岳 郁，黃 平，陳 虎，于春亮，彭建營,

（1.河北農業(yè)大學園藝學院，河北省梨工程技術研究中心，河北 保定 071000；2.河北農業(yè)大學食品科技學院，河北 保定 071000；3.威縣農業(yè)農村局，河北 邢臺 054700）

梨果實酥脆多汁、營養(yǎng)豐富，同時還具有減緩咳嗽、抗炎等作用，受到眾多消費者的喜愛，為提升梨的果實品質，滿足不同人群對梨果品的要求，研究者開始不斷培育品質更佳的梨新品種[1]?！衤断恪媸且浴畮鞝柪障憷妗癁槟副尽ⅰ┗ɡ妗癁楦副倦s交育成的優(yōu)質中熟品種，其果個大，果形端正，果面光潔，具有皮薄、肉細、酥脆多汁、可食率高、含糖量高等諸多優(yōu)點?！率兰o’梨是以‘長十郎’梨為母本、‘二十世紀’梨為父本培育的優(yōu)良中早熟品種[2]，其果實呈蘋果狀，皮薄、肉質細脆、味甜，汁較多，有香氣，且無明顯石細胞。因此將兩者選作為父母本進行雜交，旨在選育出比親本品種表現更好的新品種。

近年來，一些學者對梨雜交F1代重要農藝性狀相關遺傳規(guī)律進行了深入研究。董秀娟等[3]研究了‘鄂梨2號’與‘華梨2號’雜交后代單果質量、果實硬度和果梗粗度等12 個果實品質性狀遺傳的影響。白冰等[4]以‘碭山酥梨’與‘豐水梨’及其正、反交后代群體為研究對象，連續(xù)2 a對親本及其后代果實的單果質量、橫縱徑、果形指數、可溶性固形物含量的遺傳規(guī)律進行研究。趙亞楠等[5]以‘蘋果梨’與‘八月紅’及其210 株F1雜交后代為材料，對其果實大小、果形指數等6 個性狀的遺傳傾向進行調查和研究。隨著對梨雜交F1代不斷深入研究，香氣也成為梨內在品質的評價指標之一。果實香氣是不同氣味的揮發(fā)性化合物的總稱，既可以提供直觀感受，又對內在風味有重要影響[6]。研究人員已經對蘋果[7]、葡萄[8]、柑橘[9]的香氣進行分析，而對梨果實香氣的研究較少[10]。目前，已有研究表明梨果實中已鑒定出300多種揮發(fā)性物質，包括酯類、醇類、醛類、烯烴類、酮類等，果實中香氣成分的種類、含量的多少直接決定著果實的香味[11]。劉婉君等[12]研究了18 個梨品種授粉對鴨梨果實香氣成分的影響，結果表明不同的品種授粉可以顯著改善鴨梨果實的香味。向思敏等[13]研究表明雜交后代新梨7號果實中揮發(fā)性物質的種類與父本早酥梨和母本庫爾勒香梨相比有所減少，其主要揮發(fā)性物質與親本相似，揮發(fā)性物質的總含量高于父本，但低于母本。

在有關梨種質資源評價的報道中，對香氣指標的研究僅通過嗅覺方式辨別香氣的有無，而利用適當的方法檢測和鑒定香氣成分，將其作為一項內在品質指標進行分析評價的報道較少，因此，本研究選取7 個梨雜交F1代以及母本‘玉露香’和‘秋月’的成熟果實為試材，對其單果質量、果實橫縱徑、可溶性固形物和香氣物質等指標進行測定。分析比較梨雜交F1代與母本‘玉露香’及‘秋月’之間的經濟性狀和香氣成分差異性，旨在為‘玉露香’和‘新世紀’梨雜交F1代品質性狀評價以及梨香氣育種的親本選擇提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料為2022年8月5日采集的7 個梨雜交F1代（7-93、8-44、8-176、9-188、9-193、10-101、10-173）及‘玉露香’（YLX）和‘秋月’（QY）的成熟果實，供試梨園位于河北邢臺威縣香花營梨博園基地，管理正常。每個品種（株系）取5 個完整、生長正常、大小均一的果實，每種梨果實混合后分為3 個生物學重復，每次重復包括5 個果實。采集后運輸至冷庫保存，用于后續(xù)各項指標的測定。

