盧淑錦 朱明釗 張娜 楊麗梅 莊 木 張揚勇 呂紅豪 季家磊 閆繼平 王勇*

（1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與新品種選育教育部工程研究中心，蔬菜生物學(xué)湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，蔬菜生物育種全國重點實驗室，北京 100081；3 北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所，蔬菜生物育種全國重點實驗室，國家工程技術(shù)研究中心，蔬菜種質(zhì)改良北京市重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，北京 100097；4 昌黎縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北秦皇島 066600）

結(jié)球甘藍（BrassicaoleraceaL.var.capitataL.）簡稱甘藍，其適應(yīng)性強，風(fēng)味獨特，是主要的十字花科蕓薹屬蔬菜作物之一（方智遠，2017）。甘藍在我國廣泛栽培，在蔬菜周年供應(yīng)和出口貿(mào)易中占重要地位（楊麗梅 等，2016，2021）。根腫病是由蕓薹根腫菌（PlasmodiophorabrassicaeWoronin）侵染引起的一種世界性土傳病害，主要危害十字花科作物（Dixon，2009；章藝 等，2022），可危害的十字花科植物超過100 種（Howard et al.，2010），近年來已嚴(yán)重影響甘藍的生產(chǎn)。植株在苗期感病，主要表現(xiàn)為根部形成腫瘤，葉片會永久性萎蔫，直至死亡（Devos et al.，2005）。根腫菌的休眠孢子可以在適宜土壤環(huán)境中存活20年之久（Koji &Takahiro，2009），一旦田間土壤受到根腫菌污染，將長期不適宜種植十字花科作物。

目前，防治根腫病的主要方法是采用抗病品種，同時實行輪作、深耕、調(diào)節(jié)土壤酸堿度等措施進行綜合防治（趙利民 等，2022）。田間管理和生物防治、化學(xué)防治方法雖然有一定的防治效果，但不能從根本上有效防治根腫病，選育抗根腫病品種是最經(jīng)濟有效的方法（Kuginuki et al.，1999）。蕓薹屬A 基因組作物中的歐洲蕪菁和白菜是十字花科作物中抗根腫病遺傳規(guī)律研究最透徹的作物，迄今為止在蕓薹屬A 基因組作物中已定位的抗根腫病基因超過12 個，其 中CRa、CRb、CRd、CRk、Crr3、PbBa3.1、PbBa3.3、QS_B3.1位于A3 染色體上，Crr1、Crr2、Crr4、CRc則分別位于A8、A1、A6、A2 染色體上。蕓薹屬A 基因組作物中的根腫病抗性多為單基因控制，而甘藍根腫病抗性是由多基因控制的數(shù)量性狀（Diederichsen et al.，2009）。由于甘藍種質(zhì)中根腫病抗源材料稀少，抗病遺傳機制復(fù)雜，抗病機制研究不透徹等原因造成甘藍抗根腫病育種工作進展緩慢。盡管已有一些抗根腫病甘藍品種在田間實際生產(chǎn)中應(yīng)用，但仍不足以解決日益嚴(yán)重的根腫病危害。同時，根腫菌存在生理小種的分化，不同生理小種的致病力有差異。國際上常用的劃分根腫菌生理小種的系統(tǒng)主要有2 個，分別是ECD系統(tǒng)和Williams 系統(tǒng)。由于Williams 系統(tǒng)僅采用4個鑒別寄主-2 個結(jié)球甘藍和2 個蕪菁甘藍，其鑒別寄主少，鑒定方便，是目前鑒定根腫菌生理小種的主流方法。國內(nèi)白宇鵬（2019）還創(chuàng)建了SCD鑒別系統(tǒng)，采用更多的大白菜自交系作為鑒別寄主，可對根腫菌生理小種進行更加精確的劃分。沈向群等（2009）采用Williams 系統(tǒng)鑒定出4號生理小種致病力最強，為國內(nèi)十字花科蔬菜根腫菌主流生理小種，甘藍主產(chǎn)區(qū)的湖北、重慶、云南等病區(qū)均為4號生理小種（陳靜 等，2016；費維新 等，2016）。但來源不同的4號生理小種也會表現(xiàn)出不同的致病力（張淑霞 等，2019）。目前國內(nèi)缺乏對來源于湖北長陽、重慶武隆等地的根腫菌4號生理小種表現(xiàn)高抗且對不同地區(qū)根腫菌生理小種具有廣譜抗性的甘藍品種。因此，創(chuàng)制出廣譜抗根腫病甘藍材料，對甘藍抗根腫病育種具有重要意義。

