李夢(mèng)凡，陳小紅，朱立民，李紅娟，鄒旸*

（1.天津海河乳品有限公司，天津 300457；2.天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

牛乳是一種營(yíng)養(yǎng)全面的食品，富含蛋白質(zhì)、脂肪等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是微生物的天然培養(yǎng)基。因此，生牛乳必須經(jīng)過(guò)熱處理，以保證產(chǎn)品的安全性并延長(zhǎng)貨架期[1-2]。但是熱處理會(huì)使得牛奶的口感和營(yíng)養(yǎng)成分明顯下降，根據(jù)不同強(qiáng)度的熱處理，牛乳中眾多的熱不穩(wěn)定物質(zhì)會(huì)發(fā)生物理化學(xué)反應(yīng)，例如乳糖降解為有機(jī)酸和乳果糖、乳清蛋白的變性、某些維生素和酶被破壞、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的水解以及美拉德反應(yīng)生成不良物質(zhì)等[3]。巴氏殺菌乳是一種低溫殺菌的乳品，根據(jù)NY/T 939—2016《巴氏殺菌乳和UHT 滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》對(duì)巴氏殺菌的定義是為有效殺滅病原性微生物而采用的加工方法，即經(jīng)低溫長(zhǎng)時(shí)間（63～65 ℃保持30 min）或經(jīng)高溫短時(shí)間（72～76 ℃保持15 s 或80～85 ℃保持10～15 s）的處理方式。目前乳品企業(yè)多采用高溫短時(shí)間的巴氏殺菌方式，且為了延長(zhǎng)產(chǎn)品的保質(zhì)期，多偏好于85 ℃殺菌[4-5]。巴氏殺菌乳的殺菌條件溫和，可以最大程度地保留牛乳的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和口感。

乳清蛋白約占牛乳蛋白質(zhì)總量的20%，包括β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）、α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-La）、乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）等[6]。乳清蛋白在牛乳滅菌過(guò)程中極易變性，變性后的乳清蛋白喪失了免疫調(diào)節(jié)和抑菌等生理功能，并影響人體對(duì)牛乳中鈣的吸收[7]。β-Lg 是乳清蛋白中最常見(jiàn)的蛋白質(zhì)，占乳清蛋白總量的58%，含有162 個(gè)氨基酸，分子量約為18 300 Da。β-Lg 有兩個(gè)基因變體A 和B，不同之處在于變體B 中的甘氨酸取代了變體A 中的天冬氨酸[8]。天然的β-Lg呈現(xiàn)三維結(jié)構(gòu)，研究表明：當(dāng)溫度大于65 ℃時(shí)，β-Lg會(huì)展開(kāi)并與κ-酪蛋白在膠束表面形成二硫鍵與酪蛋白膠束聚集。α-La 是乳清蛋白中第二豐富的蛋白質(zhì)，占乳清蛋白的13%，由123 個(gè)氨基酸組成，分子量為14 146 Da。在較高的溫度下（70～96 ℃），α-La 發(fā)生變性，與β-Lg 聚集體形成絡(luò)合物，變性的α-La 在高溫下也會(huì)與αS2-酪蛋白和乳脂肪球膜形成復(fù)合物[9-10]。LF是一種單肽鏈的多功能糖蛋白，分子量約為80 kDa，大約有690 個(gè)氨基酸殘基，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)骨髓細(xì)胞生成和促進(jìn)人體對(duì)鐵吸收的功能。LF 以溶解狀態(tài)存在于牛乳中，通過(guò)氫鍵、二硫鍵、配體結(jié)合等來(lái)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，在一定的溫度條件下，這些結(jié)構(gòu)穩(wěn)定力會(huì)受到影響。研究發(fā)現(xiàn)，在65 ℃下以自然的pH 值加熱牛奶30 min，LF 不會(huì)明顯變性，但在85 ℃下加熱30 min LF 明顯變性，其生物活性大大下降。LF 變性會(huì)改變其三維結(jié)構(gòu)，從而改變其功能性質(zhì)，例如鐵結(jié)合能力和抗菌活性[11]。