C5～C25正構烷烴（色譜純）、3-壬酮（分析純）、氯化鈉（分析純）國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

7890B-7000C氣相色譜-質譜聯(lián)用儀、HP-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）美國Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 果實品質性狀測定

果實品質的測定主要參考《梨種質資源描述規(guī)范和數據標準》，對參試品種（株系）果實的單果質量、果實的橫徑縱徑、果形指數、果實硬度、可溶性固形物含量、可溶性糖含量、可滴定酸含量、VC含量等品質性狀指標進行測定。

1.3.2 揮發(fā)性香氣提取

樣品前處理：待測樣品采用四分法去除果核和果心后，用液氮研磨成精細粉狀，取1 g粉末、1 mL NaCl飽和溶液和10 μL 3-壬酮（0.04 mg/mL）于20 mL的樣品瓶內，加入轉子，用橡膠隔片（由聚四氟乙烯丁基合成）密封，待進樣分析。

頂空進樣條件：40 ℃水浴條件下預熱10 min，再將DVB/CAR/PDMS萃取頭插入到頂空瓶口的液體上方，于40 ℃磁力攪拌器上萃取吸附40 min，轉速800 r/min，取出萃取頭后立即插入到氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀進樣口中，解吸溫度240 ℃，解吸時間8 min，隨后進行GC-MS分析。

1.3.3 GC-MS分析條件

GC條件：進樣口溫度240 ℃；載氣為高純He（純度≥99.999%），流速1.0 mL/min；升溫程序：初始溫度45 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升至65 ℃保持1 min，以1 ℃/min升至80 ℃，保持1 min，以15 ℃/min升至250 ℃，保持2 min，運行時間為35 min；不分流進樣。

MS條件：采用全掃描模式采集信號；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；質量掃描范圍m/z30～350，忽略溶劑延遲。

1.3.4 揮發(fā)性物質的定性定量分析

定性方法：通過對未知化合物GC-MS總離子流色譜圖與美國國家標準技術研究所質譜庫中的化合物進行比對，僅保留匹配度≥80%的化合物，并結合保留指數（retention index，RI）進行對比定性。

定量方法：采用內標法對樣品中揮發(fā)性成分進行定量分析，其中3-壬酮作為內標；將3-壬酮單標配制成內標溶液加入到樣品中。各組分含量按式（1）計算：

1.3.5 香氣活性值（odor activity values，OAV）計算

OAV是指香氣成分濃度與該香氣閾值濃度之比，表示該香氣成分對香氣整體的貢獻度，當OAV≥1時，表明該香氣物質是樣品的關鍵香氣化合物。香氣閾值是指人們對某種香氣物質能感覺到的最小濃度，查閱文獻得到香氣物質閾值，再根據物質含量計算各香氣物質的OAV，按式（2）計算：

1.4 數據統(tǒng)計分析

利用Excel 2020軟件對實驗數據進行統(tǒng)計；利用Origin 2020軟件對實驗數據進行作圖；利用Simca14.1軟件進行差異性分析；采用SPSS 26.0數據分析軟件進行顯著性分析、相關性分析和主成分分析（principal component analysis，PCA）。