甘藍是具有典型雜種優(yōu)勢的異花授粉植物，其進行雜交種生產(chǎn)的途徑之一是利用雄性不育系（方智遠 等，2002）。高等植物中的細胞質(zhì)雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS）通常是指雄性配子的退化或者功能喪失，在150 多種高等植物中均發(fā)現(xiàn)了細胞質(zhì)雄性不育系（Carlsson et al.，2008），其中蘿卜細胞質(zhì)雄性不育（Ogura CMS）是國內(nèi)外甘藍育種工作者應(yīng)用最多的不育類型。目前，甘藍雜交種主要是利用Ogura CMS 配制而成，不育性穩(wěn)定，無法進行自交、分離和純化。利用種間雜交技術(shù)將育性恢復(fù)基因Rfo（restorer-of-fertility gene）導(dǎo)入含有抗病基因的Ogura CMS 商品種中，恢復(fù)其育性，可將抗病基因轉(zhuǎn)育至甘藍自交系中，對拓寬甘藍抗病種質(zhì)資源具有重大意義。

本試驗以來自湖北長陽、重慶武隆、四川廣元的根腫菌生理小種作為病原菌菌源，對抗根腫病Ogura CMS 甘藍材料GY306 進行抗性鑒定。并以GY306 為母本，與Ogura CMS 恢復(fù)材料Z92 進行種間雜交，以期創(chuàng)制出對多個地區(qū)根腫菌生理小種表現(xiàn)抗性的甘藍種質(zhì)，為甘藍抗根腫病育種提供抗源材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試Ogura CMS 甘藍材料GY306 采集自四川廣元根腫病病田，對根腫菌4號生理小種具有良好抗性，葉球扁球形、綠色，中心柱短，商品性好?？共φ站G抗9號（試驗編號為CR1）亦為Ogura CMS 甘藍品種，由武漢市九頭鳥種苗有限公司提供。感病對照CR2 和Ogura CMS 育性恢復(fù)材料Z92（含有育性恢復(fù)基因Rfo）均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所甘藍遺傳育種課題組提供。

供試根腫菌采集于湖北長陽、重慶武隆、四川廣元根腫病病田的甘藍腫根，經(jīng)Williams 系統(tǒng)鑒定分別為4號、4號、7號生理小種。將甘藍腫根清洗后保存于-20 ℃冰箱，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料種植 2021年10月，在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所南圃場溫室內(nèi)種植GY306、CR1、CR2、Z92，分別選取顆粒飽滿的種子，采用32 孔穴盤基質(zhì)育苗，每份材料播種2 盤。

2022年4月，采用人工剝蕾的方法，于上午取含有Ogura CMS 育性恢復(fù)基因（Rfo）甘藍材料Z92 的盛花期花粉，涂抹在GY306 的柱頭上，然后套袋、掛牌標(biāo)記；待種莢成熟時進行收獲。

2022年7月種植Z92×GY306 雜交F1群體。

1.2.2 根腫菌接種液制備 取20 g 備用的甘藍腫根，置于室溫腐化12 h；然后放進攪拌器，加入3倍體積的無菌蒸餾水，勻漿經(jīng)過8 層紗布過濾，將濾液收集至50 mL 的離心管中，500 r·min-1離心5 min；上清液收集至新的離心管中，2 500 r·min-1離心5 min，棄上清液；沉淀用無菌水重懸3 次后，利用血球計數(shù)板將孢子濃度調(diào)整至2×108個·mL-1。4 ℃冰箱保存，24 h 內(nèi)使用。

1.2.3 苗期人工接種抗病性鑒定 待GY306、CR1、CR2 幼苗長至兩葉一心時，采用孢子注射法分別接種長陽、武隆、廣元根腫菌菌液，吸取2 mL 菌液注射于幼苗根部；接種后置于溫室內(nèi)，適時澆水。接種42 d 后，將幼苗根部輕輕拔出，并用清水洗凈，調(diào)查根腫病發(fā)病情況，參考Ning 等（2018）的病情分級標(biāo)準(zhǔn)及方法計算病情指數(shù)，進行抗性評價。

病情分級標(biāo)準(zhǔn)：0 級，根部無癥狀；1 級，主根無癥狀，側(cè)根有小瘤；2 級，主根略有膨大，側(cè)根腫瘤較大；3 級，主根膨大較嚴(yán)重，有明顯側(cè)根；4 級，主根膨大非常嚴(yán)重，幾乎沒有側(cè)根。

