孟建玉, 金 鑫, 何龍春, 張雪霞, 楊昌利, 張長禹,*

(1. 貴州省煙草科學(xué)研究院, 貴陽 550081; 2. 貴州省煙草公司貴陽市公司, 貴陽 550002; 3. 貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 貴陽 550025)

蠋蝽Armachinensis屬半翅目(Hemiptera)蝽科(Pentatomidae),是許多農(nóng)林業(yè)害蟲的優(yōu)勢天敵,其成蟲和若蟲對鱗翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)和膜翅目(Hymenoptera)等40余種害蟲具有較強的捕食能力(Zouetal., 2013; Mengetal., 2022)。蠋蝽搜尋到害蟲后,可將口針刺入害蟲的頭、胸或腹部,然后刺吸害蟲的體液(唐藝婷等, 2019)。孟建玉等(2022)研究發(fā)現(xiàn)蠋蝽3-5齡若蟲對草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda3齡幼蟲的日最大捕食量分別為56.18, 59.88和64.94頭,具有良好的控害潛能。大量研究表明蠋蝽可捕食斜紋夜蛾S.litura、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella、粘蟲Mythimnaseparata和煙青蟲Helicoverpaassulta等多種鱗翅目害蟲幼蟲(李嬌嬌等, 2016; 唐藝婷等, 2020; 李發(fā)倩等, 2021; 楊燦等, 2022)。由于蠋蝽便于人工飼養(yǎng)和大規(guī)模擴(kuò)繁,已在國內(nèi)初步實現(xiàn)商品化供應(yīng),在煙草、蔬菜、園林等多種作物害蟲的生物防治發(fā)揮了重要作用,具有廣闊的應(yīng)用前景。目前,關(guān)于蠋蝽的研究主要集中在捕食能力、生物學(xué)特性、系統(tǒng)發(fā)育和化學(xué)生態(tài)學(xué)等方面,但對蠋蝽的環(huán)境適應(yīng)性研究鮮有報道。

Tissiéres等(1974)在研究中發(fā)現(xiàn),黑腹果蠅Drosophilamelanogaster在熱激反應(yīng)發(fā)生時能夠產(chǎn)生一種高度保守的特異性蛋白,并將其命名為熱激蛋白(heat shock protein, Hsp),也稱熱休克蛋白。根據(jù)熱激蛋白保守結(jié)構(gòu)域的不同和分子量的大小可將其分為5個家族:Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp40和小分子熱激蛋白(small heat shock proteins, sHsps)(Kimetal., 1998; Hoffmannetal., 2003)。Hsp83屬于Hsp90家族,參與昆蟲多種生理生化反應(yīng),如細(xì)胞間信息傳導(dǎo)、胚胎發(fā)生和生物應(yīng)激反應(yīng)等,對昆蟲生長發(fā)育和響應(yīng)環(huán)境脅迫具有重要作用(Knorr and Vilcinskas, 2011; Heetal., 2014; Schopfetal., 2017)。在意大利蜜蜂Apismelliferaligustica性腺發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn),Hsp83表達(dá)量顯著上調(diào)參與其卵子發(fā)生過程(Lagoetal., 2022)。在溫度脅迫下,腐食酪螨Tyrophagusputrescentiae和馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata的Hsp90轉(zhuǎn)錄水平均顯著上升,從而減少溫度帶來的不利影響(Dumasetal., 2019; Wangetal., 2021)。黑紋粉牒Pierismelete在滯育狀態(tài)下受到4 ℃低溫和31 ℃高溫誘導(dǎo)時,Hsp90的表達(dá)量顯著上調(diào)(Wuetal., 2018)。近年來,由于環(huán)境污染對大氣層臭氧層的破壞,使得地球表面的UV-B輻射急劇增加,從而對昆蟲造成脅迫,影響其生長發(fā)育(Potter and Woods, 2013; Qianetal., 2016),研究表明,在UV-B脅迫下,煙蚜Myzuspersicae可通過Hsp90表達(dá)量變化響應(yīng)UV-B脅迫(蘇麗等, 2018)。

本研究利用RT-PCR技術(shù)克隆蠋蝽熱激蛋白基因AcHsp83a和AcHsp83b,通過生物信息學(xué)方法分析其序列特征,使用RT-qPCR檢測AcHsp83a和AcHsp83b在蠋蝽不同發(fā)育階段、成蟲不同組織以及不同時長溫度(38和4 ℃)和UV-B脅迫下的相對表達(dá)量,揭示AcHsp83a和AcHsp83b在蠋蝽響應(yīng)高低溫和UV-B脅迫中的作用,探究蠋蝽在響應(yīng)環(huán)境脅迫的分子機制,為科學(xué)利用蠋蝽提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試蟲