在PCA前為了消除量綱的影響，需要對所測得的數據進行標準化處理。本實驗采用隸屬函數法將數據規(guī)范至[0，1]。對每個果實品質指標的衡量標準都有所差異，對于梨果實外觀品質，一般認為單果質量、果形指數越大越好；對于梨果實內在品質，認為可溶性固形物含量、果實硬度、VC含量、可溶性糖含量、糖酸比和揮發(fā)物含量越大越好，而可滴定酸含量越小越好。因此將9 項指標進行分類，分為正向指標（單果質量、果形指數、可溶性固形物含量、果實硬度、VC含量、可溶性糖含量、糖酸比和揮發(fā)物含量）和負向指標（可滴定酸含量）。其中正向指標需要正向化處理，按式（3）進行計算，負向指標進行逆向化處理，按式（4）進行計算：

2 結果與分析

2.1 ‘玉露香’與‘新世紀’梨雜交F1代果實品質分析

如表1所示，各項品質指標在雜交F1代果實中均表現出顯著差異（P＜0.05）。平均單果質量范圍分布在156.81～291.09 g之間，屬于中大果；8-44、10-101、10-173果形指數顯著高于其他品種（株系），更趨向圓錐形和橢圓形，其他品種（株系）則偏向圓形和近圓形；雜交F1代果實硬度均低于‘秋月’和‘玉露香’果實，果實質地相對比較疏松；8-44可溶性固形物最高，成熟度和風味較好，剩余株系均達到采摘標準，并全都大于‘秋月’的可溶性固形物；可溶性糖含量分布在8.39%～11.45%之間，8-44比‘秋月’甜度更大，風味更濃；可滴定酸含量分布在0.05%～0.22%之間，除10-173外剩余株系均比母本‘玉露香’酸度低，屬于低酸類型果肉；VC含量分布在2.37～4.69 mg/100 g之間，其中‘秋月’營養(yǎng)價值較高，8-44和9-193含量大于其母本。

表1 7 個梨雜交F1代以及‘玉露香’和‘秋月’果實的品質性狀Table 1 Quality characteristics of seven pear F1 hybrids,‘Yuluxiang’ and ‘Akizuki’

2.2 ‘玉露香’與‘新世紀’梨雜交F1代揮發(fā)性成分的GC-MS分析

通過GC-MS鑒定出的7 個梨雜交F1代以及‘玉露香’和‘秋月’成熟果實的揮發(fā)性化合物如表2所示。7 個雜交F1代中共檢測出74 種揮發(fā)性成分，包括醇類11 種、酯類21 種、萜烯8 種、醛類7 種、酮類7 種、呋喃2 種和其他化合物18 種；‘玉露香’和‘秋月’中共含有34 種揮發(fā)性成分，包括醇類6 種、酯類5 種、醛類2 種、萜烯3 種、醛類6 種、酮類3 種、呋喃1 種和其他化合物8 種。從總揮發(fā)物含量上看，由大到小依次為10-173＞8-44＞QY＞7-93＞9-188＞9-193＞10-101＞YLX＞8-176；從揮發(fā)物個數上看，由多到少依次為10-173＞10-101＞8-176＞7-93＞9-188＞9-193＞8-44＞YLX＞QY。結果表明，梨的揮發(fā)性成分中酯類的種類最多，其次為醇類和醛類；醛類的含量最高，其次是醇類和酯類，三者總含量占到梨中所測得揮發(fā)性成分總量的90%以上，由此可知梨中主要揮發(fā)性成分為醇類、酯類和醛類化合物。

表2 7 個梨雜交F1代以及‘玉露香’和‘秋月’揮發(fā)性成分的比較分析Table 2 Comparative analysis of volatile components of seven pear F1 hybrids,‘ Yuluxiang’ and ‘Akizuki’fruits

7 個梨雜交F1代以及‘玉露香’和‘秋月’的成熟果實揮發(fā)物類別的數量與比例如表3所示?！镌隆拇碱愇镔|占比最高，其中正己醇在醇類物質中含量最高；10-101的酯類物質、呋喃類物質中和酮類物質占比最高，其中乙酸乙酯、乙酸己酯、丁酸乙酯在醛類物質中含量最高，2-乙基呋喃在呋喃類物質中含量最高；8-176的萜烯類物質占比最高，其中6,6-二甲基富烯在萜烯類中含量最高；9-188的醛類物質占比最高，己醛和反-2-己烯醛在醛類物質中含量最高。

