鐘玉旺，徐萬(wàn)莉，范堯珠，黎依艷，王雪峰,

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.麗江職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 麗江 674100；3.資陽(yáng)環(huán)境科技職業(yè)學(xué)院，四川 資陽(yáng) 641300）

高血壓為常見(jiàn)的慢性心血管疾病，是誘發(fā)腦梗死、腎衰竭、心肌梗死等疾病的危險(xiǎn)因素之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)心血管疾病導(dǎo)致死亡的原因占人類死亡原因的30%[1]。目前，常見(jiàn)的降壓藥物如沙坦類、平地類、普利類等雖然具有顯著的降壓效果，但長(zhǎng)期服用降壓藥容易引起腎衰竭、心衰竭等慢性疾病的發(fā)生[2]。尋找低副作用高降壓效果的替代品已迫在眉睫。研究報(bào)道天然來(lái)源的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）抑制肽與人工合成藥物相比無(wú)副作用且獲取來(lái)源較廣，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)玉米[3]、核桃[4]、龍須菜[5-6]、南瓜籽[7]、辣木葉[8]等都含有ACE抑制肽。近年來(lái)，我國(guó)多肽類降壓食品、藥品商品化過(guò)程正在推進(jìn)，天然食品中的ACE抑制肽活性高、安全好，沒(méi)有降壓藥物的毒副作用。天然來(lái)源ACE抑制肽將成為未來(lái)多肽類降壓食品的主力軍，同樣也是研究降壓藥物極好的切入點(diǎn)。因此，篩選出降壓活性強(qiáng)、安全性高、穩(wěn)定性好的ACE抑制肽，充分發(fā)揮其低毒高效的生物利用度，成為未來(lái)主要的研究方向。

辣木（Moringa oleifera）主要分布在熱帶與亞熱帶地區(qū)，目前在我國(guó)臺(tái)灣、海南、云南等地均有種植，云南種植面積達(dá)到全國(guó)的70%[9]。辣木除了“三高”（高蛋白質(zhì)、高鈣、高維生素），還富含多種氨基酸、礦物質(zhì)、維生素等人體必需營(yíng)養(yǎng)成分[10]。其中，辣木籽富含蛋白質(zhì)（37.8%）、油脂、維生素、多糖、礦質(zhì)元素等營(yíng)養(yǎng)成分，其食用功能和藥用價(jià)值使辣木籽成為極具開(kāi)發(fā)前景的食品資源[11]。在辣木籽研究方面，國(guó)內(nèi)外進(jìn)行了較為深入的研究，且主要集中在黃酮、多糖、蛋白和辣木籽油的提取及其在抗氧化、抗菌、抗腫瘤、抗炎、降脂和改善糖尿病等方面的功效[12-14]。其中陳冰冰等[15]通過(guò)優(yōu)化酶解工藝從富硒辣木籽中發(fā)現(xiàn)其中含有較強(qiáng)ACE抑制活性的肽組分；Aderinola等[16]使用胰蛋白酶水解辣木籽蛋白，也產(chǎn)生具有潛在抗高血壓特性的肽組分，但兩者均未對(duì)該類肽組分進(jìn)行分離鑒定和體外活性評(píng)價(jià)。

本實(shí)驗(yàn)前期以辣木籽蛋白為原料，通過(guò)超聲波輔助酶法獲得了具有較好ACE抑制率的酶解產(chǎn)物[17]。本研究將以該酶解產(chǎn)物為研究對(duì)象，以ACE抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)膜分離技術(shù)、強(qiáng)陰離子交換層析分離蛋白肽成分，通過(guò)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）結(jié)合生物信息學(xué)鑒定篩選出潛在的ACE抑制肽，利用分子對(duì)接進(jìn)一步分析ACE抑制肽的作用機(jī)制，解析其二級(jí)結(jié)構(gòu)特征及體外活性，旨在為辣木籽降壓肽產(chǎn)品或相關(guān)功能性食品的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木籽由云南天佑科技開(kāi)發(fā)有限公司提供。

三羥甲基氨基甲烷、堿性蛋白酶（200 U/mL）、N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸（N-[3-(2-furyl)acryloyl]-Phe-Gly-Gly，F(xiàn)APGG）、ACE上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈（均為分析純）默克股份兩合公司；鹽酸 川東化工有限公司；乙酸乙酯 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；三氟乙酸（純度99.5%）山東西亞化學(xué)股份有限公司；四甲基偶氮噻唑藍(lán)（3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT）、Q-瓊脂糖凝膠FF北京索萊寶科技有限公司；DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）緩沖液培養(yǎng)基、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