巴氏殺菌的目的是將細(xì)菌病原體的數(shù)量減少到對(duì)公共衛(wèi)生安全的水平，并使牛乳的感官、物理和化學(xué)變化最小化，最大程度保留牛奶中的活性物質(zhì)。因此為了避免牛乳的過(guò)度加工、最大程度保留牛乳中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及從安全的角度判斷加熱是否充足，本試驗(yàn)采用市場(chǎng)上巴氏殺菌乳最普遍的殺菌方法，即高溫短時(shí)間的殺菌方法（72～85 ℃/15 s），利用高效液相色譜儀對(duì)巴氏殺菌乳乳清蛋白中的LF、α-La 和β-Lg 的含量進(jìn)行測(cè)定，分析比較不同殺菌條件對(duì)牛乳中乳清蛋白的影響，以期為今后生產(chǎn)保留良好蛋白活性的巴氏殺菌乳產(chǎn)品工藝改進(jìn)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

未經(jīng)任何殺菌處理的生牛乳：天津海河乳品有限公司；乙腈、甲醇（均為色譜級(jí)）、α-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥85%）、β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥90%）、乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥85%）：美國(guó)Sigma 公司；三氟乙酸、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉（均為色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；0.22 μm 微孔濾膜：美國(guó)安捷倫科技公司；HiTrap Heparin HP 親和層析柱（1 mL）：思拓凡生物科技公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂、嗜冷菌計(jì)數(shù)瓊脂：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；試驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

液態(tài)乳小試生產(chǎn)線：上海沃迪智能裝備股份有限公司；MikoScan FT2 多功能乳品分析儀：丹麥福斯公司；1260 Infinity II 高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技公司；Synergy 超純水儀：美國(guó)密理博公司；H1750R 離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；XBridge Protein BEH C4 色譜柱（3.5 μm，4.6 mm×250 mm）：沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 試劑的配制

結(jié)合液：稱取30.08 g 十二水合磷酸氫二鈉和3.24 g二水合磷酸二氫鈉，加適量超純水溶解，用10 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至7.5 后，用超純水定容至500 mL。

淋洗液：稱取7.52 g 十二水合磷酸氫二鈉、0.62 g二水合磷酸二氫鈉和2.92 g 氯化鈉，加適量超純水溶解，用10 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至7.5 后，用超純水定容至500 mL。

洗脫液：稱取7.52 g 十二水合磷酸氫二鈉、1.63 g二水合磷酸二氫鈉和59.65 g 氯化鈉，加適量超純水溶解，用10 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至7.5 后，用超純水定容至500 mL。

三氟乙酸溶液：取1 mL 三氟乙酸，用超純水定容至1 L。

三氟乙酸乙腈溶液：取1 mL 三氟乙酸，用乙腈定容至1 L。

1.4 方法

1.4.1 巴氏殺菌乳的制備

樣品在牧場(chǎng)（天津市濱海新區(qū)）的運(yùn)奶車上采集。使用液態(tài)乳小試生產(chǎn)線對(duì)生牛乳（RM）進(jìn)行巴氏殺菌，熱加工的工藝條件分別為72、75、80、85 ℃加熱15 s。

熱加工工藝步驟：生牛乳→一段加熱至60 ℃→均質(zhì)[（20±1）MPa]→二段加熱至所需的殺菌溫度→保持管中保持15 s→冷卻→潔凈罐裝→4 ℃冰箱冷藏。

1.4.2 巴氏殺菌乳中微生物的檢測(cè)

巴氏殺菌乳中菌落總數(shù)的測(cè)定參照GB 4789.2—2022《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[12]；嗜冷菌的測(cè)定參照NY/T 1331—2007《乳與乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜熱需氧芽孢數(shù)的測(cè)定》[13]。

1.4.3 巴氏殺菌乳中理化指標(biāo)的檢測(cè)

巴氏殺菌乳中蛋白質(zhì)和脂肪使用MikoScan FT2多功能乳品分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.4 巴氏殺菌乳中乳鐵蛋白的檢測(cè)

