徐 君 尹渝來(lái) 薛博文 周榮華 孫芳芳

（蘇州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇蘇州 215000）

芡實(shí)（EuryaleferoxSalish.）是一年生大型草本水生蔬菜，屬睡蓮科芡屬（趙有為，1999）。我國(guó)的芡實(shí)可分為兩大類：一類是刺芡，全身密生刺，不適合人工栽培，籽粒殼薄、粒小、粳性；另一類是蘇芡，除葉背外全身無(wú)刺，適于人工栽培，籽粒殼厚、粒大、糯性（鮑忠洲，2010）。為發(fā)揮不同類型芡實(shí)的優(yōu)勢(shì)，研究人員開(kāi)展了芡實(shí)的雜交育種工作（鮑忠洲 等，2010），通過(guò)系統(tǒng)選育獲得了優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)芡實(shí)新品種（尹渝來(lái) 等，2015）。為不斷優(yōu)化和創(chuàng)新芡實(shí)種質(zhì)資源，需對(duì)現(xiàn)有芡實(shí)材料的遺傳多樣性進(jìn)行進(jìn)一步的明確。

與形態(tài)學(xué)鑒定相比，分子標(biāo)記是一種快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的遺傳多樣性分析方法。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)芡實(shí)資源的分子標(biāo)記研究報(bào)道不多。國(guó)內(nèi)學(xué)者通過(guò)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）和相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）兩種分子標(biāo)記對(duì)芡實(shí)和王蓮的雜交后代進(jìn)行了分析研究（游永寧 等，2012），日本（Ayumi et al.，2011）和印度（Nitish et al.，2018）的學(xué)者分別采用簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）分子標(biāo)記對(duì)本國(guó)的芡實(shí)資源做了遺傳多樣性分析。SSR 分子標(biāo)記技術(shù)是以PCR為基礎(chǔ)的DNA 多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)，具有共顯性、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高和遺傳信息量大的特點(diǎn)，被國(guó)際植物新品種保護(hù)聯(lián)合會(huì)認(rèn)定為鑒定植物品種的重要工具（Bachmann et al.，1990；張海雯 等，2020），已經(jīng)成功應(yīng)用于馬鈴薯（安苗 等，2023）、蘿卜（王慶彪 等，2021）、青花菜（管俊嬌 等，2021）、甜瓜（李超 等，2022）、苦瓜（崔俊杰 等，2022）和荷花（杜鳳鳳 等，2016；劉藝平 等，2023）等作物。本研究對(duì)包括蘇芡和刺芡在內(nèi)的10 份芡實(shí)材料進(jìn)行SSR 擴(kuò)增，并對(duì)芡實(shí)籽粒品質(zhì)性狀進(jìn)行了檢測(cè)和分析，以期明確國(guó)內(nèi)芡實(shí)種質(zhì)資源間的遺傳距離，為芡實(shí)育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試10 份芡實(shí)材料取自蘇州市水生蔬菜資源保存圃，包括有刺芡實(shí)2 份和無(wú)刺芡實(shí)8 份，無(wú)刺芡實(shí)中包括4 份地方栽培種和4 份雜交中間材料，具體信息見(jiàn)表1。采用池栽方式，每份材料一池，每池3 株，于2020年4月清明前播種，6月定植，定植后10 d 每株選1 片健康葉片打孔取樣，樣本洗凈混合后用液氮處理并于-20 ℃保存。

表1 供試10 份芡實(shí)材料主要信息

1.2 DNA 提取和驗(yàn)證

使用生工生物工程（上海）股份有限公司的Ezup 柱式植物基因組DNA 抽提試劑盒（B518261）提取全基因組DNA，使用Nano drop2000 檢測(cè)DNA 的純度和濃度，將提取DNA 濃度稀釋至20 ng·μL-1，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SSR 分子標(biāo)記檢測(cè)

選用已報(bào)道的10 對(duì)微衛(wèi)星引物Efer004、Efer008、Efer013、Efer015、Efer023、Efer032、Efer037、Efer045、Efer047 和Efer136（表2）進(jìn)行擴(kuò)增（Ayumi et al.，2011）。根據(jù)SSR 標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果，構(gòu)建芡實(shí)指紋圖譜并進(jìn)行親緣關(guān)系鑒定。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)的總體積為20.0 μL：2.5 μL DNA 模板，10 μL 2×PCR mix 和10 nmol·L-1正、反向引物各2 μL，不足體積用ddH2O 補(bǔ)足。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共計(jì)35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)使用Qsep100 核酸蛋白檢測(cè)儀（臺(tái)灣），并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化分析。內(nèi)參大小依次為20、26、34、67、76、90、110、123、147、160、180、190、201、217、238、242、307、404、527、622、1 000 bp。