蠋蝽蟲源來自貴州省煙草科學(xué)研究院福泉基地,飼養(yǎng)條件為溫度(26±1) ℃、相對濕度65%±5%和光周期16L∶8D。

1.2 樣品收集

隨機分別收集蠋蝽卵50粒、1齡若蟲40頭、2齡若蟲30頭、3齡若蟲20頭、4齡若蟲15頭、5齡若蟲10頭、雌成蟲10頭和雄成蟲10頭,重復(fù)3次,取樣后立即置于液氮中保存。收集蠋蝽成蟲頭、胸、腹和翅(每個組織取樣15頭)以及觸角、脂肪體、足、馬氏管、口器、中腸、卵巢/精巢(每個組織取樣20頭),重復(fù)3次,取樣后立即置于液氮中保存。

將蠋蝽雌成蟲和雄成蟲從 26 ℃常規(guī)飼養(yǎng)溫度條件下分別轉(zhuǎn)移至38 ℃高溫和4 ℃低溫下進(jìn)行脅迫處理,處理0(CK), 6和24 h時每個處理取10頭,重復(fù)3次,取樣后立即置于液氮中保存。選取蠋蝽雌成蟲和雄成蟲暗適應(yīng)2 h后進(jìn)行UV-B照射,照射強度為320 μW/cm2,處理0(CK), 6和12 h時每個處理取10頭,重復(fù)3次,取樣后立即置于液氮中保存。

1.3 總RNA提取和cDNA合成

采用Eastp?Super Total RNA Extraction Kit(Promega)提取1.2節(jié)蠋蝽總RNA,通過1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計NanoDrop 2000 (Thermo)檢測RNA的質(zhì)量和濃度。以總RNA為模板,利用HiFiScript cDNA Synthesis Kit(CoWin Biosciences)合成cDNA第1鏈。

1.4 蠋蝽Hsp90s的克隆

通過對已知同源昆蟲Hsp83序列比對及蠋蝽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),在保守區(qū)設(shè)計特異性引物(表1),以cDNA第1鏈為模板擴(kuò)增蠋蝽Hsp83。PCR反應(yīng)體系(25 μL): cDNA模板1.5 μL, TaKaRa Ex Primer TaqTM酶(1.25 μmol/25 μL) 12.5 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, ddH2O 9 μL。擴(kuò)增程序: 98 ℃ 3 min; 98 ℃ 10 s, 55～58 ℃ 20 s, 72 ℃ 1 min, 34個循環(huán);72 ℃ 5 min。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,用SanPrep Column PCR Product Purification Kit(Sangon Biotech)回收純化目的片段,連接克隆pMDTM19-T載體(TaKaRa)并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa),挑取經(jīng)PCR檢測的陽性克隆送至生工生物工程有限公司測序。

表1 本研究所用引物

1.5 序列分析

利用NCBI Blast工具進(jìn)行同源序列檢索確認(rèn)后獲得基因的全長序列,利用ORF Finder(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找蠋蝽AcHsp83a和AcHsp83b的開放閱讀框,用DNAMAN(Lynnon Biosoft, San Ramon, CA, 美國)推導(dǎo)編碼蛋白氨基酸序列,使用ExPASy ProtParam(http:∥us.expasy.org/tools/protparam.html)預(yù)測蛋白理化性質(zhì),使用ExPASy PROSITE(https:∥prosite.expasy.org/prosite.html)和InterProScan(http:∥www.ebi.ac.uk/Tools/pfa /iprscan/)預(yù)測結(jié)構(gòu)域。利用BLASTP(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)搜索比對其他昆蟲同源蛋白質(zhì)序列,應(yīng)用軟件MEGA 6.0以鄰接法(1 000次重復(fù))構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(Tamuraetal., 2011)。