檢測(cè)方法參考陳美霞[1]的方法并稍作修改，具體如下。

1.4.4.1 LF 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制

將LF 標(biāo)準(zhǔn)品按照純度換算后稱量，用水溶解并定容至10 mL，配制成10 mg/mL 的儲(chǔ)備液。吸取儲(chǔ)備液200 μL，用水定容至10 mL，配制成200 mg/L 中間液。用洗脫液將中間液稀釋成LF 濃度分別為5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。以LF 的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4.2 LF 樣品前處理

稱取巴氏殺菌乳6 g（精確到0.01g），加入結(jié)合液定容至30 mL，混勻。溶液在4 ℃下12 000 r/min 離心15 min，避開(kāi)上層脂質(zhì)和下層沉淀，移取中間層試液，經(jīng)玻璃纖維濾紙過(guò)濾，收集濾液待凈化。親和層析柱使用前先用10 mL 水沖洗，之后用10 mL 的淋洗液活化。處理完畢后移取10 mL 濾液過(guò)柱，之后用10 mL 淋洗液淋洗，最后用4.5 mL 洗脫液洗脫，并用洗脫液定容至5.0 mL，渦旋混勻，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜后待測(cè)。

1.4.4.3 LF 色譜條件

色譜柱：Xbridge Protein BEH C4 柱（3.5 μm，4.6 mm×250 mm）。流動(dòng)相A：三氟乙酸溶液，流動(dòng)相B：三氟乙酸乙腈溶液；梯度洗脫：0～6.5 min 95% A；6.5～12.0 min 62% A；12.0～15.5 min 40% A；15.5～20 min 95% A。流速1.5 mL/min，柱溫60 ℃，進(jìn)樣量30 μL，使用紫外檢測(cè)器在波長(zhǎng)280 nm 下進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.4.4 LF 結(jié)果計(jì)算

試樣中LF 含量按下式計(jì)算。

式中：X 為試樣中LF 含量，mg/kg；c 為被測(cè)組分曲線計(jì)算濃度，mg/L；V3為樣液最終定容體積，mL；V1為試樣處理液總體積，mL；m 為試樣質(zhì)量，g；V2是樣液過(guò)柱體積，mL。

1.4.5 巴氏殺菌乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的檢測(cè)

檢測(cè)方法參考陳美霞[1]的方法并稍作修改。

1.4.5.1 α-La 和β-Lg 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制

將α-La 和β-Lg 標(biāo)準(zhǔn)品按照純度換算后稱量，用水溶解并定容至10 mL，配制成10 mg/mL 的儲(chǔ)備液。吸取儲(chǔ)備液200 μL，用水定容至10 mL，配制成200 mg/L中間液。用水將中間液稀釋成α-乳白蛋白和β-乳球蛋白濃度為0.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。以α-La 和β-Lg 的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.5.2 α-La 和β-Lg 樣品前處理

稱取巴氏殺菌乳5 g（精確到0.01 g），加水定容至25.0 mL，混勻，加入乙酸調(diào)節(jié)pH 值為4.60，混勻靜置1 h 后，12 000 r/min 離心15 min。吸取上清液1 mL，用水定容至5 mL，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜后待測(cè)。

1.4.5.3 α-La 和β-Lg 色譜條件

色譜柱：Xbridge Protein BEH C4 柱。流動(dòng)相A：三氟乙酸溶液，流動(dòng)相B：三氟乙酸乙腈溶液；梯度洗脫：0～6.5 min 95% A；6.5～12.0 min 62% A；12.0～15.5 min 40%A；15.5～20 min 95% A。流速1.5 mL/min，柱溫60 ℃，進(jìn)樣量30 μL，使用紫外檢測(cè)器在波長(zhǎng)210 nm 下進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.5.4 結(jié)果計(jì)算

試樣中α-La 和β-Lg 含量按下式計(jì)算。

式中：Y 為試樣中α-La 或β-Lg 含量，mg/kg；c 為被測(cè)組分曲線計(jì)算濃度，mg/L；V 為樣液最終定容體積，mL；m 為試樣質(zhì)量，g。

1.5 數(shù)據(jù)處理

以上試驗(yàn)分別取樣重復(fù)測(cè)定3 次，采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，P＜0.05 時(shí)表示差異顯著，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Origin 8.0 軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱加工工藝對(duì)巴氏殺菌乳微生物的影響