表3 7 個梨雜交F1代以及‘玉露香’和‘秋月’揮發(fā)物類別的數量與比例Table 3 Number and proportion of aroma categories in seven pear F1 hybrids,‘Yuluxiang’ and ‘Akizuki’

2.3 ‘玉露香’與‘新世紀’梨雜交F1代揮發(fā)性成分的差異性分析

2.3.1 正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）

如圖1所示，10-101在PC1維度與其他株系有顯著差異；10-173在PC2維度與其他株系有顯著差異；8-44、7-93、9-193和9-188之間差異不顯著，但在PC2維度與8-176有顯著差異；母本‘玉露香’、‘秋月’以及8-176均在第4象限，差異不顯著，但是均顯著區(qū)別于其他雜交后代。結果表明：梨雜交后代中10-101和10-173的揮發(fā)物組成與母本具有較大差異，8-176的揮發(fā)性組成與母本差異最小，而‘玉露香’和‘秋月’之間的揮發(fā)物組成相似。

圖1 7 個梨雜交F1代、‘玉露香’和‘秋月’果實揮發(fā)性成分的OPLS-DAFig.1 OPLS-DA plot of volatile components in seven pear F1 hybrids,‘Yuluxiang’ and ‘Akizuki’

2.3.2 雙標載荷圖（Biplot）分析

由圖2可知，‘秋月’與V37和V55呈顯著正相關，V37為酯類化合物，具有豐富的水果香味[14]，V55是杧果香氣的主要成分，有典型的杧果香味[15]；‘玉露香’與V57和V66呈顯著正相關，V57具有茶香和草本植物的氣味[16-17]，V66表現出玫瑰花香和茶香的氣味[18-19]；10-101與V16和V17呈顯著正相關，V16為水果味[20-21]，V17為怡人的果香[22]；10-173與V29、V41、V50呈顯著正相關，V29具有獨特的果香味和玫瑰花香[23-24]，V41具有烏龍茶的香味[25]，V50是新鮮水果的主要揮發(fā)物成分，具有典型的葡萄漿果的香味[26-27]；其中V29和V41是紅香酥梨的特征香氣成分[28]。

圖2 7個梨雜交F1代以及‘玉露香’和‘秋月’果實揮發(fā)性成分Biplot分析Fig.2 Biplot analysis of volatile components in seven pear F1 hybrids,‘Yuluxiang’ and ‘Akizuki’

2.3.3 VIP分析

通過OPLS-DA可看出不同單株（品種）間揮發(fā)性成分差異顯著，為進一步篩選產生差異影響的重要揮發(fā)性物質，以VIP值大于1為指標，最終預測出造成‘玉露香’、‘秋月’與7 個梨雜交F1代差異的42 個香氣標記物（見圖3，并在表2中標*）。其中，V5為8-44獨有，具有杏味[29]；V7、V8、V9、V33、V72為9-193獨有，具有醇酸類氣味和典型的梨果味[30]；V23為7-93獨有，具有乙酸酯類化合物的酯香味[31]；V6、V46、V51、V64、V67、V82為8-176獨有，具有諸多香氣類別的復雜氣味，各香氣間相輔相成，如呋喃的茶香味[32]等；V15、V38、V49、V66為‘玉露香’獨有，具有茶的清香和花香[33]。

圖3 7 個梨雜交F1代以及‘玉露香’和‘秋月’果實揮發(fā)性成分VIP分析Fig.3 VIP analysis of volatile components in seven pear F1 hybrids,‘Yuluxiang’ and ‘Akizuki’

