郭迎澳, 陳 斌

(重慶師范大學昆蟲與分子生物學研究所, 媒介昆蟲重慶市重點實驗室, 重慶 401331)

中華按蚊Anophelessinensis隸屬于雙翅目(Diptera)蚊科(Culicidae)按蚊屬Anopheles,是中國和及東南亞國家瘧疾、絲蟲病和乙型腦炎的主要傳播媒介之一,造成嚴重的公共衛(wèi)生問題(Maetal., 2011)。

細胞色素P450單加氧酶(cytochrome P450 monooxygenases, CYPs)是一類含有血紅素結構的超基因家族的末端氧化酶。一般來說,CYPs有5個保守的結構域,包括螺旋C(WxxxR)、螺旋I(GxE/DTT/S)、螺旋K(ExxR)、PERF區(qū)(PxxFxPE/DRE)和血紅素結合區(qū)(PFxxGxxxCxG)(Rupasingheetal., 2006; Aietal., 2011; Feyereisen, 2012)。CYPs幾乎存在于所有的生物體中,包括一些病毒(Griffithsetal., 2016; Omura and Gotoh, 2017),在單加氧酶系統(tǒng)中作為末端氧化酶,可以催化一分子氧原子轉移到底物上,同時將另一分子氧原子還原成水(Feyereisen, 2012),能夠催化至少60多種化學反應,參與多種內(nèi)源性化合物(如激素、信息素和脂類等)的合成代謝和外源性化合物(藥物、農(nóng)藥、天然產(chǎn)物等)的代謝解毒(Scott and Wen, 2001; Feyereisen, 2012; Nelson, 2018; Blomquistetal., 2021; Luetal., 2021),包括在作物害蟲和病媒害蟲中解毒殺蟲劑導致其產(chǎn)生抗性(Dermauwetal., 2020; Vontasetal., 2020)。先前研究發(fā)現(xiàn),細胞色素P450基因在昆蟲不同發(fā)育階段的表達具有特異性(Chungetal., 2009; Feyereisen, 2012),細胞色素P450基因經(jīng)常參與腸道和馬氏管對外源性物質的響應(Snyderetal., 1995; Chenetal., 2019; Li SYetal., 2021; Li Xetal., 2021),它們能夠降解內(nèi)源和外源化合物,保護細胞免受氧化和殺蟲劑的損傷(Hakimetal., 2010)。但目前關于中華按蚊細胞色素P450基因在不同發(fā)育階段、不同組織及吸血前后不同時期的表達情況還不清楚。

實驗室前期研究鑒定出中華按蚊112個細胞色素P450基因,其中有110個基因是有完整開放閱讀框的功能基因,這112個基因都包含有細胞色素P450結構域,被分為4個主要家族(線粒體、CYP2、CYP3和CYP4家族),18個家族和50個亞家族(Yanetal., 2018)。67個基因組成9個基因簇,同一簇內(nèi)、同一基因家族內(nèi)的基因具有相似的基因結構(Yanetal., 2018)。大多數(shù)細胞色素P450氨基酸序列包含5個完整且保守的基序:C螺旋、I螺旋、K螺旋、PERF和血紅素結合區(qū),但CYP329A1,CYP6P6和CYP9L2分別缺乏C螺旋、K螺旋和PERF基序(Yanetal., 2018)。

本研究以中華按蚊細胞色素P450超家族基因為研究對象,通過轉錄組測序和表達量分析其在中華按蚊不同發(fā)育階段、成蚊不同組織以及吸血前后不同時期雌成蚊中的表達模式,初步篩選可能在中華按蚊生長發(fā)育和生理生化機制中發(fā)揮作用的細胞色素P450基因,這對于進一步探討其表達調控和在殺蟲劑代謝機制方面的研究奠定了前期基礎。

1 材料與方法

1.1 供試蚊蟲

中華按蚊WX-LS采自江蘇無錫(31°59′N, 120°29′E),在室內(nèi)27 ℃、相對濕度75%±5%、晝夜交替12 h條件下飼養(yǎng),每天給幼蟲換兩次清水和魚苗食物,待其化蛹后,將蛹放入紗網(wǎng)封口的大紙筒中待其羽化,用10%葡萄糖溶液飼養(yǎng)成蟲;羽化3 d后,雌蚊吸食小白鼠的血液促使卵巢發(fā)育產(chǎn)卵,繁育后代。根據(jù)國家標準的蚊蟲抗藥性檢測方法,實驗室WX-LS為溴氰菊酯敏感品系(趙彤言等, 2012)。

