鄒 敏 陶 濤 楊 洋 周珊珊 張世才 陳國(guó)康 王永清* 田時(shí)炳*

（1 重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，重慶 401329；2 西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，重慶 400716）

茄子（SolanummelongenaL.）是我國(guó)設(shè)施栽培的主要蔬菜之一，長(zhǎng)期連作重茬栽培已導(dǎo)致嚴(yán)重的根結(jié)線蟲(chóng)等土傳病害發(fā)生。利用抗性砧木進(jìn)行嫁接栽培是控制茄子根結(jié)線蟲(chóng)病害的有效措施（周寶利，1997；劉富中 等，2021）。

根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogynespp.）是全球農(nóng)作物生產(chǎn)上重要的病原物之一，危害包括經(jīng)濟(jì)作物、糧食作物等在內(nèi)的3 000 多種植物（Abad et al.，2003；Jones et al.，2013）。目前，國(guó)際上已報(bào)道的根結(jié)線蟲(chóng)有100 余種（Bernard et al.，2017）。在我國(guó)，北方保護(hù)地設(shè)施蔬菜上最常見(jiàn)的是南方根結(jié)線蟲(chóng)（M.incognita）（金娜 等，2022），而南方最常見(jiàn)的有南方根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)（M.arenaria）、北方根結(jié)線蟲(chóng)（M.hapla）和爪哇根結(jié)線蟲(chóng)（M.javanica）（趙磊 等，2010；賈美清和吳光紅，2011）。海南省是我國(guó)重要的南菜北運(yùn)基地，也是主要的農(nóng)作物南繁南鑒試驗(yàn)基地，但根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)生嚴(yán)重，病原種類繁多，且在不同地區(qū)和作物間存在不同優(yōu)勢(shì)種群。其中，湛江根結(jié)線蟲(chóng)（M.zhanjiangensis）是危害海南省番石榴的優(yōu)勢(shì)種群（芮凱 等，2005），南方根結(jié)線蟲(chóng)是危害海南省腎茶的優(yōu)勢(shì)種群（于旭東 等，2009），南方根結(jié)線蟲(chóng)和象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)（M.enterolobii）是危害海南省葫蘆科蔬菜的優(yōu)勢(shì)種群（黃偉明，2010），擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)（M.graminicola）是危害海南省水稻的優(yōu)勢(shì)種群（羅激光，2019）。近年來(lái)，研究人員通過(guò)對(duì)海南省18 個(gè)市縣的根結(jié)線蟲(chóng)進(jìn)行鑒定，明確象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)已取代南方根結(jié)線蟲(chóng)成為蔬菜上的優(yōu)勢(shì)類群（龍海波等，2015；李周容 等，2020）。

本試驗(yàn)于2019-2022年在重慶南繁南鑒蔬菜示范基地（海南省樂(lè)東縣利國(guó)鎮(zhèn)）茄子南繁加代時(shí)進(jìn)行，利用形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定明確基地內(nèi)茄子根結(jié)線蟲(chóng)病原種類，通過(guò)病土苗期鑒定法與田間病圃誘發(fā)鑒定相結(jié)合，篩選高抗根結(jié)線蟲(chóng)的茄子種質(zhì)，以期為高抗根結(jié)線蟲(chóng)茄子砧木的培育奠定理論依據(jù)和材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

從重慶南繁南鑒蔬菜示范基地田間病圃采集根結(jié)線蟲(chóng)病株根系，用于根結(jié)線蟲(chóng)病原種類鑒定；58份砧用茄子種質(zhì)由重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所茄科蔬菜創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)從全國(guó)各地搜集、保存（表1），用于根結(jié)線蟲(chóng)抗性鑒定。本試驗(yàn)田間病圃鑒定于2019年開(kāi)始進(jìn)行，在前期調(diào)查中已發(fā)現(xiàn)病情指數(shù)大于60 的感病種質(zhì)LJ-12 等（即感病種質(zhì)），且此次鑒定的種質(zhì)中包含抗病種質(zhì)水茄，因此，在病土苗期鑒定時(shí)不再另設(shè)抗病、感病對(duì)照。