2.3.4 揮發(fā)性成分的OAV分析

為進一步分析揮發(fā)性化合物對梨整體香氣的貢獻，將VIP分析所得造成差異的42 個香氣標記物進行OAV分析，結合已有文獻報道的香氣閾值進行計算，部分物質因其未知的閾值無法獲得，未能計算其OAV，最終找到13 個香氣物質，結果如表4所示。正己醇是‘秋月’和8-44的關鍵香氣物質；丁酸乙酯是‘玉露香’、7-93、8-44、9-188、9-193和10-173的關鍵香氣物質；癸醛是‘玉露香’的關鍵香氣物質；(E,E)-2,4-己二烯醛是‘秋月’和9-193的關鍵香氣物質；β-大馬烯酮是7-93和9-193的關鍵香氣物質；2-戊基呋喃是8-176的關鍵香氣物質。

表4 7 個雜交F1代以及‘玉露香’和‘秋月’果實揮發(fā)性成分的OAV分析Table 4 OAV analysis of volatile components in seven F1 hybrids,‘Yuluxiang’ and ‘Akizuki’

2.4 ‘玉露香’與‘新世紀’梨雜交F1代果實品質性狀與特征香氣相關性分析

利用SPSS統(tǒng)計分析軟件對‘玉露香’和‘新世紀’雜交F1代品質性狀與OAV分析得到的13 個特征香氣進行相關性分析，結果見表5。其中，正己醇和VC含量呈顯著正相關，相關系數為0.669；乙酸丁酯和VC含量呈顯著負相關，相關系數為-0.762；2-甲基丁酸乙酯和可溶性固形物含量呈顯著正相關，相關系數為0.679；2-戊基呋喃和糖酸比呈顯著正相關，相關系數為0.756。

表5 7 個梨雜交F1代以及‘玉露香’和‘秋月’果實品質性狀與特征成分間的相關性分析Table 5 Correlation analysis between fruit quality traits and characteristic components of seven pear F1 hybrids,‘Yuluxiang’ and ‘Akizuki’

2.5 ‘玉露香’與‘新世紀’梨雜交F1代果實內外品質及揮發(fā)性成分綜合評價

采用SPSS對7 個梨雜交F1代以及‘玉露香’和‘秋月’成熟果實的單果質量、果形指數、果實硬度、可溶性固形物含量、可溶性糖含量、可滴定酸含量、VC含量、糖酸比、揮發(fā)物含量9 個品質指標測定數據進行PCA（表6），其中有3 個PC特征值大于1，方差貢獻率分別為36.79%、22.78%、19.58%，累計貢獻率達79.15%，表明此3 個PC可作為7 個梨雜交F1代以及‘玉露香’和‘秋月’的成熟果實品質影響的綜合評價指標。

表6 PC的特征值、貢獻率及累計貢獻率Table 6 Eigenvalues,contribution rates and cumulative contribution rates of principal components

由表7可知，PC1貢獻率較大的為揮發(fā)物含量和果形指數；PC2中可溶性糖含量貢獻最大，其次為糖酸比和可滴定酸含量；PC3中以可溶性固形物含量和單果質量的影響為主；根據各成分的貢獻率，表明揮發(fā)物含量、果形指數、可溶性糖含量、糖酸比、可滴定酸含量、可溶性固形物含量、單果質量是影響雜交后代果實品質較大的指標。

表7 各品質指標的PC載荷矩陣Table 7 PC loading matrix of quality indexes

將標準化處理后的性狀指標數據帶入Y1、Y2、Y3這3 個PC得分數學函數式中，得到以下公式：

由此可以獲得7 個梨雜交F1代以及‘玉露香’和‘秋月’的成熟果實的3 個PC分數，綜合評價模型是以各主成分的方差貢獻率為權重進行構建，得出梨果實品質綜合評價模型：Y=0.01×（36.793Y1＋22.777Y2＋19.577Y3），計算出7 個雜交F1代株系、‘玉露香’和‘秋月’綜合得分和排名，8-44綜合評價最好，其次為10-173、10-101三者綜合排名均高于‘玉露香’與‘秋月’（表8）。

