

3 討論

3.1 取食不同飼料對花絨寄甲親代成蟲及子一代適合度影響分析

綜合親代成蟲和子一代幼蟲生長發(fā)育和繁殖的相關(guān)指標(biāo),研究顯示取食飼料Ⅳ和飼料Ⅵ的成蟲體重高、體長大、死亡率低、產(chǎn)卵前期短,并且單雌日均產(chǎn)卵量和單雌總產(chǎn)卵量均高于取食其他飼料的花絨寄甲成蟲的(表2; 圖1)。相比于飼料Ⅲ和飼料Ⅴ,飼料Ⅳ和飼料Ⅵ利用大麥蟲粉代替了原有飼料中的蠶蛹粉(表1)。與熟知的黃粉蟲幼蟲、蠶蛹、蟋蟀、白蠟蟲和家蠅相比,大麥蟲的蛋白質(zhì)、氨基酸和能量均居首位,具有很高的營養(yǎng)價值(王利娟, 2014)。大麥蟲中含有豐富功能性氨基酸,如精氨酸和亮氨酸等,可參與合成多種生物活性物質(zhì),可能有利于花絨寄甲的生殖(周根來和殷潔鑫, 2021)。同時,寄生性天敵昆蟲不僅因地理隔離產(chǎn)生種群分化,也可能因寄生不同的寄主產(chǎn)生種群內(nèi)的分化,從而更加適應(yīng)寄主的生活特性和棲境條件,形成許多適應(yīng)性策略,寄生昆蟲本身的學(xué)習(xí)行為,包括產(chǎn)卵期間經(jīng)歷的線索或與寄主接觸等過程,也能夠修正寄生昆蟲的初始選擇(王小藝和楊忠岐, 2010)。實驗室內(nèi)長期大量飼養(yǎng)的花絨寄甲種群,主要以大麥蟲作為替代寄主,經(jīng)過多代持續(xù)擴繁,其成蟲可能已形成適應(yīng)大麥蟲粉作為主要營養(yǎng)物質(zhì)的人工飼料。營養(yǎng)匱乏不利于昆蟲生長發(fā)育和生態(tài)行為能力(Reimetal., 2019)。本研究所配制的飼料Ⅰ和飼料Ⅱ未添加任何蟲粉,相較于其他飼料蛋白營養(yǎng)物質(zhì)匱乏,不利于寄生性天敵昆蟲花絨寄甲的生長發(fā)育和繁殖。飼料Ⅱ、飼料Ⅴ和飼料Ⅵ較飼料Ⅰ、飼料Ⅲ和飼料Ⅳ分別添加了木粉(楊樹韌皮部表皮與柳樹嫩枝研磨成粉),取食前3種飼料雌成蟲的總產(chǎn)卵量均有增加,木材由無數(shù)小的細(xì)胞組成,細(xì)胞壁由多糖的纖維素和半纖維素以及具有芳香性的木質(zhì)素組成,其中纖維素占40%～62%,木質(zhì)素占18%～38%,半纖維素占8%～37%,淀粉60%以上,糖占6%,蛋白質(zhì)占1%～2%,這些營養(yǎng)物質(zhì)可能會促進花絨寄甲的生長發(fā)育。取食飼料Ⅳ和Ⅵ成蟲單雌日均產(chǎn)卵量均隨取食時間顯著增加(圖1),但取食飼料Ⅵ成蟲的64 d內(nèi)單雌總產(chǎn)卵量和子一代孵化率、結(jié)繭率顯著高于取食飼料Ⅳ成蟲的。研究表明,雌成蟲在選擇產(chǎn)卵時往往對棲息地的變化和宿主的質(zhì)量敏感,食物質(zhì)量和豐度差異是決定后代生長發(fā)育關(guān)鍵因素(Smithetal., 2018)。綜上所述,綜合考慮親代成蟲的生長發(fā)育和繁殖以及子一代的適合度,本研究中的配方飼料Ⅵ更適合于室內(nèi)長期飼養(yǎng)花絨寄甲種群。