病情指數(shù)（DI）=∑（各病級株數(shù)×相應(yīng)級值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級值）×100

抗性評價標(biāo)準(zhǔn)：免疫（I），DI=0；高抗（HR），0＜DI≤5；抗病（R），5＜DI≤20；中抗（MR），20＜DI≤30；感?。⊿），30＜DI≤60；高感（HS），DI ＞ 60。

1.2.4 甘藍根腫病抗性基因分子標(biāo)記檢測 利用已報道的7 對與根腫病抗性基因連鎖的分子標(biāo)記（表1）（Saito et al.，2006；Matsumoto et al.，2012；Zhang et al.，2014），以不含根腫病抗性基因的CR2為感病對照，以CR1 為抗病對照，對GY306 進行分子標(biāo)記鑒定。采用改良的CTAB 法提取植株基因組DNA（Stefanova et al.，2013），并將DNA 濃度調(diào)整至30～50 ng·μL-1。分別以GY306、CR1、CR2 的DNA 作為模板，依次采用7 對引物進行PCR 擴增。PCR 擴增體系為10 μL：模板DNA 1 μL，PCR mix 5 μL，1.0 μmol·L-1上、下游引物各0.5μL，ddH2O 補齊至10 μL。PCR 擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取PCR 產(chǎn)物1 μL，使用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

表1 甘藍根腫病抗性基因的引物序列

1.2.5 甘藍Ogura CMS 及其恢復(fù)基因分子標(biāo)記檢測 利用Chen 等（2021）設(shè)計的與Ogura CMS 相關(guān)的分子標(biāo)記OKB（表2），以非Ogura CMS 甘藍材料CR2 為陰性對照，以O(shè)gura CMS 甘藍品種CR1 為陽性對照，對GY306 進行分子標(biāo)記鑒定，方法同1.2.4。

表2 甘藍Ogura CMS 及其恢復(fù)基因的引物序列

利用任文靜（2021）設(shè)計的與Ogura CMS 恢復(fù)基因相關(guān)的分子標(biāo)記Rfo11（表2），以不含Ogura CMS 恢復(fù)基因的CR2 為對照，對Z92×GY306 雜交F1群體進行分子標(biāo)記鑒定，方法同1.2.4。

1.2.6 育性調(diào)查 待Z92×GY306 雜交F1植株抽薹開花后，于盛花期對花粉進行觀察。對花粉正常的植株進行育性檢測，采集具有正?；ǚ鄣幕ǘ?，使用亞歷山大染液進行染色，觀察花粉狀態(tài)，判斷植株是否恢復(fù)育性。

2 結(jié)果與分析

2.1 GY306 根腫病抗性鑒定與抗病基因檢測

由圖1、表3 可知，GY306 對長陽和廣元的根腫菌生理小種均表現(xiàn)為免疫（DI=0），對武隆的根腫菌生理小種表現(xiàn)為抗?。―I=6.25）；抗病對照CR1 對武隆和廣元的根腫菌生理小種均表現(xiàn)為高抗，但對長陽的根腫菌生理小種則表現(xiàn)為高感；而感病對照CR2 對3 個地區(qū)的根腫菌生理小種均表現(xiàn)為感病或高感。經(jīng)Williams 系統(tǒng)鑒定，長陽、武隆的根腫菌均為我國主要流行的4號生理小種，廣元的根腫菌為7號生理小種。表明，GY306 對根腫病具有廣譜抗性，對根腫菌4號生理小種和7號生理小種均表現(xiàn)抗病。

圖1 GY306 根腫病室內(nèi)苗期人工接種鑒定表型結(jié)果

表3 GY306 根腫病室內(nèi)苗期人工接種鑒定結(jié)果

利用已報道的7 對與根腫病抗性基因連鎖的分子標(biāo)記對GY306 進行抗性基因檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗病對照CR1 含有抗根腫病基因CRa，而GY306 中未發(fā)現(xiàn)根腫病抗性基因（表4）。說明GY306 可作為甘藍抗根腫病育種的新種質(zhì)。

表4 GY306 根腫病抗性基因分子標(biāo)記檢測結(jié)果

2.2 GY306 的育性恢復(fù)及抗病種質(zhì)創(chuàng)制

GY306 的雄蕊花藥干癟，不能產(chǎn)生正常的花粉，利用分子標(biāo)記OKB 檢測發(fā)現(xiàn)GY306 的不育類型為Ogura CMS（圖2）。