L580R高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；SCIENTZ-18N真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；LC20020985手持pH計(jì) 上海力辰邦西儀器科技有限公司；R-BIOPHARMWEL1酶標(biāo)儀、Easy-nLC 1200 HPLC儀、Q Exactive高分辨質(zhì)譜儀、色譜柱Trap column RP-C18（100 μm×20 mm，5 μm）美國(guó)賽默飛世爾科技公司；DBS-100全自動(dòng)部分收集器上海滬西分析儀器廠有限公司；1200 HPLC儀 美國(guó)安捷倫公司；Scientz-50 C多功能恒溫超聲波萃取儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；UFSC40001攪拌式超濾裝置紅衫設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 辣木籽蛋白提取

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)[14]提取辣木籽蛋白。

1.3.2 辣木蛋白酶解液的制備

采用實(shí)驗(yàn)前期的超聲波輔助酶法制備辣木籽蛋白酶解液[14]，最佳制備條件為超聲功率500 W、超聲酶解時(shí)間1.7 h、超聲酶解溫度55 ℃、辣木籽粉與0.3 mol/L氯化鈉溶液料液比1∶45（g/mL）、pH 9。

1.3.3 辣木籽酶解液的膜分離

采用截留分子質(zhì)量分別為3、5、10 kDa的超濾膜對(duì)辣木籽蛋白酶解液進(jìn)行超濾分離，收集截留液，冷凍干燥后，測(cè)定其ACE抑制率并收集抑制率較高的截留組分[17]。

1.3.4 ACE抑制活性的測(cè)定

參照Yang Yijie等[18]的方法，使用pH 8.2、80 mmol/L HEPES緩沖液配制1 mmol/L的FAPGG溶液和0.1 U/mL的ACE溶液和樣品溶液，按照表1在96 孔板中加入各試劑，在37 ℃預(yù)熱5 min后在340 nm波長(zhǎng)處借助酶標(biāo)儀測(cè)定樣品孔和空白孔的吸光度A1和B1，37 ℃恒溫反應(yīng)30 min后再次測(cè)定吸光度A2和B2。ACE抑制率計(jì)算如式（1）所示：

表1 ACE抑制率體外檢測(cè)反應(yīng)體系組成Table 1 Composition of reaction system for in vitro assay of ACE inhibitor activity

式中：ΔA（ΔA＝A1-A2）為樣品孔溶液在340 nm波長(zhǎng)處的吸光度減少值；ΔB（ΔB＝B1-B2）為空白孔溶液在340 nm波長(zhǎng)處的吸光度減少值。

1.3.5 強(qiáng)陰離子交換柱層析

參考李亞會(huì)等[19]的方法，將ACE抑制率最高的超濾截留組分用pH 9.5、0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖溶液配成5 mg/mL的樣品溶液。用緩沖液平衡強(qiáng)陰離子交換12 h后上樣30 mL，在檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm處分別以0.07、0.018、1 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集各洗脫組分后冷凍干燥，測(cè)定其ACE抑制率。

1.3.6 HPLC-MS/MS鑒定

參考石徑[20]的方法，采用HPLC法分析檢測(cè)超濾組分中多肽的組成。

HPLC條件：A液為0.1%甲酸-水溶液，B液為0.1%甲酸-乙腈溶液。色譜柱Trap column RP-C18（100 μm×20 mm，5 μm）以100%的A液平衡，流速為300 nL/min，洗脫時(shí)間30 min。

MS條件：檢測(cè)方式：使用前經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)校正液校正，母離子掃描范圍：m/z350～2 000，質(zhì)譜掃描方式為信息依賴的采集工作模式下，每次全掃描后采集最強(qiáng)的20 個(gè)碎片圖譜，碎裂方式：高能碰撞解離，歸一化碰撞能量28，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間25 s。MS1在m/z200時(shí)分辨率70 000，自動(dòng)增益控制目標(biāo)設(shè)置為3×106，最大注射時(shí)間100 ms，MS2分辨率設(shè)置為17 500，AGC target設(shè)置為1×105，最大注射時(shí)間50 ms。利用PEAKS Studio軟件分析活性肽序列并對(duì)比數(shù)據(jù)庫(kù)（PeptideRanker、lamu gene pep+uniprotlamu）篩選潛在的ACE抑制肽。

1.3.7 分子對(duì)接技術(shù)