表2 10 對(duì)SSR 引物信息

1.4 品質(zhì)性狀測(cè)定

每品種取大旦期芡實(shí)去殼籽粒（雞頭米仁），測(cè)定水分含量及干燥籽粒的總淀粉、直鏈淀粉、粗脂肪、蛋白質(zhì)、磷、鉀、多酚及總黃酮含量。水分含量的測(cè)定采用直接干燥法（GB 5009.3-2016），總淀粉含量的測(cè)定采用酶水解法（GB 5009.9-2016），直鏈淀粉含量的測(cè)定采用單波長(zhǎng)比色法（吳遠(yuǎn)琴 等，2014），粗脂肪含量的測(cè)定采用索氏抽提法（GB 5009.6-2016），蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用分光光度法（GB 5009.5-2016），磷含量的測(cè)定采用分光光度法（GB 5009.87-2016），鉀含量的測(cè)定采用火焰原子吸收光譜法（GB 5009.91-2017），多酚含量的測(cè)定采用福林-酚法（GB/T 8313-2018），黃酮含量的測(cè)定采用NaNO2-Al（NO3）-NaOH 比色法（胡曉瀟，2022）。以上檢測(cè)委托蘇州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)Qsep100 核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)終濃度大于0.3 ng·L-1的擴(kuò)增峰數(shù)量，位點(diǎn)有峰計(jì)為1，無(wú)峰計(jì)為0，每個(gè)峰相當(dāng)于1 個(gè)等位基因位點(diǎn)。建立供試芡實(shí)材料與等位基因位點(diǎn)之間的0/1矩陣圖，統(tǒng)計(jì)每對(duì)引物擴(kuò)增出的總位點(diǎn)數(shù)（T）、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)（N）及每個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度，計(jì)算每對(duì)引物擴(kuò)增的多態(tài)性位點(diǎn)百分率（PPL）：PPL=（N/T）×100%。利用Cervus 3.0.7 軟件計(jì)算10 對(duì)SSR 引物的多態(tài)性信息含量（PIC），利用DPS 7.05 軟件計(jì)算供試材料間的Nei & Li 相似系數(shù)，并構(gòu)建UPGMA 聚類圖。將10 份芡實(shí)材料按照擴(kuò)增片段長(zhǎng)度從小到大的順序依次用阿拉伯?dāng)?shù)字編碼，構(gòu)建芡實(shí)指紋圖譜（薛建華 等，2016）。品質(zhì)性狀測(cè)定數(shù)據(jù)利用DPS 7.05 軟件計(jì)算供試材料間的歐式遺傳距離并進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 芡實(shí)SSR 標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果多態(tài)性分析

Qsep100 核酸蛋白檢測(cè)儀擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。統(tǒng)計(jì)10 份芡實(shí)材料SSR 擴(kuò)增結(jié)果（表3），共獲得29 個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)，其中28 個(gè)為多態(tài)性位點(diǎn)，PPL 為96.6%。SSR 引物的PIC 值介于0.164～0.640，平均值為0.463，4 對(duì)SSR 引物的PIC 值大于0.500，表明供試芡實(shí)材料遺傳多樣性豐富，且所選10 對(duì)SSR 引物在10 份芡實(shí)材料中具有多態(tài)性，可用于芡實(shí)親緣關(guān)系鑒定和構(gòu)建指紋圖譜。SSR 引物的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度存在差異，擴(kuò)增最短片段為102 bp（引物Efer047 擴(kuò)增獲得），擴(kuò)增最長(zhǎng)片段為238 bp（引物Efer045 擴(kuò)增獲得）。

圖1 10 對(duì)SSR 引物對(duì)紅花蘇芡的擴(kuò)增結(jié)果

表3 10 份芡實(shí)材料SSR 標(biāo)記的多態(tài)性

2.2 芡實(shí)指紋圖譜的構(gòu)建

對(duì)10 份芡實(shí)材料擴(kuò)增獲得的所有位點(diǎn)按片段大小從小到大編碼，建立編碼標(biāo)準(zhǔn)（表4）。根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)10份芡實(shí)材料的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行編碼（表5），編碼結(jié)果可以將10 份芡實(shí)材料完全區(qū)分。因此，構(gòu)建的DNA 指紋圖譜可作為芡實(shí)品系鑒定的重要依據(jù)。

表4 10 對(duì)SSR 核心引物擴(kuò)增產(chǎn)物編碼標(biāo)準(zhǔn)

表5 10 份芡實(shí)材料的SSR 指紋圖譜

2.3 芡實(shí)籽粒品質(zhì)性狀多態(tài)性分析

對(duì)10 份芡實(shí)材料進(jìn)行籽粒品質(zhì)性狀檢測(cè)（表6），10 份芡實(shí)材料薄殼籽粒均含有豐富的蛋白質(zhì)、磷、鉀等礦質(zhì)元素，以及高含量的多酚和黃酮等功能物質(zhì)。這些結(jié)果表明，芡實(shí)有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