表1 58 份砧用茄子種質(zhì)編號(hào)及拉丁名

1.2 方法

1.2.1 病原體形態(tài)學(xué)鑒定 用手術(shù)刀在發(fā)病的植株根部直接挑取發(fā)育比較成熟的雌性線蟲(chóng)若干于載玻片上，在光學(xué)顯微鏡下觀察，輕壓線蟲(chóng)，使其內(nèi)容物流出，變得相對(duì)透明。用挑針固定線蟲(chóng)，手術(shù)刀切割線蟲(chóng)腹部末端，將線蟲(chóng)分為前后兩大部分，后半部分繼續(xù)切割，整理殘片后觀察其會(huì)陰花紋并拍照記錄（劉丹 等，2021）；觀察線蟲(chóng)前半部分的形態(tài)結(jié)構(gòu)，切取頭部的口針，利用目尺在40 倍顯微鏡下分別測(cè)量線蟲(chóng)口針長(zhǎng)度和DEGO 長(zhǎng)度（指背食道腺開(kāi)口至口針基部球的距離）。

1.2.2 病原體 rDNA-ITS 鑒定 取植株發(fā)病部位進(jìn)行研磨處理，使用DNA 提取試劑盒（TaKaRa 公司）提取根結(jié)線蟲(chóng)DNA。使用特異性引物對(duì)提取的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。不同種類根結(jié)線蟲(chóng)PCR擴(kuò)增的特異性引物均參考李榮蘭等（2023）的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)，詳見(jiàn)表2。

表2 根結(jié)線蟲(chóng)PCR 鑒定引物信息

PCR 反應(yīng)體系為50 μL：25 μL 2×Es Tax Master Mix，19 μL ddH2O，2 μL 模板DNA，2 μL上游引物，2 μL 下游引物。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸55 s，共35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。使用1.2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，膠回收之后送生工生物工程（上海）股份有限公司完成測(cè)序。獲得的序列與NCBI 序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源序列比對(duì)分析，利用MEGA 11.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 抗病性鑒定 病土苗期接種鑒定于2021年12月上旬進(jìn)行。田間挖取根結(jié)線蟲(chóng)重病植株根系周圍土層深5～25 cm 的土壤，與無(wú)病蟲(chóng)商品育苗基質(zhì)按照體積比1∶1 混勻，用于茄子種質(zhì)育苗。每穴播種2～3 粒，常規(guī)育苗管理，間苗時(shí)每穴保留1 株壯苗。播種50 d 后將植株連根拔起，清水洗凈根部，調(diào)查各植株根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病情況。3 次重復(fù)，每重復(fù)10 株。根結(jié)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0 級(jí)，無(wú)根結(jié)；1 級(jí)，1/3 以下須根有根結(jié)；3 級(jí)，1/3～2/3 的須根有根結(jié)；5 級(jí)，2/3 以上須根有根結(jié)或主根有根結(jié)。

田間病圃誘發(fā)鑒定于2019-2021年進(jìn)行。每年9月中旬進(jìn)行茄子育苗，10月中旬定植于基地根結(jié)線蟲(chóng)病圃，每年每份種質(zhì)定植20 株，翌年春季試驗(yàn)結(jié)束時(shí)（2月中下旬）將植株連根拔起，調(diào)查根系根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病情況。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（張銘真，2017）：0 級(jí)，無(wú)根結(jié)；1 級(jí)，根結(jié)不明顯，占整株根系1%～5%；2 級(jí)，根結(jié)部分占整株根系6%～25%；3 級(jí)，根結(jié)部分占整株根系26%～50%；4 級(jí)，根結(jié)部分占整株根系51%～75%；5 級(jí)，根結(jié)部分占整株根系75%以上。

根據(jù)2 種抗病性鑒定方法調(diào)查的病情等級(jí)，計(jì)算病情指數(shù)：DI=∑（病級(jí)×該級(jí)病株數(shù)）／（最高病級(jí)×調(diào)查株數(shù)）×100，并根據(jù)各自3 次重復(fù)的結(jié)果計(jì)算平均病情指數(shù)。依據(jù)目前國(guó)際通行的以根結(jié)線蟲(chóng)病情指數(shù)（DI）劃分抗性等級(jí)（陸景偉 等，2022）：DI=0，免疫（I）；0＜DI≤20.0，高抗（HR）；20.0＜DI≤40.0，抗?。≧）；40.0＜DI≤60.0，感?。⊿）；60.0＜DI≤80.0，中感（MS）；80.0＜DI≤100.0，高感（HS）。

