邵煜尊 張萬紅 王 惠 王玉潔 苗 圃 申莉莉 李 瑩 焦裕冰 楊金廣*

（1 中國農業(yè)科學院煙草研究所，煙草行業(yè)煙草病蟲害監(jiān)測與綜合治理重點實驗室，山東青島 266101；2 河南省煙草公司洛陽市公司，河南洛陽 471000）

辣椒輕斑駁病毒（pepper mild mottle virus，PMMoV）屬于煙草花葉病毒屬（Tobamovirus），是正單鏈RNA 病毒，病毒粒子呈直桿狀（Adams et al.，2009），其基因組RNA 約含有6 357 個核苷酸，編碼126 kDa蛋白（P126）、183 kDa蛋白（P183）、運動蛋白（movement protein，MP）、外殼蛋白（coat protein，CP）。P126 蛋白具有甲基轉移酶和解旋酶活性以及RNA 沉默抑制子功能；MP 蛋白通過調節(jié)胞間連絲的通透性幫助病毒粒子在細胞間進行移動；CP 蛋白主要與病毒粒子的形成相關，并參與病毒在維管束系統中的長距離傳播（Nakazono-Nagaoka et al.，2011；Han et al.，2017）。

PMMoV 主要通過汁液摩擦、種子、病株殘體等方式傳播（Secrist & Ali，2018），主要侵染辣椒、甜椒和觀賞性辣椒等多數辣椒品種，病害癥狀主要表現為病葉輕度褪綠、皺縮，在發(fā)病前期不易發(fā)現；果實發(fā)病往往呈現扁平、畸形特點，導致其商品價值和食用價值降低（Jiao et al.，2020）。另外，PMMoV 可自然侵染葫蘆科蔬菜作物南瓜、黃瓜、甜瓜和豆科蔬菜作物豇豆（吳賀 等，2021），茄科作物番茄（Zhou et al.，2020）、茄子（劉雪建，2015）；筆者通過人工汁液摩擦發(fā)現，PMMoV可系統性侵染煙草，引起葉片皺縮，輕度褪綠。PMMoV 的大面積流行發(fā)生曾對意大利（Wetter et al.，1984）、日本（Kirit et al.，1997）等國家的辣椒生產造成嚴重經濟損失；1994年，PMMoV 在中國新疆首次報道（向本春 等，1994）。研究表明，PMMoV 具有較強的遺傳穩(wěn)定性，能在辣椒制品和人類糞便中長期穩(wěn)定存在，已經作為水資源中人類糞便污染的潛在指標（張昕喆 等，2020）。

目前已經報道應用較廣泛的PMMoV 檢測方法包括酶聯免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、 反轉錄PCR 法（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）以及核酸雜交法（王亞南和王錫鋒，2008）。ELISA 作為最常用的傳統病毒檢測方法，易出現假陽性；RT-PCR 方法需要具有精準溫控設備的PCR 儀，價格昂貴，耗時較長，操作略繁瑣，且無法實現田間快速檢測；核酸雜交法具有較好的特異性和靈敏度，但雜交時間長，雜交效率低（焦裕冰，2020）。因此，建立一種簡便有效、可在田間應用的病毒檢測方法對于防止因植物病毒傳播造成生產上的損失極為重要。

環(huán)介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）由Notomi等（2000）建立，可以識別目標DNA 上4 種或者6 種不同的DNA 序列，依賴一個包含目標DNA 正義鏈和反義鏈序列的內部引物啟動LAMP 擴增反應，在恒溫條件下就可以高特異性、高效率的快速擴增出目標DNA。該技術目前已經應用在疫霉菌（Phytophthora ramorum）（Sondreli et al.，2023）、大豆花葉病毒（bean common mosaic virus，BCMV）（?eli?k et al.，2023）、玉米晚枯病菌（Cephalosporiummaydis）（何瑞玒 等，2023）、辣椒番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV）（韋建明 等，2023）、草莓枯萎病菌（Fusariumoxysporumf.sp.fragariae）（侯圣凡 等，2022）、結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）（陳濤 等，2012）等植物病原檢測以及人類相關疾病檢測方面。逆轉錄LAMP（reverse transcription LAMP，RT-LAMP）方法是在LAMP反應體系中加入RNA 酶抑制劑和RNA 逆轉錄酶（孟若雪，2022），從而省略反轉錄步驟，該技術首次應用于日本感染山藥花葉病毒（japanese yam mosaic virus，JYMV）的山藥根、葉和繁殖體中（Fukuta et al.，2003）。