表6 10 份芡實(shí)材料籽粒品質(zhì)性狀

水分含量是反應(yīng)芡實(shí)籽粒成熟度（老嫩）的一個(gè)重要的指標(biāo)，芡實(shí)淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉構(gòu)成，其中直鏈淀粉含量高低是決定芡實(shí)口感好壞的主要因素，脂肪含量也是鑒別植物種子和果實(shí)品質(zhì)優(yōu)劣的一個(gè)重要指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，供試芡實(shí)去殼籽粒水分含量在40.7%～68.8%之間，兩個(gè)刺芡（余干刺芡、白花刺芡）材料水分含量較低，分別為40.7%和46.9%，余干刺芡、白花刺芡的直鏈淀粉含量低于大多數(shù)無(wú)刺芡實(shí)，直鏈淀粉含量最低的是余干刺芡，僅為5.76%，而直鏈淀粉含量最高的無(wú)刺芡實(shí)（合肥芡實(shí)）為11.84%。此外，刺芡的粗脂肪含量也明顯低于無(wú)刺芡實(shí)，說(shuō)明無(wú)刺芡實(shí)材料的品質(zhì)要優(yōu)于有刺芡實(shí)材料。

2.4 芡實(shí)材料的聚類分析

依據(jù)10 份芡實(shí)材料的SSR 標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果分析及籽粒品質(zhì)性狀檢測(cè)結(jié)果，分別對(duì)10 份芡實(shí)材料進(jìn)行聚類分析。

根據(jù)SSR 標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果，10 份芡實(shí)材料間Nei & Li 相似系數(shù)如表7所示，介于0.100 0～0.894 7之間，平均值為0.580 3。通過(guò)UPGMA 聚類分析，以相異系數(shù)0.57 為閾值可將10 份芡實(shí)材料分為4個(gè)組，組Ⅰ包括地方栽培種紅花蘇芡、紫花蘇芡和雜交品系6、雜交品系40，組Ⅱ包括白花蘇芡和雜交品系7，刺芡品種余干刺芡和白花刺芡屬于組Ⅲ，組Ⅳ包括雜交品系45 和合肥芡實(shí)。說(shuō)明SSR 標(biāo)記可區(qū)分不同類型的芡實(shí)資源（圖2-A）。

圖2 基于SSR 標(biāo)記和芡實(shí)籽粒品質(zhì)性狀的聚類分析及分組情況

表7 10 份芡實(shí)材料間Nei & Li 相似系數(shù)

根據(jù)籽粒品質(zhì)性狀檢測(cè)結(jié)果，10 份芡實(shí)材料間歐式遺傳距離如表8所示，介于1.878 2～7.194 6之間，平均值為4.057 5。以歐式遺傳距離3.50 為閾值可將10 份芡實(shí)材料分為3 類，其中4 個(gè)雜交品系和紫花蘇芡屬于組Ⅰ，白花蘇芡、紅花蘇芡和合肥芡實(shí)屬于組Ⅱ，2 份刺芡材料余干刺芡和白花刺芡屬于組Ⅲ。即組Ⅰ主要為芡實(shí)雜交材料，組Ⅱ主要為蘇芡的地方栽培種，組Ⅲ主要為刺芡品種（圖2-B）。

表8 10 份芡實(shí)材料間歐式遺傳距離

3 結(jié)論與討論

本研究開(kāi)展了基于籽粒品質(zhì)性狀的芡實(shí)遺傳分析，該方法雖然不能完全區(qū)分芡實(shí)材料，但聚類結(jié)果能夠?qū)④蛯?shí)雜交材料與蘇芡、刺芡等栽培種區(qū)分，表明芡實(shí)雜交后代在關(guān)鍵性狀，如籽粒品質(zhì)等方面存在變異，因此采用雜交育種手段改善芡實(shí)籽粒品質(zhì)是可行的。這些結(jié)果對(duì)于指導(dǎo)芡實(shí)的雜交育種工作具有重要意義。

芡實(shí)植株表型性狀的差異主要表現(xiàn)在花色、籽粒色和有刺無(wú)刺等方面（鮑忠洲 等，2010），單獨(dú)采用表型鑒定的方法區(qū)分大量芡實(shí)雜交材料相對(duì)較困難，這也導(dǎo)致了研究人員易混雜芡實(shí)材料，增加了育種難度。相較于籽粒品質(zhì)性狀的聚類結(jié)果，SSR 分析結(jié)果更為精確。本試驗(yàn)所用的10 對(duì)SSR引物，共獲得29 個(gè)位點(diǎn)信息，其中28 個(gè)為多態(tài)性位點(diǎn)，具有較多的遺傳信息，有利于實(shí)現(xiàn)鑒定不同類型芡實(shí)的目標(biāo)。因此本試驗(yàn)采用的芡實(shí)SSR 擴(kuò)增技術(shù)體系，可有效應(yīng)用于芡實(shí)種質(zhì)資源的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳距離分析。本試驗(yàn)還通過(guò)SSR 標(biāo)記構(gòu)建一套用于鑒定芡實(shí)材料的DNA 指紋編碼系統(tǒng)，10 份芡實(shí)材料都有獨(dú)特的DNA 指紋編碼。該方法為芡實(shí)種質(zhì)資源的保護(hù)、開(kāi)發(fā)和利用提供了科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為其他作物的遺傳多樣性分析和指紋圖譜構(gòu)建提供參考。