1.6 蠋蝽AcHsp83a和AcHsp83b的表達(dá)分析

采用RT-qPCR檢測蠋蝽不同發(fā)育階段、成蟲不同組織、不同溫度和UV-B脅迫下AcHsp83a和AcHsp83b的表達(dá)量,根據(jù)基因全長序列在編碼區(qū)設(shè)計定量引物(表1),以GAPDH,RPL27和β-actin作為內(nèi)參基因。按照TB Green?Premix DimerEraserTM試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行RT-qPCR,反應(yīng)體系: cDNA模板1 μL, TB Green Premix Ex Taq 10 μL, ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, 6.6 μL ddH2O。反應(yīng)程序: 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s, 57 ℃ 30 s, 40個循環(huán),3次生物學(xué)重復(fù),使用2-ΔΔCt法進(jìn)行基因表達(dá)量相對定量分析。

1.7 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS21.0進(jìn)行統(tǒng)計分析,采用Duncan法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 蠋蝽AcHsp83a和AcHsp83b的克隆與序列

克隆獲得蠋蝽AcHsp83a和AcHsp83b(GenBank登錄號分別為OP791883和OP791884),開放閱讀框(ORF)分別長為2 172和2 163 bp,分別編碼723和720個氨基酸,編碼蛋白相對分子量分別為83.12和82.90 kD,等電點(pI)分別為4.94和4.97,穩(wěn)定性系數(shù)分別為42.61和39.91。AcHsp83a和AcHsp83b的保守位點都為YSNKEIFLRE, AcHsp83a和AcHsp83b有7條Hsp90熱休克蛋白特征序列,即ETFAFQAEIAQLMSLIINTFY, SNKEIFLR ELISNSSDALDKIRY, SLTIIDTGIGMTKADLVN, NLG TIAKSGTKAFMEALQ, IGQFGVGFYSAYLVADRVTV SSK, RGTKIVLYIKEDQAEFLE和ERKIKEVVKKHS QFIGYPI, AcHsp83a和AcHsp83b氨基酸尾端有MEEVD序列,表明兩個蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)中,為胞質(zhì)熱激蛋白。

系統(tǒng)發(fā)育樹顯示(圖1),AcHsp83a和AcHsp83b與茶翅蝽HalyomorphahalysHsp83(GenBank登錄號: XP_014284945.1)聚為一支,其他昆蟲Hsp83按目聚為一支;序列相似性分析表明,蠋蝽AcHsp83a和AcHsp83b與茶翅蝽Hsp83(GenBank登錄號: XP_014284945.1)的氨基酸序列一致性最高。

圖1 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的蠋蝽與其他昆蟲Hsp83系統(tǒng)進(jìn)化樹(1 000次重復(fù))

2.2 蠋蝽AcHsp83a和AcHsp83b在不同發(fā)育階段和成蟲組織中的表達(dá)量

AcHsp83a和AcHsp83b在蠋蝽不同發(fā)育階段的表達(dá)模式不同(圖2)。AcHsp83a在蠋蝽所有發(fā)育階段均有表達(dá),在卵期的表達(dá)量最高,顯著高于其他發(fā)育階段的(P<0.05),其次是在雄成蟲和雌成蟲中的(圖2: A)。AcHsp83b除在5齡若蟲中不表達(dá)外,在其他發(fā)育階段均有表達(dá),且在雄成蟲中表達(dá)量最高,其次是在雌成蟲中的,雌雄成蟲中的表達(dá)量顯著高于其他發(fā)育階段的(P<0.05)(圖2: B)。

圖2 不同發(fā)育階段蠋蝽AcHsp83a(A)和AcHsp83b(B)的相對表達(dá)量

AcHsp83a和AcHsp83b在蠋蝽雌雄成蟲11種組織中的表達(dá)量存在顯著差異(圖3)。在雌成蟲中,AcHsp83a和AcHsp83b均在中腸中表達(dá)量最高。在雄成蟲中,AcHsp83a在精巢中表達(dá)量最高,其次是在馬氏管中的(圖3: A);AcHsp83b在中腸中表達(dá)量最高,其次是在馬氏管中的(圖3: B)。

圖3 蠋蝽成蟲不同組織中AcHsp83a(A)和AcHsp83b (B)的相對表達(dá)量

2.3 蠋蝽AcHsp83a和AcHsp83b在高低溫脅迫下的表達(dá)量

高溫能誘導(dǎo)蠋蝽AcHsp83a和AcHsp83b的表達(dá)(圖4)。38 ℃脅迫下,雌雄成蟲AcHsp83a和雌成蟲AcHsp83b的表達(dá)量先升高后下降,AcHsp83a在6 h的表達(dá)量最高,且顯著高于對照(0 h)(P<0.05)(圖4: A);隨著脅迫時間的延長,雌雄成蟲AcHsp83b的表達(dá)量在24 h時較6 h時的均顯著降低(P<0.05),雄成蟲AcHsp83b在6和24 h時的表達(dá)量均較對照組的顯著下降(P<0.05)(圖4: B)。