本試驗以PMMoV 的CP 序列為靶標基因，F3/B3、FIP/BIP 為引物建立RT-LAMP 檢測方法，篩選最佳反應條件并進行特異性檢測、靈敏度驗證，期望對PMMoV 的田間快速檢測鑒定提供一條新路徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病毒 辣椒輕斑駁花葉病毒葫蘆島分離物（PMMoV-HLD，登錄號：MG515725.1）、馬鈴薯Y 病毒（potato virus Y，PVY，登錄號：NC_001616.1）、煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV，登錄號：NC_001367.1）、 黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV，登錄號：MN481937.1）、番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV，登錄號：OL471718.1）均由煙草行業(yè)煙草病蟲害監(jiān)測與綜合治理重點實驗室保存，摩擦接種辣椒和本氏煙，發(fā)病后取發(fā)病葉片于-80 ℃冰箱保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 試劑：RNA isolater Total RNA Extraction Reagent（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）、HiScript? Ⅲ RT SuperMix for qPCR（ + gDNA wiper）試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）、三氯甲烷（天津市富宇精細化工有限公司）、無水乙醇（天津市富宇精細化工有限公司）、異丙醇（天津市富宇精細化工有限公司）、RNA-free Water（北京索萊寶科技有限公司）、Colorimetric pH Sensitive LAMP Kit（DNA/RNA）試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）。

儀器：低溫高速離心機（型號：1-14 k，德國SIGMA）、水浴鍋（型號：DK-320，上海精宏實驗設備有限公司）、PCR 儀（型號：CWE811，康為世紀生物科技股份有限公司）、電泳儀（型號：1645070，美國BIO-RAD）、紫外凝膠成像儀（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 RT-LAMP 引物設計 從GeneBank 中下載PMMoV-HLD 外殼蛋白CP 的CDS 序列（登錄號：MG515725.1）。利用LAMP 在線引物設計網站（https：//lamp.neb.com/#!/）設計RT-LAMP 引物序列：外部引物對F3 和B3，內部引物對FIP 和BIP；PCR 引物利用Primer5 軟件設計，特異引物序列命名為PMMoV-F 和PMMoV-R，目的片段長度為474 bp。所有引物序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列見表1。

表1 RT-LAMP 引物信息

1.2.2 總RNA 提取 根據RNA isolater Total RNA Extraction Reagent 說明書提取葉片總RNA。

1.2.3 RT-LAMP 反應最佳溫度和時間的篩選 根據LAMP 反應試劑盒（Colorimetric pH Sensitive LAMP Kit）說明書配制反應體系：RNA 模板1 μL，FIP/BIP Primer（10 μmol·L-1）各4 μL，F3/B3（10 μmol·L-1）各1 μL，2.5×pH Sensitive LAMP Reaction Mix 10 μL，N-Red stain（可視化pH 指示劑）1.5 μL，BstⅡ DNA polymrase（BstⅡ DNA聚 合 酶 ）1 μL，Reverse Transcriptase（High temperature 反轉錄酶）1 μL，RNA-free Water 補足25 μL。

反應溫度分別設置為55、57、59、61、63、65 ℃，各溫度下反應時間分別為20、30、40、50、60 min，整個反應過程于恒溫水浴鍋中進行。反應結束后，85 ℃孵育10 min，使BstⅡ DNA 聚合酶完全失活。肉眼觀察反應液中顏色變化，洋紅色為陽性，橙黃色為陰性；吸取8 μL 反應產物，在質量分數為1.5%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，電壓設置為150 V，時間為30 min。電泳結束后在紫外凝膠成像儀上觀察目的條帶。根據RT-LAMP 反應液顏色變化的深淺程度、電泳條帶的明暗程度確定最佳反應時間和溫度。