嗜冷菌是一類能夠在7 ℃或更低溫度下生長(zhǎng)的一類細(xì)菌的總稱。嗜冷菌并不是天然存在于牛乳中的一類微生物，剛?cè)〕龅娜橹ǔ２缓锌膳囵B(yǎng)的嗜冷菌，因此嗜冷菌污染是擠奶后環(huán)境污染所造成的。在原料乳收集和運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中，嗜溫菌占據(jù)主導(dǎo)地位，但生產(chǎn)前長(zhǎng)時(shí)間低溫冷藏會(huì)使得生牛乳中嗜冷菌逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌群[14]。取生牛乳分別在72、75、80、85 ℃下巴氏殺菌15 s，測(cè)定其菌落總數(shù)和嗜冷菌，結(jié)果如表1 所示。

表1 不同熱加工工藝對(duì)巴氏殺菌乳中微生物的影響Table 1 Effect of different thermal processes on microorganisms in pasteurized milk

由表1 可知，殺菌前牛乳的菌落總數(shù)為25 000 CFU/mL，72 ℃殺菌后牛乳中的菌落總數(shù)降至9 200 CFU/mL，當(dāng)牛乳的殺菌溫度在80 ℃以上，牛乳中的菌落總數(shù)小于10 CFU/mL。隨著殺菌溫度的提高，巴氏殺菌乳中菌落總數(shù)隨之下降。巴氏殺菌前牛乳中的嗜冷菌數(shù)為2000CFU/mL，經(jīng)巴氏殺菌之后嗜冷菌數(shù)均小于10 CFU/mL。根據(jù)GB 19645—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)巴氏殺菌乳》的規(guī)定，巴氏殺菌乳檢出菌落總數(shù)應(yīng)小于5×104CFU/mL，而國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中并未對(duì)牛乳中嗜冷菌進(jìn)行相關(guān)規(guī)定[15]。因此正常的巴氏殺菌可以殺滅大多數(shù)的細(xì)菌，提高殺菌溫度可有效損傷細(xì)菌。殺菌是牛乳加工過(guò)程中最重要的步驟，巴氏殺菌是相對(duì)溫和的熱處理方式，巴氏殺菌可以殺死嗜冷菌，但嗜冷菌所產(chǎn)生的蛋白水解酶和脂肪水解酶具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，巴氏殺菌后這些熱穩(wěn)定酶和嗜冷菌的孢子仍然存活。而巴氏殺菌乳的腐敗是由于熱加工前生牛乳中嗜冷菌大量繁殖或是熱加工后耐熱酶和孢子存活[16]。因此只有高品質(zhì)的生牛乳才能生產(chǎn)出營(yíng)養(yǎng)豐富、貨架期長(zhǎng)的優(yōu)質(zhì)巴氏殺菌乳，生牛乳的品質(zhì)是決定巴氏殺菌乳質(zhì)量的重要因素。

2.2 熱加工工藝對(duì)巴氏殺菌乳理化指標(biāo)的影響

過(guò)度的熱加工會(huì)使蛋白質(zhì)變性、降解以及氧化和脂質(zhì)氧化等，這些反應(yīng)在貯藏期也會(huì)持續(xù)進(jìn)行，嚴(yán)重影響牛乳的品質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)高溫會(huì)使牛乳脂肪的氧化速度加快，導(dǎo)致脂肪球融化上浮，出現(xiàn)“分層”現(xiàn)象，影響牛乳品質(zhì)[17]。而溫和的巴氏殺菌并不會(huì)對(duì)牛乳造成明顯的不穩(wěn)定性。熱處理后巴氏殺菌乳中蛋白質(zhì)和脂肪的變化如圖1 所示。

圖1 熱加工工藝對(duì)巴氏殺菌乳中蛋白質(zhì)和脂肪含量的影響Fig.1 Effect of thermal processes on protein and fat in pasteurized milk