圖2 GY306 不育類型檢測結(jié)果

利用含有Ogura CMS 育性恢復(fù)基因（Rfo）的甘藍材料Z92，對GY306 進行育性恢復(fù)。然后利用分子標(biāo)記Rfo11 對5 000 株Z92×GY306 雜交F1群體進行分子標(biāo)記鑒定，共篩選獲得Rfo陽性單株3 株，編號分別為971、1551、1937，陽性率為0.06%。綜上所述，Z92×GY306 雜交種攜帶Z92 含有的Rfo基因。

在盛花期，對3 株陽性株（971、1551、1937）的育性進行調(diào)查。結(jié)果表明，陽性株雄蕊可正常產(chǎn)生花粉（圖3、4），即雜交種已恢復(fù)育性，可進行根腫病抗性基因的轉(zhuǎn)育。

圖3 Z97×GY306 雜交F1 花朵表型

圖4 Rfo 陽性株花粉亞歷山大染色檢測結(jié)果

采用來自長陽的根腫菌，對3 株陽性株（971、1551、1937）進行根腫病抗性鑒定。結(jié)果表明（表5、圖5），3 株陽性株均表現(xiàn)為免疫，可作為具有根腫病廣譜抗性且可育的甘藍育種材料。

圖5 3 株陽性株根腫病室內(nèi)苗期人工接種鑒定表型結(jié)果

表5 3 株陽性株根腫病室內(nèi)苗期人工接種鑒定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

甘藍是我國重要的葉菜類蔬菜之一，在各地廣泛種植，由蕓薹根腫菌侵染引發(fā)的根腫病嚴(yán)重威脅其生產(chǎn)。根腫菌生理小種復(fù)雜，變異速度迅速，加大了根腫病的田間防治難度，選育抗根腫病的甘藍新品種是最經(jīng)濟有效的防治方法（司軍，2002）。而甘藍中根腫病抗源相對稀缺，遺傳機制較為復(fù)雜（孫超 等，2016）。不僅如此，根腫菌的不同生理小種分化伴隨著致病力的變化，主流的4號生理小種更是有幾個分型（原玉香 等，2017）。本試驗中，抗病對照CR1 對同為4號生理小種的武隆和長陽根腫菌表現(xiàn)出不同的抗性，說明武隆與長陽的根腫菌是4號生理小種的不同分型。大部分國內(nèi)科研單位推出的抗根腫病品種表現(xiàn)為抗病或耐病，表現(xiàn)高抗的并不多，不能滿足市場需求（曾愛松 等，2022）。陳萍等（2022）篩選到2 份對云南通海、陜西太白和湖北恩施的根腫菌生理小種均表現(xiàn)抗病的甘藍材料，但抗性有差異。本試驗結(jié)果表明，GY306 對湖北長陽、重慶武隆、四川廣元3 個地區(qū)的根腫菌生理小種皆表現(xiàn)良好的抗性，是具有廣譜抗性的甘藍根腫病抗源，有較大的育種應(yīng)用價值。但還需進一步對GY306 中的抗根腫病基因的遺傳機理、定位和克隆進行研究。

目前選育抗根腫病甘藍品種的方法主要是通過遠緣雜交將白菜中的抗病基因?qū)氲礁仕{中以獲得抗性（沈舒，2019；曾愛松 等，2021），其抗病育種過程非常緩慢和困難，尋找新的抗病育種方式極為迫切。而甘藍雜交種多為Ogura CMS 配制而成，均表現(xiàn)為不育，難以進行抗病基因的轉(zhuǎn)育，阻礙了抗病種質(zhì)的創(chuàng)新。近年來，已成功創(chuàng)制了甘藍型油菜、芥菜型油菜、甘藍的Ogura CMS 恢復(fù)系（Primard-Brisset et al.，2005；Tian et al.，2014；于海龍 等，2021），可以恢復(fù)抗病Ogura CMS 品種的育性，加快甘藍抗根腫病新品種的育種進程。本試驗利用Ogura CMS 育性恢復(fù)材料Z92（含有育性恢復(fù)基因Rfo）對GY306 進行育性恢復(fù)，獲得了3 份既含有抗根腫病基因又含有Rfo恢復(fù)基因的可育甘藍材料，為今后的甘藍抗根腫病育種奠定了基礎(chǔ)。