1.2.4 RT-LAMP 特異性檢測 以F3/B3、FIP/BIP為引物序列，PMMoV 同屬病毒TMV 和不同屬病毒PVY、CMV、TSWV 為模板，評估基于RTLAMP 的PMMoV 檢測方法的特異性，以RNAfree Water 作為陰性對照。根據1.2.2 的方法分別提取5 種供試病毒的總RNA，利用1.2.3 確定的最佳反應溫度和時間，在同一條件下進行RT-LAMP 反應，反應體系和反應條件參照1.2.3，反應結束后觀察不同病毒之間反應液顏色變化，并進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5 RT-LAMP 靈敏度檢測 測定PMMoV 侵染辣椒葉片的總RNA 濃度，按照1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8稀釋倍數進行梯度稀釋，以RNA-free Water 作為陰性對照，分別進行RT-LAMP 檢測和RT-PCR檢測。觀察兩種檢測方法在同一稀釋梯度下瓊脂糖凝膠電泳條帶是否出現以及明暗程度。

1.2.6 田間PMMoV 植株樣品檢測 在田間采集疑似PMMoV 癥狀的辣椒葉片樣本13 份，提取總RNA，分別進行RT-LAMP 檢測以及常規(guī)RT-PCR檢測，評價RT-LAMP 方法在田間檢測PMMoV 的可行性。

根據HiScript? Ⅲ RT SuperMix for qPCR（ +gDNA wiper）說明書將提取的病葉總RNA 反轉錄為cDNA，總反應體系20 μL，具體反應步驟：4×gDNA wiper Mix 4 μL，RNA 模板1 μL，RNA-free Water 11 μL，金屬浴42 ℃，2 min；在第一步反應產物中加入4 μL 5×HiScript III qRT SuperMix；反應條件為37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。以cDNA 為模板，PCR 反應體系：cDNA 模板1 μL，2×TaqMaster Mix（Dye Plus）12.5 μL，PMMoV-F/R（10μmol·L-1）各1 μL，RNA-free Water 補足25 μL。反應條件為：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min，35 個循環(huán)；72 ℃，5 min。PCR 終產物在質量分數為1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，電壓設置為180 V，時間為15 min。電泳結束后在紫外凝膠成像儀上觀察是否出現目的條帶。

2 結果與分析

2.1 RT-LAMP反應的最佳溫度和時間

以PMMoV 侵染的辣椒葉片總RNA 為RTLAMP 反應模板，按照1.2.3 的方法配制體系進行RT-LAMP 反應。結果如圖1所示，所有RTLAMP 反應體系在55、57、59、61、63、65 ℃6 個反應溫度下均有擴增，各反應體系中均含有N-Red pH 敏感型酸堿指示劑，RT-LAMP 反應的擴增產物導致反應液pH 發(fā)生變化，反應液顏色由橙黃色變化為洋紅色，且隨著反應時間的延長反應液顏色發(fā)生不同程度加深。在溫度為55 ℃、反應時間為20、30、40 min 時，RT-LAMP 反應液仍為橙黃色，瓊脂糖凝膠電泳無梯形條帶出現；反應時間延長至50 min 時，反應液顏色微紅，瓊脂糖凝膠電泳呈現微弱的梯形條帶。與55 ℃相比，57、59、61、63、65 ℃ 5 個反應溫度下，反應時間30 min 時瓊脂糖凝膠電泳便可觀察到微弱梯形條帶；溫度為57 ℃，水浴反應時間為40 min 便能較好的完成檢測；溫度為65 ℃，水浴反應時間60 min，梯形條帶最為清晰明亮，檢測效果最好。綜上，建立的PMMoV 的RT-LAMP 檢測方法最佳反應溫度和時間為65 ℃、60 min。

圖1 RT-LAMP 在不同反應溫度和時間下的擴增結果

2.2 RT-LAMP 特異性檢測結果

通過RT-LAMP 方法對PMMoV、TMV、CMV、PVY、TSWV 5 種供試病毒的分析結果表明，以PMMoV 為模板的反應液在65 ℃水浴鍋中反應60 min 后，顏色由原先的橙黃色變?yōu)檠蠹t色，以另外4 種病毒以及RNA-free Water 作為模板的對照組反應液顏色未發(fā)生變化，仍然為橙黃色（圖2-A）。取8 μL 上述恒溫水浴反應得到的RT-LAMP 擴增產物進行電泳分析，結果顯示（圖2-B），僅有陽性對照PMMoV 出現RT-LAMP 特有的梯形條帶，對照組TMV、CMV、TSWV、PVY 和RNA-free Water 均無特異性條帶，進一步說明本試驗建立的PMMoV 的RT-LAMP 檢測方法具有較為可靠的特異性。