參照管驍?shù)萚21]方法，從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/）獲得ACE天然晶體的3D結(jié)構(gòu)（PDB ID：1O8A）作為受體，使用HPEPDOCK將篩選所得的肽與ACE天然晶體結(jié)構(gòu)對(duì)接以研究它們的結(jié)合模式。使用Pymol 2.3.0刪除其3D晶體結(jié)構(gòu)中的水分子和雜原子，保留Zn2＋和Cl-。將蛋白結(jié)構(gòu)導(dǎo)入LIGPLOT（v2.2.4）進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷、分配電荷、指定原子類型。以Zn原子為活性中心，定義活性坐標(biāo)（X：38.977；Y：38.645；Z：50.183），對(duì)接半徑為0.375 ?。其余參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。挑選出最低結(jié)合能的復(fù)合物為最有利的結(jié)合方式，并采用 Pymol 2.3.0將對(duì)接結(jié)果可視化。將確定的氨基酸序列委托安徽國(guó)平藥業(yè)有限公司采用固相法合成ACE抑制肽（純度＞95%）。

1.3.8 傅里葉變換紅外光譜測(cè)定辣木籽ACE抑制肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)

采在1 mg冷凍干燥的合成肽粉末中加入100 mg的溴化鉀，使用瑪瑙研缽研磨15～20 min后壓制成1～2 mm的薄片，在14 kg的壓力下保持1 min，迅速放入傅里葉變換紅外光譜儀光路中進(jìn)行掃描。設(shè)置掃描波數(shù)譜段范圍400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1空氣作為背景，在波數(shù)精度0.01 cm-1條件下掃描64 次。利用PeakFit V4.12軟件分析譜圖，采用Gauss峰形進(jìn)行擬合后估算出子峰的位置和個(gè)數(shù)，根據(jù)各子峰與二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)關(guān)系，利用積分面積計(jì)算各二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。

1.3.9 酶抑制動(dòng)力學(xué)分析

對(duì)合成肽的半抑制濃度（IC50）進(jìn)行測(cè)定，參照He Rong等[22]的方法對(duì)辣木籽ACE抑制動(dòng)力學(xué)進(jìn)行分析。將ACE的底物抑制劑（FAPGG）等比配制為1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mmol/L的濃度。按照1.3.4節(jié)體外活性測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，以酶促反應(yīng)速率（1/V）倒數(shù)為縱坐標(biāo)與底物濃度倒數(shù)（1/S）為橫坐標(biāo)制作作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，計(jì)算米氏常數(shù)Km和最大酶促反應(yīng)速率Vmax。

1.3.10 MTT實(shí)驗(yàn)

參考姚興梅等[23]的方法稍作修改，測(cè)定辣木籽ACE抑制肽對(duì)人肝癌細(xì)胞（HepG2）的抑制作用。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞傾去培養(yǎng)液，加入5 mL磷酸鹽緩沖進(jìn)行清洗，使用l mL胰蛋白酶-EDTA消化3 min，加人2 mL無(wú)血清的DMEM（緩沖液培養(yǎng)基）終止消化反應(yīng)。以1 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心3 min，去除上清液，調(diào)整為5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接于96 孔板中（每孔200 μL）。細(xì)胞完全貼壁后，實(shí)驗(yàn)組加入100 μL的辣木籽ACE抑制肽溶液（0.01、0.05、0.1、0.5、1 mg/mL），放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，在避光環(huán)境下每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL）試劑，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄上清液，最后在每孔中加入150 μL的DMSO溶液，37 ℃以600 r/min的速率振搖10 min，使用酶標(biāo)儀在25 ℃、490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下：

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2015軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，Origin 2018對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，使用Adobe Illustrator CS6處理圖像，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)表示為。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木籽蛋白水解物膜分離組分的活性測(cè)定

由圖1A可知，酶解液與4 個(gè)超濾組分均具有一定的ACE抑制率，在質(zhì)量濃度為0.25～4 mg/mL范圍內(nèi)，各超濾組分的ACE抑制能力隨質(zhì)量濃度的上升而增強(qiáng)，且相同質(zhì)量濃度下＜3 kDa的超濾組分具有最高的ACE抑制率，＞10 kDa的超濾組分ACE抑制率最低，這與Abdelhedi[24]、Li Meiqing[25]等發(fā)現(xiàn)酶解物中低分子質(zhì)量肽組分具有更高ACE抑制活性的結(jié)果一致。由圖1B可知，＜3 kDa的超濾組分與其他組分相比，其IC50值更低，可能原因是低分子質(zhì)量肽組分氨基酸鏈較短、空間位阻小，更易進(jìn)入ACE活性口袋而改變ACE的催化活性[26]。