1.2 轉錄組測序

收集WX-LS不同發(fā)育階段(卵、1-4齡幼蟲、雄蛹、雌蛹、雄成蚊和雌成蚊)、成蚊組織(觸角、唾液腺、中腸、馬氏管、精巢、卵巢、表皮和脂肪體)以及吸血前(對照)和吸血后1, 3, 6, 12, 24和48 h時雌成蚊,每個樣品3個生物學重復,儲存在RNAlater (Qiagen)中,由北京華大基因研究中心采用Illumina HiSeqTM2000進行轉錄組測序(GenBank登錄號: SRR851144),重慶師范大學昆蟲與分子生物學研究所組裝和注釋(Chenetal., 2014; Zhangetal., 2021)。由于測序量和基因長度會影響原始讀段數(shù)在樣本間差異基因的比較,為了保證后續(xù)分析的準確性,通過校正測序深度和基因長度,歸一化后得到基因的FPKM(fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)值進行后續(xù)分析。測序獲得的讀段使用TopHat映射到中華按蚊基因組上,并使用Cufflink根據(jù)FPKM值來確定基因表達量。

1.3 中華按蚊細胞色素P450基因的表達量分析

基于1.2節(jié)測序得到的中華按蚊轉錄組數(shù)據(jù),分析細胞色素P450基因在不同發(fā)育階段、成蚊不同組織和吸血后雌成蚊中的表達量。首先,將基因表達量取每樣本3個生物學重復FPKM值的平均值,將平均值換算成Log2(均值+1),換算后的log2(FPKM+1)作為衡量細胞色素P450基因表達量的數(shù)據(jù);采用層次聚類算法分析中華按蚊在不同發(fā)育階段、成蚊不同組織和雌成蚊吸血后的基因表達量(Lietal., 2017),將結果在TBtools軟件中用heatmap進行數(shù)據(jù)可視化(Chenetal., 2020)。

2 結果

2.1 細胞色素P450家族基因在不同發(fā)育階段的表達模式

根據(jù)中華按蚊轉錄組數(shù)據(jù),整個細胞色素P450家族基因聚類成兩個分支,其中一個分支大部分基因在幼蟲期高表達,CYP4H18,CYP4G16,CYP6AA1,CYP6AG1,CYP6AG2,CYP6AH1,CYP6Y1,CYP6Y2,CYP6Z3,CYP9J4,CYP9J3,CYP9J7,CYP9M1,CYP12F3和CYP12F4在整個幼蟲和成蚊期均表達量較高,其中CYP4G16和CYP6Y2在中華按蚊所有發(fā)育階段均高表達;另一個分支的基因在大多數(shù)供試樣本中表達量較低(圖1)。在幼蟲、蛹和成蚊期,分別有40, 26和35個基因表達量較高,其中CYP6AG1,CYP6AG2,CYP6AH1,CYP6Z3,CYP6Y2,CYP6P4,CYP9J3和CYP9J4在整個幼蟲期高表達,CYP4G16,CYP4G17,CYP4J5,CYP6Y2,CYP49A1,CYP301A1,CYP303A1,CYP304B1和CYP325E1在蛹期表達量很高,CYP4G16,CYP4J5,CYP6AA1,CYP6AG1,CYP6AG2,CYP6AH1,CYP6Y1,CYP6Y2,CYP6Z3,CYP9M1,CYP9J3,CYP9J4,CYP12F1,CYP12F3和CYP12F4在成蚊期表達量很高。1-4齡幼蟲中細胞色素P450家族基因的表達模式相似,雌蛹和雄蛹中細胞色素P450家族基因的表達模式相似,雌雄成蚊中細胞色素P450家族基因的表達模式相似(圖1),各發(fā)育階段之間細胞色素P450家族基因的表達模式是有差別的,可以看出細胞色素P450基因在不同發(fā)育階段是具有特異性的。