3.2 取食不同飼料花絨寄甲成蟲腸道細(xì)菌結(jié)構(gòu)與組成

對照組和與取食不同飼料成蟲腸道細(xì)菌共注釋到758個OTUs,發(fā)現(xiàn)34個共有的OTUs,其中取食飼料Ⅳ的OTU數(shù)量較高。S0共注釋到32個特有OTUs(圖2)。對于完全變態(tài)的全變態(tài)昆蟲,在整個發(fā)育過程中腸道定殖細(xì)菌可能發(fā)生顯著變化,當(dāng)成蟲羽化時,其腸道內(nèi)重新被高密度的存在于蛹室中的細(xì)菌種群定殖(Wangetal., 2017)。成蟲期持續(xù)取食的昆蟲羽化1周后,腸道微生物種群基本穩(wěn)定且不易被其他物種定殖(Dillon and Dillon., 2004)?；ńq寄甲腸道細(xì)菌優(yōu)勢菌屬隨著取食時間增加逐漸形成。研究表明,取食不同食物會引起昆蟲腸道微環(huán)境存在差異,進而導(dǎo)致其腸道微生物多樣性的差異(吳曉露等, 2019)。在本研究中,與對照(S0)相比,取食不同配方飼料后成蟲腸道細(xì)菌多樣性顯著降低,取食不同的人工飼料成蟲間的腸道細(xì)菌多樣性和群落組成無顯著差異(圖3)。花絨寄甲成蟲腸道細(xì)菌種類豐富,共鑒定了11個門22個綱40個目63個科90個屬。在門水平,成蟲腸道厚壁菌門和變形菌門豐度均占比較大,優(yōu)勢明顯,其余門類占比較小(圖5: A),與前人利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和PCR-DGGE鑒定結(jié)果一致,同時也與其他鞘翅目昆蟲如異色瓢蟲Harmoniaaxyridis和松墨天牛腸道優(yōu)勢菌門(王偉偉, 2013; 羅巧玉, 2018; 閆裕, 2019)類似。

3.3 取食不同飼料花絨寄甲成蟲腸道菌群多樣性及特定細(xì)菌組成

與對照組(S0)相比,取食不同配方飼料后成蟲腸道細(xì)菌Alpha和Beta多樣性均顯著降低(圖3),但取食不同飼料成蟲腸道細(xì)菌多樣性和群落組成差異較小(圖3)。外源因素如宿主飲食和內(nèi)源因素如宿主系統(tǒng)發(fā)育對腸道微生物群落結(jié)構(gòu)有著強烈的影響,在直翅目昆蟲中取食習(xí)性和分類地位共同影響其腸道細(xì)菌群落組成(Zhengetal., 2021),這與我們的研究結(jié)果相似。

在屬水平,對照組注釋到優(yōu)勢菌屬分別為乳球菌屬、棒狀桿菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、乳桿菌屬和腸球菌屬,而取食人工飼料后成蟲腸道細(xì)菌主要由乳球菌屬組成,且其相對豐度較對照組顯著增加(圖5: B)。在環(huán)境因子脅迫下,具有特殊功能的細(xì)菌種類可能會加快繁殖以幫助宿主抵御環(huán)境變化,而其他菌株相應(yīng)減少,以達(dá)到群落平衡(孫文雯等, 2023)?；ńq寄甲成蟲羽化后通常在繭內(nèi)停留1～2 d,然后咬破繭殼并取食補充營養(yǎng)后再爬出坑道外,室內(nèi)飼養(yǎng)的成蟲主要取食人工飼料,可能是造成新羽化成蟲與取食后成蟲腸道微生物差異的主要原因(路紀(jì)芳等, 2016)。此外,取食不同飼料不同時間成蟲腸道內(nèi)其他菌屬,如不動桿菌屬、Hydrotalea、Hafnia-Obesumbacterium和未鑒定菌屬相對豐度增加,可能原因為成蟲在取食飼料后腸道內(nèi)形成了較多新物(種)發(fā)揮重要功能。

3.4 取食不同飼料花絨寄甲成蟲腸道乳球菌重要功能

取食不同飼料后花絨寄甲成蟲腸道內(nèi)相對豐度最高細(xì)菌的是乳球菌屬,其中,取食飼料Ⅳ-Ⅵ成蟲腸道乳球菌屬的相對豐度隨時間逐漸上升,取食飼料Ⅰ和飼料Ⅲ 20 d時成蟲腸道乳球菌屬相對豐度最高(圖5)。乳球菌大量存在于乳制品、牛奶、蔬菜和活性污泥,通常用于食品生產(chǎn)(Choetal., 2008)。花絨寄甲成蟲腸道細(xì)菌主要參與碳水化合物代謝、萜類化合物和聚酮的代謝、異源生物降解和代謝以及聚糖生物合成和代謝(圖6)。王建梅(2020)通過長翅素木蝗Shirakiacrisshirakii和花脛綠紋蝗Aiolopustamulus的消化率與微生物相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)腸球菌屬和乳球菌屬與纖維素的消化具有顯著相關(guān)性。白蟻后腸中分離得到的乳球菌屬在以葡萄糖和纖維二糖上培養(yǎng)基上生長消耗氧氣,可能與碳水化合物的代謝有關(guān)(Baueretal., 2000)。紅棕象甲Rhynchophorusferrugineus幼蟲的腸道中鑒定出能夠通過編碼相應(yīng)的水解酶來降解多糖和蔗糖的細(xì)菌種類,如乳酸乳球菌Lactococcuslactis。用環(huán)氧蟲啶處理后的美洲大蠊Periplanetaamericana前腸中的乳球菌屬相對豐度從0.16%增加到10.68%,發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵產(chǎn)物可為產(chǎn)甲烷菌提供碳源,同時可能與水解和產(chǎn)酸有關(guān)(Baoetal., 2021)。