圖4 蠋蝽成蟲AcHsp83a (A)和AcHsp83b (B)在38 ℃高溫脅迫下的相對表達(dá)量

低溫脅迫下蠋蝽AcHsp83a和AcHsp83b的表達(dá)有所不同(圖5)。4 ℃脅迫下,雌成蟲AcHsp83a和AcHsp83b表達(dá)量出現(xiàn)先增加后降低的趨勢,在6 h的表達(dá)量顯著高于對照(0 h)(P<0.05);與6 h相比,隨著低溫脅迫時間的延長,AcHsp83a和AcHsp83b表達(dá)量均顯著下降(P<0.05)。雄成蟲AcHsp83a的表達(dá)量先降低后升高,在6 h顯著低于對照(P<0.05);AcHsp83b在6和24 h的表達(dá)量較對照均顯著降低(P<0.05)。

圖5 蠋蝽成蟲AcHsp83a (A)和AcHsp83b (B)在4 ℃低溫脅迫下的相對表達(dá)量

2.4 蠋蝽AcHsp83a和AcHsp83b在UV-B脅迫下的表達(dá)量

蠋蝽AcHsp83a和AcHsp83b在UV-B脅迫下的表達(dá)有所差異(圖6),雄成蟲AcHsp83a在6 h時的表達(dá)量顯著高于對照(0 h)(P<0.05),雌成蟲AcHsp83a表達(dá)量在12 h時顯著低于對照(P<0.05);雌成蟲AcHsp83b在6 h時的表達(dá)量顯著高于對照(P<0.05),雄成蟲AcHsp83b在6和12 h時的表達(dá)量較對照均顯著降低(P<0.05)。

圖6 蠋蝽成蟲AcHsp83a (A)和AcHsp83b (B)在320 μW/cm2 UV-B脅迫下的相對表達(dá)量

3 討論

本研究基于轉(zhuǎn)錄組克隆得到蠋蝽AcHsp83a和AcHsp83b基因序列,其ORF分別長2 172和2 163 bp,分別編碼723和720個氨基酸。氨基酸序列分析結(jié)果顯示,AcHsp83a和AcHsp83b均具有5個家族簽名序列。在氨基酸序列C末端,AcHsp83a和AcHsp83b 存在EEVD結(jié)構(gòu),均存在細(xì)胞質(zhì),該結(jié)果與Csermely等 (1998)和Wang等(2019)研究結(jié)果一致。由系統(tǒng)發(fā)育樹可知,蠋蝽AcHsp83a和AcHsp83b與半翅目昆蟲Hsp83聚為一支(圖1), 證明Hsp90基因在進(jìn)化中具有保守性。這與赤擬谷盜TriboliumcastaneumHsp90研究結(jié)果(Knorr and Vilcinskas, 2011)相同。

Hsp90家族具有高度保守性,在昆蟲生長發(fā)育過程中具有重要作用,包括適應(yīng)環(huán)境脅迫、介導(dǎo)蛋白活性和參與胚后發(fā)育等多種生理過程(Knorr and Vilcinskas, 2011; King and MacRae, 2015; Zhangetal., 2016)。AcHsp83a和AcHsp83b在不同發(fā)育階段的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn),AcHsp83b在成蟲期的表達(dá)量顯著高于其他發(fā)育階段的,而AcHsp83a在卵期相對表達(dá)量達(dá)到最大值(圖2: A),這說明AcHsp90基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)具有差異。這與周呂等(2020)對草地貪夜蛾SfHsp90研究結(jié)果相一致。同時,AcHsp83a和AcHsp83b在蠋蝽若蟲期均有表達(dá)(圖2),這與黃野螟HeortiavitessoidesHsp90在幼蟲期表達(dá)結(jié)果 (Chengetal., 2018)一致。本研究發(fā)現(xiàn),AcHsp83a和AcHsp83b在蠋蝽成蟲不同組織中具有不同的表達(dá)模式,其中AcHsp83a在精巢中大量表達(dá)(圖3: A)。這與Xu等(2010)對赤擬谷盜Hsp83研究結(jié)果相同。