表8 7 個雜交F1代以及‘玉露香’和‘秋月’果實品質綜合評價Table 8 Comprehensive evaluation of fruit quality of seven F1 hybrids,‘Yuluxiang’ and ‘Akizuki’

3 討論

果實品質是影響果實經濟價值和競爭力最根本的原因，諸如果實外在表型、可溶性固形物含量、VC含量、揮發(fā)性物質含量等，這些特征與果實品質密切相關，其中果實風味是最能凸顯果實特色的品質，主要是通過人的嗅覺和味覺被感知，可以通過嗅覺感知到的風味物質又被稱為特征香氣。由于果實香氣物質成分復雜、含量低，選用合適的方法提取、檢測和鑒定香氣成分對果實香氣分析至關重要。本研究利用GC-MS方法，分析7 個梨雜交F1代以及‘玉露香’和‘秋月’成熟果實的香氣成分，旨在梨新品種選優(yōu)中增加香氣成分指標，為梨果實品質的綜合評價補充新的思路和方法，使評價更全面，更綜合。

結果表明，7 個梨雜交F1代在果實品質中表現出顯著差異，其中8-44的可溶性固形物含量和可溶性糖含量顯著高于母本，10-173可滴定酸含量也顯著高于母本。7 個梨雜交F1代以及‘玉露香’和‘秋月’的成熟果實中共含有83 種揮發(fā)性成分。對比各樣品揮發(fā)物含量，除8-176外其余株系均高于母本，其中10-173和8-44又高于其他株系；在揮發(fā)物總數中所有株系的揮發(fā)物總數均高于母本，10-173和10-101又高于其他株系。由此可看出，通過雜交育種，其后代的香氣成分含量更為豐富，風味也更突出。梨中主要揮發(fā)物成分為醇類、酯類和醛類化合物，與張軍[34]、李杰[35]、鄭璞帆[6]等的研究結果一致。OPLS-DA結果表明，梨雜交后代中10-101和10-173的揮發(fā)物組成與母本具有較大差異，8-176的揮發(fā)性組成與母本差異最小，‘玉露香’和‘秋月’之間的揮發(fā)物組成相似。VIP結果預測出‘玉露香’、‘秋月’與7 個梨雜交F1代產生差異的42 個香氣標記物，同時通過OAV鑒定出樣品各自特征氣味的關鍵香氣。10-101與10-173與母本造成差異的原因分別是10-101與乙酸乙酯和乙酸己酯呈顯著正相關，10-173與辛酸乙酯、α-法尼烯、反式-2-己烯醛呈顯著正相關，同時其含量顯著高于其他株系。不同梨果實因其自身的香氣物質組成而形成獨特的果實香味，這對于果實品質特色的構建具有重要意義。對‘玉露香’和‘新世紀’雜交F1代品質性狀與特征香氣進行相關性分析，找出兩者之間的聯(lián)系。對‘玉露香’與‘新世紀’梨雜交F1代果實內外品質及揮發(fā)性成分進行綜合評價，排名高于‘玉露香’和‘秋月’的單株為8-44、10-173、10-101，因此，加入香氣指標可為梨果實品質綜合評價提供思路，在原有基礎上選出風味更突出的果實，同時也可進一步找出不同單株香氣成分之間的差異，以及造成差異的關鍵特征香氣，進行綜合對比，為梨雜交后代育種提供新的思路。

4 結論

梨雜交F1代中8-44、10-101和10-173梨株系品質較佳，可作為候選品種進一步評價，不同梨株系的揮發(fā)性成分差異較大，其特征香氣也不同，品質性狀優(yōu)異的梨株系含有的揮發(fā)性成分也較為豐富。本研究結果也為梨雜交后代果實香氣遺傳規(guī)律研究、特征香氣鑒定提供參考依據。