圖1 不同截留分子質(zhì)量的辣木籽ACE抑制肽的活性抑制率（A）和IC50值（B）Fig.1 ACE inhibitory rates (A) and IC50 values (B) of peptides derived from M.oleifera seeds

2.2 強(qiáng)陰離子交換柱層析分離組分活性測(cè)定

離子交換層析法根據(jù)離子交換能力的不同分離目標(biāo)化合物，已被廣泛應(yīng)用于分離蛋白質(zhì)水解物中的肽段。本研究將分子質(zhì)量＜3 kDa肽組分在214 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，洗脫體積為70～240、270～320、380～430、590～730 mL的條件下進(jìn)行檢測(cè)，分析該組分的洗脫峰個(gè)數(shù)及其ACE抑制率和IC50值，結(jié)果如圖2所示。

圖2 強(qiáng)陰離子交換柱層析圖（A）及不同洗脫峰的辣木籽ACE抑制肽的活性抑制率（B）和IC50值（C）Fig.2 Strong anion exchange column chromatogram of peptide fraction less than 3 kDa shown in Fig.1 (A),and ACE inhibitory rates (B) and IC50 values (C) of its subfractions

由圖2A可知，從＜3 kDa超濾組分中獲得了4 個(gè)洗脫峰F-a～d。圖2B顯示F-a、F-b、F-c組分在質(zhì)量濃度0.25～4 mg/mL范圍內(nèi)，ACE抑制率隨質(zhì)量濃度的上升而增強(qiáng)，其中以F-b組分的ACE抑制率最高，F(xiàn)-d組分幾乎沒(méi)有活性抑制能力。圖2C表明F-b組分的IC50值（0.037 mg/mL）低于F-a和F-c組分，且明顯低于＜3 kDa的超濾組分（0.65 mg/mL），說(shuō)明柱層析分離純化效果顯著，其活性要優(yōu)于耿雪冉[27]從三色雷蘑中分離純化得到的ACE抑制肽組分（IC50＝1.64 mg/mL）。

2.3 HPLC-MS/MS鑒定

由表2可知，從ACE抑制活性最好的F-b組分中共鑒定到11 條肽序列，利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)PeptideRanker（http://bioware.ucd.ie/～compass/biowareweb/）、Toxin Pred（http://web.expasy.org/protparam/）、Expasy-Compute（https://web.expasy.org/compute）和Pepdraw（http://www.tulane.edu/～biochem/WW/PepDraw）分別預(yù)測(cè)了11 條肽的分子質(zhì)量、溶解性、毒性和疏水性比例。研究表明良好水溶性ACE抑制肽有利于腸道吸收[28]。根據(jù)溶解性分析發(fā)現(xiàn)QGPRPQ、PPKKKFRTGV、DPNNFT具有較好的水溶性，證明它們?cè)谒芤褐休^穩(wěn)定，能夠被腸道快速吸收，其可能具有較高的ACE抑制率，其二級(jí)質(zhì)譜圖如圖3所示，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖4所示。

圖3 肽QGPRPQ、PPKKKFRTGV、DPNNFT二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.3 Secondary mass spectra and structures of peptides QGPRPQ,PPKKKFRTGV and DPNNFT

圖4 肽QGPRPQ、PPKKKFRTGV、DPNNFT結(jié)構(gòu)圖Fig.4 Structural formulae of peptides QGPRPQ,PPKKKFRTGV and DPNNFT

表2 F-b組中具有ACE抑制活性的肽段部分理化性質(zhì)Table 2 Selected physicochemical properties of peptides with ACE inhibitory peptide F-b shown in Fig.2

2.4 分子對(duì)接

為進(jìn)一步從鑒定到的3 條肽中篩選出潛在的ACE抑制肽，采用分子對(duì)接技術(shù)研究QGPRPQ、PPKKKFRTGV、DPNNFT（配體）分別與1O8A（受體蛋白）之間的結(jié)合模式和結(jié)合力，其對(duì)接構(gòu)象圖如圖5所示。

圖5 肽QGPRPQ（A）、PPKKKFRTGV（B）、DPNNFT（C）與ACE對(duì)接構(gòu)象圖Fig.5 Conformation diagrams of peptides QGPRPQ (A),PPKKKFRTGV (B),DPNNFT (C) docking with ACE