圖2 RT-LAMP 特異性檢測結果

2.3 RT-LAMP 靈敏度檢測結果

測得PMMoV 侵染辣椒葉片的總RNA 濃度為630 ng·μL-1，經梯度稀釋后，濃度分別為63、6.3、0.63、0.063 ng·μL-1及6.3、0.63、0.063、0.006 3 pg·μL-1。將稀釋后的RNA 作為模板，分別進行RT-LAMP 和RT-PCR 檢測，RT-LAMP 的反應條件為65 ℃，恒溫水浴60 min。在RT-LAMP 反應中，隨著RNA 稀釋倍數的增加，電泳呈現的梯形條帶清晰程度以及明亮程度依次減弱，在稀釋倍數為1×10-8時，反應液顏色完全變?yōu)槌赛S色，且瓊脂糖凝膠電泳呈現極其微弱的梯形條帶，基本不明顯（圖3-A、B）；在RT-PCR 反應中，稀釋倍數為1×10-5時，瓊脂糖凝膠電泳條帶的明亮程度明顯減弱，稀釋倍數為1×10-6時，電泳條帶非常微弱，稀釋倍數為1×10-7時，基本看不到電泳條帶（圖3-C）。表明本試驗建立的RT-LAMP 方法靈敏度比傳統的RT-PCR 技術高10 倍，具有良好的靈敏度。

圖3 RT-LAMP 和RT-PCR 靈敏度檢測結果

2.4 PMMoV 田間樣品檢測

利用RT-LAMP 檢測方法對13 份疑似PMMoV 癥狀的田間辣椒樣品進行分析，結果如圖4-A、B所示，樣品3、4、5、7、9、10、11 和12顏色變化與陽性對照相同，并且電泳呈現正常的梯形條帶，可確定為PMMoV 侵染的植株；樣品2、6、8、13、14 和15 反應液顏色未發(fā)生變化，且電泳未出現任何條帶，明確為非PMMoV 侵染的植株。利用RT-PCR 反應進行輔助檢測，PCR 產物分別在1、3、4、5、7、9、10、11 和12號位置出現正常單一電泳條帶（圖4-C），與RT-LAMP 反應的檢測結果一致，表明本試驗所建立的RT-LAMP 檢測技術具有較好的準確性與可行性。

圖4 疑似PMMoV 田間辣椒樣品的RT-LAMP 和RT-PCR 檢測結果

3 結論與討論

PMMoV 作為侵染辣椒的主要病毒之一，防治極為困難，對我國辣椒生產造成嚴重威脅（于海龍等，2021）。本試驗建立PMMoV 的RT-LAMP快速檢測方法，可在60 min 內完成對該病毒的準確鑒定，并且靈敏度比RT-PCR 技術高10 倍。與傳統的PCR 檢測方法相比具有以下特點：第一，RTLAMP 反應結果直觀，可省略反轉錄的過程，并且擴增反應結束后不需要進行瓊脂糖凝膠電泳，肉眼便可以直接觀察結果進行判定，大大縮短了時間；第二，RT-LAMP 反應不需要精確且昂貴的PCR 儀器，在恒溫水浴鍋中就能完成所有反應步驟；第三，RT-LAMP 反應比傳統PCR 的靈敏度高，有利于病毒侵染前期的準確檢測；第四，RT-LAMP 反應的特異性更強，主要表現在LAMP 設計的引物需要識別靶標序列上面的4～6 條特異性區(qū)域，傳統PCR 檢測僅需要2 條（湯亞飛 等，2016）。但在RT-LAMP 配制反應體系的過程中極易受到空氣中CO2的影響，引起可視化pH 指示劑的酸堿性變化，因此整個操作過程盡量迅速，且避免長時間頻繁打開相關試劑。

綜上，以PMMoV 外殼蛋白CP 序列為靶標基因，F3/B3、FIP/BIP 為引物構建的基于RT-LAMP技術的PMMoV 快速檢測方法，具有特異性強、反應靈敏、操作簡便、用時較短等優(yōu)點。該方法的建立為PMMoV 的快速鑒定提供了一個新思路，在檢測時間盡量短的前提下可以優(yōu)先考慮采用此方法。另外，對于不具備其他檢測方法所需條件的實驗室，該方法可實現對PMMoV 病毒的準確鑒定；還可以直接應用于田間，對PMMoV 進行即時、簡易、快速鑒定，在生產實踐中具有一定的應用前景。