3.5 取食不同飼料花絨寄甲成蟲腸道核心細(xì)菌屬與其生長發(fā)育和繁殖的關(guān)系

分析花絨寄甲腸道豐度較高的核心細(xì)菌屬的相對豐度與親代成蟲生長發(fā)育和繁殖及子代適合度的相關(guān)性發(fā)現(xiàn),腸道乳桿菌屬相對豐度與成蟲體重呈顯著顯著負(fù)相關(guān),而與親代產(chǎn)卵前期呈顯著正相關(guān)(圖7),說明乳桿菌的大量存在可能導(dǎo)致成蟲體重降低、產(chǎn)卵前期延長,乳桿菌屬細(xì)菌具有合成果膠降解酶、糖苷水解酶和多糖水解酶的能力,可能參與昆蟲的營養(yǎng)代謝(張靜和張博, 2017)。研究發(fā)現(xiàn),低劑量乳桿菌干預(yù)前后,雌鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)并不存在顯著的變化,而高劑量組雄鼠腸道菌群的多樣性則顯著降低(何嘉怡, 2018)。腸球菌屬相對豐度與成蟲產(chǎn)卵量和子一代羽化率呈顯著正相關(guān)而與親代產(chǎn)卵前期與呈顯著負(fù)相,說明,腸球菌的高豐度可以增加成蟲產(chǎn)卵量、減少親代產(chǎn)卵前期并提高子代羽化數(shù)量。腸道中的腸球菌屬含有與豐富的纖維素、木聚糖和果膠降解相關(guān)的酶編碼基因,在幫助宿主降解聚合物方面發(fā)揮著重要作用(Xiaetal., 2018)。乳球菌屬通過促進降解和消化食物給機體補充營養(yǎng),但本研究發(fā)現(xiàn)成蟲取食后腸道內(nèi)高豐度細(xì)菌乳球菌的相對豐度與生長發(fā)育指標(biāo)相關(guān)性并不顯著,可能其作為一種益生菌廣泛參與寄主的生長和免疫(Becketal., 2015)。芽孢桿菌屬相對豐度與子一代羽化率呈顯著負(fù)相關(guān),但Toledo等(1999)研究表明,暴露于蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensisβ-外毒素處理中的幸存成蟲在壽命、繁殖力和孵化率(生育能力)方面沒有負(fù)面影響,高歡歡等(2016)研究表明,枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis對韭菜遲眼蕈蚊Bradysiaodoriphaga孵化率、蛹羽化率及成蟲產(chǎn)卵量均無影響。體重與Mesorhizobium、Phreatobacter、沙雷氏菌屬Serratia、Bradyrhizobium、Bosea和Hydrotalea對豐度顯著正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)線蟲沙雷氏菌對于崇明擬異小桿線蟲的繁殖、生長、發(fā)育都有明顯促進作用(張崇星, 2009)。Hydrotalea是一種纖維素降解菌且食物纖維含量與草魚腸道中纖維素降解菌群多樣性之間存在正相關(guān)關(guān)系(Lietal., 2016)。

綜上所述,取食不同飼料對花絨寄甲成蟲生長發(fā)育、繁殖及腸道細(xì)菌均有顯著影響。隨著室內(nèi)長期飼養(yǎng),花絨寄甲人工種群逐漸適應(yīng)了以大麥蟲為替代寄主和以大麥蟲為主要營養(yǎng)物質(zhì)的人工飼料,新的配方飼料在花絨寄甲體重、產(chǎn)卵量、產(chǎn)卵前期和羽化率上均表現(xiàn)較好。因此,人工飼料Ⅳ和Ⅵ可以作為后續(xù)花絨寄甲長期室內(nèi)飼養(yǎng)種群成蟲的食物。同時,本研究首次利用16S rDNA的分析了取食不同飼料花絨寄甲腸道細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu);并探索了腸道細(xì)菌與成蟲生長繁殖和子代適應(yīng)性的關(guān)聯(lián)性,發(fā)現(xiàn)了可能在花絨寄甲生長繁殖種發(fā)揮重要作用的乳球菌屬,可為下一步改善花絨寄甲室內(nèi)養(yǎng)殖技術(shù)以提高花絨寄甲成蟲產(chǎn)卵及幼蟲寄生和羽化提供研究基礎(chǔ)。