由表3可知，QGPRPQ、PPKKKFRTGV、DPNNFT與1O8A的對(duì)接打分值分別為-176.353、-236.175、-174.517，均低于繆雨露[29]的四肽打分值（-12.12）。一般受體與配體結(jié)合打分值越低，則結(jié)合能力越強(qiáng)[29]，表明肽QGPRPQ、PPKKKFRTGV、DPNNFT能與ACE結(jié)合。ACE的活性中心由S1（Ala354、Glu384和Tyr523）、S2（Gln281、His353、Lys511、His513和Tyr520）和S′（Glu162）活性口袋構(gòu)成，往往活性肽與ACE活性中心殘基Trp279、Gln281、His353、Ala354、Ser355、Ala356、His383、Glu384、Glu411、Asp415、Lys454、Phe457、Lys511、His513、Tyr520、Tyr523形成氫鍵可以產(chǎn)生高ACE抑制活性，而疏水作用又與兩者結(jié)合的穩(wěn)定性密切相關(guān)[30-32]。本研究中，肽QGPRPQ與ACE殘基His387、Tyr394、Asp358、Val399、Arg402、Glu403、Tyr360、Tyr523、Glu411、His383可形成10 個(gè)氫鍵，其中對(duì)活性位點(diǎn)的關(guān)鍵氨基酸殘基Tyr523形成氫鍵作用力，表明QGPRPQ能與S1活性口袋緊密結(jié)合而顯示較好的ACE抑制活性，這與俞君杰等[33]研究的肽TTW結(jié)果一致。同時(shí)QGPRPQ與ACE的14 個(gè)氨基酸殘基具有疏水作用，則有利于提高復(fù)合物的穩(wěn)定性。另外，肽PPKKKFRTGV與ACE殘基Val518、Tyr213、Glu225、Lys118、Val119、Asn66、Asp358、Val399可形成8 個(gè)氫鍵，但未與ACE活性中心的3 個(gè)活性口袋形成氫鍵，表明其ACE抑制活性較差。而肽DPNNFT與ACE殘基Tyr360、Ala356、Asn70、Glu143、Leu139、Ser516、Asn66則形成了7 個(gè)氫鍵，其中與活性中心殘基Ala356形成了氫鍵作用力，表明DPNNFT能與S1活性口袋緊密結(jié)合形成較好的ACE抑制活性，且可與ACE的7 個(gè)殘基形成疏水作用。一般來(lái)說(shuō)，活性肽與ACE形成氫鍵和疏水作用的氨基酸殘基數(shù)越多，其ACE抑制活性越高，更具結(jié)合穩(wěn)定性[34]。此外，肽段的長(zhǎng)度和內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)可能會(huì)影響活性口袋中的特征性氨基酸形成氫鍵和疏水作用。因此，肽QGPRPQ表現(xiàn)出更好的ACE抑制活性和結(jié)合穩(wěn)定性。

表3 肽PPKKKFRTGV、DPNNFT、QGPRPQ與1O8A蛋白的分子對(duì)接分析Table 3 Molecular docking analysis of peptides PPKKFRTGV,DPNNFT and QGPRPQ with 1O8A protein

為進(jìn)一步明確肽QGPRPQ 的體外ACE 抑制活性，采用固相合成法進(jìn)行化學(xué)合成，該合成肽的HPLC圖和一級(jí)質(zhì)譜圖如圖6所示，測(cè)定其IC50值為（1.15±0.3）mmol/L，低于Guo Yuxing等[35]從乳清蛋白酶解物中鑒定到的二肽KA（IC50＝（24±0.01）mmol/L）、EN（IC50＝（1.43±0.04）mmol/L）和三肽DIS（IC50＝（1.59±0.27）mmol/L）、EVD（IC50＝（1.32±0.05）mmol/L）、LF（IC50＝1.60±0.39）mmol/L）、AIV（IC50＝（2.66±0.02）mmol/L）、VFK（IC50＝（11.76±0.09）mmol/L），但高于湯海霞[36]從綿羊乳酪蛋白酶解物中鑒定到的肽LFRQFY（IC50值為（7.9±1.7）μmol/L），說(shuō)明肽QGPRPQ是一種潛在的ACE抑制肽。

圖6 肽QGPRPQ的HPLC圖（A）和一級(jí)質(zhì)譜圖（B）Fig.6 HPLC (A) and primary mass spectrum (B) of peptide QGPRPQ