2 結(jié)果與分析

2.1 根結(jié)線蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)鑒定

顯微鏡下觀察到根結(jié)線蟲(chóng)雌蟲(chóng)會(huì)陰花紋，有1個(gè)呈方形的背弓，尾端區(qū)有1 個(gè)清晰的旋轉(zhuǎn)紋，平滑至波形，在側(cè)區(qū)出現(xiàn)斷裂紋和叉形紋?？卺樝虮巢繌澢?，針錐前半部呈圓柱狀，后半部呈圓錐狀，口針平均直徑為15.21 μm，DEGO 平均長(zhǎng)度為2.98 μm。初步確定為南方根結(jié)線蟲(chóng)（M.incognita）（圖1）或花生根結(jié)線蟲(chóng)（M.arenaria）。同時(shí)，通過(guò)形態(tài)觀測(cè)根結(jié)線蟲(chóng)30 頭，其中具有方形背弓的南方根結(jié)線蟲(chóng)28 頭，檢出頻率為93.33%；而背線腹線在側(cè)線交叉的花生根結(jié)線蟲(chóng)2 頭，檢出頻率僅為6.67%。表明南方根結(jié)線蟲(chóng)是侵染海南茄子的優(yōu)勢(shì)類群。

圖1 南方根結(jié)線蟲(chóng)形態(tài)特征（左為會(huì)陰花紋，右為口針及食道）

2.2 根結(jié)線蟲(chóng)rDNA-ITS 鑒定

以提取的病原線蟲(chóng)DNA 為模板，使用根結(jié)線蟲(chóng)通用引物和5 種特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增之后，南方根結(jié)線蟲(chóng)特異性引物檢測(cè)得到長(zhǎng)度為935 bp 的擴(kuò)增片段（NanFang），花生根結(jié)線蟲(chóng)特異性引物檢測(cè)得到長(zhǎng)度為410 bp 的擴(kuò)增片段（HuaSheng）。將其克隆后所獲得到的測(cè)序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)用南方根結(jié)線蟲(chóng)特異性引物擴(kuò)增的序列與南方根結(jié)線蟲(chóng)KP411871.1的一致性為99.89%，用花生根結(jié)線蟲(chóng)特異性引物擴(kuò)增的序列與花生根結(jié)線蟲(chóng)MW315990.1 的一致性為99.76%，以爪哇根結(jié)線蟲(chóng)（M.javanica）KF041313.1 作為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。分析結(jié)果顯示，NanFang 和HuaSheng 這2 個(gè)序列分別與南方根結(jié)線蟲(chóng)（M.incognita）、花生根結(jié)線蟲(chóng)（M.arenaria）的序列聚為一類（圖2）。

圖2 基于不同根結(jié)線蟲(chóng)rDNA-ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 砧用茄子種質(zhì)的抗病性鑒定

兩種方法對(duì)58 份砧用茄子種質(zhì)的抗病性鑒定結(jié)果見(jiàn)表3，病土苗期接種鑒定的病情指數(shù)為0～71.59，田間病圃誘發(fā)鑒定的病情指數(shù)為0.40～72.80，2 種方法鑒定參試種質(zhì)的整體病情程度基本一致，病土苗期鑒定的總病情指數(shù)高于田間病圃誘發(fā)鑒定。其中，抗性等級(jí)相同的種質(zhì)有34份，占58.62%，病情指數(shù)之差＜20.0 的種質(zhì)有53份，占91.38%。病土苗期鑒定將參試種質(zhì)抗性劃分為5 級(jí)，其中免疫1 份、高抗5 份、抗病25 份、感病22 份、中感5 份；田間病圃鑒定將參試種質(zhì)抗性劃分為4 級(jí)，其中高抗9 份、抗病23 份、感病21 份、中感5 份。根據(jù)2 種方法的抗病性鑒定結(jié)果，對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)表現(xiàn)為高抗的砧用茄子種質(zhì)有6份，分別為水茄、蒜芥茄、LJ-7、Ng1-039、Ng1-021、Ng1-003。