圖1 中華按蚊細胞色素P450基因在實驗室溴氰菊酯敏感品系(WX-LS)不同發(fā)育階段的表達譜

2.2 細胞色素P450家族基因在成蚊不同組織中的表達模式

結果表明,基因組織表達譜聚類為兩個分支,其中一個分支25個基因表達水平較高,特別在表皮、脂肪體和精巢中表達較高(圖2),其中CYP4G16,CYP6AG2,CYP6AH1,CYP6Y1,CYP9J3和CYP9J4在所有組織中均表達較高。另外一個分支基因表達量相對較低,其中CYP6M4在中腸和馬氏管中表達量最高,CYP6Z1在馬氏管和觸角中高表達。CYP6Z3,CYP6M3,CYP6Z1,CYP9K1,CYP9J6和CYP9J7均在馬氏管中高表達;CYP4H24,CYP6AG1,CYP6AG2和CYP6Y2均在中腸中高表達;CYP6AA1,CYP6AH1,CYP6M4,CYP9J3,CYP9J4和CYP12F3在中腸和馬氏管中高表達;CYP4G16,CYP4G17,CYP4J5,CYP6Y1和CYP6Y2在表皮、脂肪體以及精巢中高表達;CYP6M2,CYP6P3V1,CYP6P3V2,CYP6P5,CYP9J5,CYP325F2,CYP325F3,CYP325G1,CYP325H1,CYP325J1和CYP325K1在觸角中表現(xiàn)出高表達,而在其他組織中低表達。根據(jù)圖2顯示,細胞色素P450基因在表皮和脂肪體表達模式相似,其他組織之間表達模式有差別,表達模式具有組織特異性。

圖2 中華按蚊細胞色素P450基因在實驗室溴氰菊酯敏感品系(WX-LS)成蚊不同組織中的表達譜

2.3 細胞色素P450家族基因在雌成蚊吸血后的表達模式

結果顯示,細胞色素P450基因表達譜聚類為兩個分支,其中一個分支的基因在吸血后1, 3, 6, 12, 24和48 h時表達量較高,大多數(shù)基因在吸血后1, 3, 6, 12, 24和48 h時表達量與吸血前的對照近似,CYP4G16,CYP6AA1,CYP6AG2,CYP6AH1,CYP6Y1,CYP6Y2,CYP9K1,CYP12F3和CYP304B1在中華按蚊吸血后1, 3, 6, 12, 24和48 h時均高表達;CYP304B1和CYP329A1在吸血后表達量與對照比有所提高。另一個分支的基因在吸血后1, 3, 6, 12, 24和48 h時表達量較低,CYP4C26在中華按蚊吸血后12和24 h時表達量與對照比有所提高,但在吸血后其他時點的表達量與對照比均較低(圖3);CYP6AH2和CYP9M2在吸血后6, 12, 24 h時表達量與對照比有所提高,CYP6S1在吸血后12, 24, 48 h時表達量較高;CYP307A1在吸血后6, 12 h時表達量較高,CYP6M2,CYP6P5,CYP306A1在吸血后48 h時表達量較高,整體來看,吸血前后不同時間的表達模式相似。

圖3 中華按蚊細胞色素P450基因在實驗室溴氰菊酯敏感品系(WX-LS)吸血雌成蚊中的表達譜

3 討論

中華按蚊細胞色素P450家族基因的表達模式分析表明其具有發(fā)育階段特異性和組織特異性。先前研究發(fā)現(xiàn),細胞色素P450基因在昆蟲不同發(fā)育階段的表達具有特異性,這可能與不同基因行使的功能不同有關(Chungetal., 2009; Feyereisen, 2012)。中華按蚊CYP4G16,CYP6Y2,CYP301A1和CYP304B1在卵期表達量較高(圖1),表明這些基因可能在其胚胎發(fā)育過程中起作用。在幼蟲、蛹和成蟲期,分別有40, 26和35個基因具有較高表達量。中華按蚊CYP6AG1,CYP6AG2,CYP6AH1,CYP6Z3,CYP6Y2,CYP6P4,CYP9J3和CYP9J4在整個幼蟲期高表達,這表明這些基因可能與中華按蚊的生長發(fā)育過程有關。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),棉鈴蟲Helicoverpaarmigera的CYP6B2在幼蟲期的表達量顯著高于在其他發(fā)育階段的(Ranasingheetal., 1997);小菜蛾Plutellaxylostella的諸多細胞色素P450基因,如CYP340W1v2等在幼蟲期的表達量較高(Yuetal., 2015)。幼蟲期是主要的進食時期,由于食源性有毒化合物可能會被吸收,因此幼蟲中各種細胞色素P450基因的大量表達可能參與了對這些化學物質的解毒(Yuetal., 2015)。中華按蚊CYP4G16,CYP4G17,CYP4J5,CYP6Y2,CYP49A1,CYP301A1,CYP303A1,CYP304B1和CYP325E1在蛹期表達量很高,表明這些細胞色素P450基因可能參與了復雜的羽化過程。有研究表明,小菜蛾的CYP338C1等在卵和蛹期的表達量顯著高于在其他發(fā)育階段的(Yuetal., 2015)。中華按蚊CYP4G16,CYP4J5,CYP6AA1,CYP6AG1,CYP6AG2,CYP6AH1,CYP6Y1,CYP6Y2,CYP6Z3,CYP9M1,CYP9J3,CYP9J4,CYP12F1,CYP12F3和CYP12F4在成蟲期表達量很高,岡比亞按蚊A.gambiaeCYP6D1在成蟲期的表達量也顯著高于其他發(fā)育階段的(Nikouetal., 2003);華山松大小蠹DendroctonusarmandiCYP4G56僅在成蟲期高表達,在其他發(fā)育階段表達量則很低(Daietal., 2014)。這些基因在不同發(fā)育階段表達情況不同,暗示這些細胞色素CYP450基因可能在發(fā)育過程中發(fā)揮作用,特別是在特定的生命階段(Laoetal., 2015)。