2.5 肽QGPRPQ的二級(jí)結(jié)構(gòu)解析

傅里葉變換紅外光譜在測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)蛋白內(nèi)部不同的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)會(huì)選擇性吸收不同的紅外波長(zhǎng)，產(chǎn)生不同的特征吸收峰。通常利用酰胺I帶分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，酰胺I帶與蛋白肽鏈骨架的有序程度緊密相關(guān)，酰胺I帶吸收峰波數(shù)越大，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有序度越高[37]。通過(guò)PeakFit v4.12軟件擬合肽QGPRPQ的原始光譜（圖7），在酰胺I帶范圍內(nèi)，擬合了7 個(gè)子峰。通過(guò)對(duì)吸收峰面積變化計(jì)算蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量，得出該肽由22.8%α-螺旋、33.3%β-折疊和43.9%β-轉(zhuǎn)角構(gòu)成。研究發(fā)現(xiàn)，通常肽二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-轉(zhuǎn)角中含有較多的氫鍵是較有序、規(guī)則的結(jié)構(gòu)[38]，表明肽QGPRPQ結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。

圖7 肽QGPRPQ酰胺I帶（1 600～1 700 cm－1）譜圖Fig.7 Infrared spectra of amide I band of peptide QGPRPQ (1 600–1 700 cm-1)

2.6 肽QGPRPQ的酶抑制動(dòng)力學(xué)分析

通過(guò)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖探究肽QGPRPQ抑制ACE的動(dòng)力學(xué)模式。如圖8和表4所示，Vmax和Km值都隨著抑制肽濃度的增加而降低。研究表明，Lineweaver-Burk的雙倒數(shù)作圖若隨著抑制物濃度的增加，其Vmax減小、Km增大或減小，則該抑制物的抑制類型屬于混合型抑制[39]。另外，混合型ACE抑制肽可以與ACE的活性和非活性位點(diǎn)結(jié)合，從而降低了血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的催化活性[40]。由此表明，肽QGPRPQ的抑制類型為混合型抑制，這與湯海霞等[36]從綿羊乳酪蛋白篩選出的肽LFRQFY和Zarei等[41]從棕櫚仁蛋糕分離出的肽YLLLK、WAFS和GVQEGAGHYALL都屬于相同的酶抑制類型。

圖8 肽QGPRPQ對(duì)ACE的Lineweaver-Burk圖Fig.8 Lineweaver-Burk plot for ACE inhibition by peptide QGPRPQ

表4 肽QGPRPQ不同濃度Vmax和Km值Table 4 Vmax and Km values of peptide QGPRPQ at different concentrations

2.7 肽QGPRPQ對(duì)HepG2的抑制作用

采用MTT法測(cè)定肽QGPRPQ對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果如圖9所示。隨著肽QGPRPQ質(zhì)量濃度的增加，HepG2細(xì)胞的存活率顯示下降趨勢(shì)；當(dāng)肽質(zhì)量濃度低于0.01 mg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞存活率幾乎為100%；而當(dāng)肽QGPRPQ質(zhì)量濃度達(dá)到0.05 mg/mL以上時(shí)，細(xì)胞存活率均低于90%，表明肽QGPRPQ已明顯抑制了HepG2細(xì)胞的增殖。綜上所述，肽QGPRPQ在質(zhì)量濃度低于0.01 mg/mL時(shí)，對(duì)HepG2細(xì)胞無(wú)毒性作用。

圖9 肽QGPRPQ對(duì)人肝癌細(xì)胞的抑制作用Fig.9 Inhibitory effect of peptide QGPRPQ on human hepatoma cells

3 結(jié)論

從辣木籽蛋白酶解產(chǎn)物中分離鑒定到11 條肽序列，其中肽QGPRPQ、PPKKKFRTGV、DPNNFT均具有較好的水溶性，分子對(duì)接顯示肽QGPRPQ與ACE的S1活性口袋的氨基酸殘基緊密結(jié)合，與ACE活性中心殘基形成氫鍵和疏水鍵作用，可以較好地抑制ACE活性，是潛在的ACE抑制肽，其IC50值為（1.15±0.3）mmol/L。該ACE抑制肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋（22.8%）、β-折疊（33.3%）和β-轉(zhuǎn)角（43.9%）結(jié)構(gòu)組成，酶抑制模型為混合型抑制，且在質(zhì)量濃度低于0.01 mg/mL時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性。本研究為辣木籽蛋白源降壓肽的開(kāi)發(fā)利用提供重要的理論參考，但仍需進(jìn)一步明確不同液體條件下該ACE抑制肽的構(gòu)效關(guān)系，并開(kāi)展體內(nèi)降壓效果評(píng)價(jià)。