表3 58 份砧用茄子種質(zhì)的根結(jié)線蟲(chóng)病抗性鑒定結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在重慶南繁南鑒蔬菜示范基地（海南省樂(lè)東縣利國(guó)鎮(zhèn)），茄子不是受單一根結(jié)線蟲(chóng)種類侵染，而是由南方根結(jié)線蟲(chóng)和花生根結(jié)線蟲(chóng)復(fù)合侵染。根據(jù)顯微鏡下30 頭根結(jié)線蟲(chóng)形態(tài)特征觀測(cè)顯示，具有方形背弓的南方根結(jié)線蟲(chóng)檢出頻率占93.33%，而花生根結(jié)線蟲(chóng)檢出頻率僅為6.67%，即南方根結(jié)線蟲(chóng)為該南繁基地田塊的優(yōu)勢(shì)病原線蟲(chóng)，該結(jié)果與前人研究結(jié)果基本一致（陳綿才 等，2001；賈本凱，2012）。據(jù)此，后續(xù)開(kāi)展的茄子砧用種質(zhì)抗病性鑒定所針對(duì)的病原線蟲(chóng)為南方根結(jié)線蟲(chóng)（M.incognita）。據(jù)研究報(bào)道，在我國(guó)重慶、四川等多數(shù)根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病地區(qū)，南方根結(jié)線蟲(chóng)是主要種類（羅佳 等，2021；陸景偉 等，2022）。因此在南繁基地獲得的茄子抗性評(píng)價(jià)結(jié)果，對(duì)重慶、四川等以南方根結(jié)線蟲(chóng)為優(yōu)勢(shì)類群的地區(qū)具有重要參考及應(yīng)用價(jià)值。

本試驗(yàn)以田間病土作為接種病源，同時(shí)采用病土苗期接種鑒定和田間病圃誘發(fā)鑒定，2 種方法鑒定的茄子種質(zhì)整體病情程度基本一致。其中，抗性等級(jí)評(píng)價(jià)相同的種質(zhì)有34 份，抗性等級(jí)評(píng)價(jià)相鄰的種質(zhì)有23 份，僅1 份種質(zhì)（Ng1-047）抗性等級(jí)評(píng)價(jià)相差2 級(jí)（苗期評(píng)價(jià)為抗病，田間評(píng)價(jià)為中感）。同時(shí)，苗期鑒定的總病情指數(shù)高于田間鑒定，對(duì)于高抗種質(zhì)的篩選更加嚴(yán)苛。對(duì)比2 種方法可知，82.76%的種質(zhì)田間鑒定抗性評(píng)價(jià)級(jí)別優(yōu)于（或等于）苗期鑒定，其中3 份田間表現(xiàn)高抗的種質(zhì)（BW9、Ng1-015、Ng1-018），苗期鑒定結(jié)果為抗病。因此，苗期鑒定方法可靠，同時(shí)縮短鑒定時(shí)間，為根結(jié)線蟲(chóng)鑒定提供了新方法。最后，結(jié)合2種方法的鑒定結(jié)果，并以病情指數(shù)較高的結(jié)果進(jìn)行最終評(píng)價(jià)，篩選出高抗根結(jié)線蟲(chóng)的茄子砧用種質(zhì)6份，這些種質(zhì)可為茄子抗病育種奠定材料基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

根據(jù)病原線蟲(chóng)形態(tài)學(xué)和rDNA-ITS 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定南方根結(jié)線蟲(chóng)為侵染海南茄子的優(yōu)勢(shì)類群；結(jié)合病土苗期接種與田間病圃誘發(fā)2 種方法的抗病性鑒定結(jié)果，篩選出高抗根結(jié)線蟲(chóng)的砧用茄子種質(zhì)6 份，分別為水茄、蒜芥茄、LJ-7、Ng1-039、Ng1-021、Ng1-003。