中腸是抵御食物中存在的有毒異生物的第一道防線(Scott, 2008),因此在腸道中高度表達的細胞色素P450基因可能參與了毒素代謝。有研究表明,細胞色素P450基因經(jīng)常參與腸道對外源性物質的反應(Li SYetal., 2021; Li Xetal., 2021),它們的過量表達可以增強害蟲對殺蟲劑的解毒作用(Jingetal., 2020)。中華按蚊細胞色素P450家族基因在成蚊不同組織的表達譜分析顯示(圖2),CYP4H24,CYP6AG1,CYP6AG2和CYP6Y2均在中腸中高表達。除中腸外,細胞色素P450基因也在主要的排泄器官馬氏管中表達(Snyderetal., 1995; Chenetal., 2019)。本研究中,中華按蚊CYP6Z3,CYP6M3,CYP6Z1,CYP9K1,CYP9J6和CYP9J7均在馬氏管中表達量較高(圖2)。除了以上的細胞色素P450基因以外,中華按蚊CYP6AA1,CYP6AH1,CYP6M4,CYP9J3,CYP9J4和CYP12F3在中腸和馬氏管中均高表達。昆蟲的中腸是主要的消化道和最大的代謝組織,馬氏管是主要的排泄器官,它們都具有降解內(nèi)源和外源化合物的作用,可以保護細胞免受氧化和殺蟲劑的損傷(Hakimetal., 2010),表明中華按蚊的這些細胞色素P450基因在解毒過程中發(fā)揮了重要作用。昆蟲的唾液腺產(chǎn)生富含酶的液體,在消化過程中發(fā)揮作用(Cantón and Bonning, 2020)。本研究中,中華按蚊CYP6AH1,CYP6Y1,CYP9J4和CYP12F3在唾液腺中表達量較高。在長紅錐蝽Rhodniusprolixus中,RproCYP4M1在唾液腺中高度表達(Paimetal., 2022);黃粉蟲Tenebriomolitor中TmCYP345C4,TmCYP307A1,TmCYP4BN60和其他幾個基因在唾液腺中高度或特異性表達(Wangetal., 2022)。表明這些基因可能在消化和解毒方面發(fā)揮作用。由于細胞色素P450基因在生殖組織中的大量存在,它們被認為與昆蟲的繁殖有關(Wen and Scot, 2001)。在中華按蚊的卵巢中CYP9J3,CYP9J4和CYP307A1等表達量較高,精巢中CYP4G16,CYP6Y1和CYP6Y2等高表達,暗示這些基因可能與其繁殖方面有關。

吸血后不同時期的表達譜顯示中華按蚊CYP304B1和CYP329A1在吸血后幾個時間點表達量較吸血前增加(圖3),表明這些基因可能與血液的消化和吸收有關。CYP4G16,CYP6AA1,CYP6AG2,CYP6AH1,CYP6Y1,CYP6Y2,CYP9K1,CYP12F3和CYP304B1在中華按蚊吸血后各個時間點均高表達,可能是因為整蟲取樣測序,不能清楚地了解到細胞色素P450基因在吸血后不同組織的具體表達情況。