溫度是影響昆蟲生長發(fā)育的重要因素之一(Caoetal., 2018; Wangetal., 2020)。在本研究中,蠋蝽受到高溫和低溫脅迫時,AcHsp83a和AcHsp83b表達(dá)量均顯著變化,這說明昆蟲可通過調(diào)節(jié)Hsp90s的表達(dá)量以響應(yīng)溫度脅迫,從而幫助昆蟲適應(yīng)環(huán)境溫度的變化(楊靜等, 2017)。在本研究中,蠋蝽受到38 ℃高溫脅迫時,雌雄成蟲AcHsp83a和雌成蟲AcHsp83b的表達(dá)量先升高后下降,在6 h時的表達(dá)量最高(圖4),推測高溫脅迫可導(dǎo)致Hsp90s的累積,抵御高溫脅迫。這與玉米蛀莖夜蛾BusseolafuscaHsp83和近親真寬水蚤EurytemoraaffinisHsp90研究結(jié)果(Gkouvitsasetal., 2009; Rahlffetal., 2017)相一致。隨著溫度脅迫時間的延長,蠋蝽雌雄成蟲AcHsp83a和AcHsp83b的表達(dá)量在24 h時均顯著降低(圖4),可能是因為長時間的高溫脅迫對昆蟲造成的損傷超過AcHsp83a和AcHsp83b的保護(hù)限度,這與草地貪夜蛾、麥紅吸漿蟲SitodiplosismosellanaHsp90響應(yīng)高溫脅迫時的結(jié)果(Chengetal., 2016; 周呂等, 2020)相符。4 ℃脅迫下,在蠋蝽雌成蟲中AcHsp83a和AcHsp83b表達(dá)量出現(xiàn)先增加后降低的趨勢(圖5),表明Hsp83可能參與了蟲體抗寒調(diào)節(jié)過程。該結(jié)果與兩種沙棘木蠹蛾幼蟲Hsp90s的表達(dá)模式研究結(jié)果(Wangetal., 2019)一致。蠋蝽雄成蟲經(jīng)4 ℃處理后,AcHsp83a和AcHsp83b表達(dá)顯著下降(圖5)。這與二化螟盤絨繭蜂CotesiachilonisHsp70-3在低溫下的表達(dá)模式 (高鵬, 2020)相似。

昆蟲長期暴露在UV-B照射下,可以對其生長發(fā)育、繁殖、行動以及基因表達(dá)等方面造成影響(Isaharaetal., 1999; 杜一民等, 2014; Rechner and Poehling, 2014)。本研究發(fā)現(xiàn),UV-B脅迫下,蠋蝽雌雄成蟲AcHsp83a和雌成蟲AcHsp83b表達(dá)量先升高后下降,在6 h時表達(dá)量最高(圖6),表明Hsp83參與了蠋蝽對UV-B脅迫的響應(yīng),這與煙蚜在不同時間UV-B暴露下Hsp70的表達(dá)結(jié)果(蘇麗等, 2018)相似。在UV-B處理12 h時,雌雄成蟲AcHsp83a和雌成蟲AcHsp83b表達(dá)量顯著下降(圖6),可能是UV-B輻射造成的損傷超過了Hsp83的保護(hù)限度,該結(jié)果與輪蟲Brachionussp. Hsp基因研究結(jié)果(Kimetal., 2011)相似。本研究中,蠋蝽AcHsp83a和AcHsp83b雖然同屬于Hsp90家族,但在蠋蝽不同發(fā)育階段及不同組織中的表達(dá)模式不同,對環(huán)境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)也有所不同,這可能與其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域差異有關(guān),有待于下一步深入研究(Biebe and Buchner, 2019)。此外,在昆蟲應(yīng)對環(huán)境脅迫時,并非體內(nèi)某一熱激蛋白起作用,而是由不同的家族蛋白協(xié)同作用,小分子熱激蛋白作為昆蟲抵御外界脅迫的第一道防線(李慧等, 2018),如何與Hsp90家族協(xié)作抵御脅迫還需更深入的研究。

蠋蝽是一種捕食范圍廣、適應(yīng)能力強、繁殖快的優(yōu)勢天敵昆蟲,對農(nóng)業(yè)害蟲綠色防控具有重要意義。由于近年來氣候變暖和臭氧層空洞,蠋蝽野外生存環(huán)境惡劣,影響蠋蝽的田間活動。本研究檢測了蠋蝽AcHsp83a和AcHsp83b在高溫、低溫和UV-B脅迫下的表達(dá)量,揭示了其響應(yīng)溫度和UV-B脅迫的分子機制,為進(jìn)一步完善蠋蝽的田間應(yīng)用提供參考。