由圖1 可知，生牛乳的蛋白質(zhì)含量為3.3%，而巴氏殺菌后蛋白質(zhì)含量降至3.14%～3.15%。結(jié)果顯示，巴氏殺菌后牛乳中的蛋白質(zhì)含量會(huì)顯著下降（P<0.05）。生牛乳中脂肪含量為3.93%，巴氏殺菌后脂肪含量顯著降至3.82%～3.89%（P<0.05）。殺菌后會(huì)使牛乳中脂肪含量下降，但與蛋白質(zhì)一樣，并未隨著殺菌溫度的升高而呈現(xiàn)規(guī)律性的變化。GB 19645—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)巴氏殺菌乳》規(guī)定牛乳中蛋白質(zhì)含量應(yīng)≥2.9 g/100 g，脂肪含量應(yīng)≥3.1 g/100 g，本試驗(yàn)的巴氏殺菌乳均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求[15]。牛乳熱處理后分子內(nèi)的二硫鍵會(huì)重組形成分子間的二硫鍵，乳清蛋白變形聚集，酪蛋白、乳清蛋白和乳脂肪球膜表面蛋白會(huì)結(jié)合，乳清蛋白、乳糖和膜蛋白會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，而多不飽和脂肪酸會(huì)在乳清蛋白的催化下形成共軛異構(gòu)體[10]。巴氏殺菌后部分含巰基蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，還有一部分其他蛋白質(zhì)發(fā)生水解，形成小分子肽和游離氨基酸，從而表現(xiàn)為蛋白質(zhì)含量下降[18]。

2.3 熱加工工藝對(duì)巴氏殺菌乳乳鐵蛋白的影響

將配制好的不同濃度的LF 標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行液相分析，線性回歸方程為y=1.153 23x-3.864 65，R2=0.999 3，結(jié)果表明LF 的峰面積（mAU）及其濃度（mg/mL）呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

LF 是乳中非常重要的功能性蛋白，對(duì)熱非常敏感。生牛乳中LF 的含量受動(dòng)物的種類和健康狀況、泌乳季節(jié)、胎次等多種因素的影響，鮮牛乳中LF 的含量一般為0.02～0.20 mg/mL[1]。不同熱處理對(duì)巴氏殺菌乳L(zhǎng)F含量的影響如圖2 所示。

圖2 熱加工工藝對(duì)巴氏殺菌乳L(zhǎng)F 含量的影響Fig.2 Effect of thermal processes on lactoferrin in pasteurized milk

由圖2 可知，巴氏殺菌后牛乳中的LF 含量顯著下降（P<0.05），并且隨著殺菌強(qiáng)度的增強(qiáng)，LF 含量逐漸降低。生牛乳中的LF 含量為（107.40±4.22）mg/kg，經(jīng)過(guò)85 ℃/15s殺菌后牛乳中的LF 含量為（23.37±2.45）mg/kg。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)殺菌溫度為90 ℃以上殺菌15 s 后，牛乳中的LF 含量均小于5 mg/L[1]。在極端溫度下，LF 會(huì)變性，蛋白質(zhì)的構(gòu)象改變，影響其功能特性，如鐵結(jié)合能力和抗菌活性。LF 最重要的功能特性是抑菌以及對(duì)細(xì)菌感染有防護(hù)作用，過(guò)度的熱加工會(huì)使得LF 結(jié)構(gòu)改變、變性和降解等。研究發(fā)現(xiàn)，72 ℃/15 min 對(duì)LF 的結(jié)構(gòu)沒(méi)有影響，也不影響LF 與細(xì)菌之間的相互作用；而在超高溫瞬時(shí)滅菌乳中LF 與細(xì)菌之間的相互作用顯著下降[17]。LF 分子被折疊成2 個(gè)同源的N 末端和C 末端裂片，每個(gè)裂片都能結(jié)合一個(gè)鐵原子。根據(jù)結(jié)合在LF 分子上鐵原子的數(shù)量，LF 有幾種形式：第一種是鐵飽和型（holo-LF），N 末端和C 末端裂片都被鐵飽和；第二種是缺鐵型（apo-LF），不含鐵的形式；第三種是中間形式，兩個(gè)葉片中的任一葉片含鐵。holo-LF 結(jié)構(gòu)更緊密，更加耐熱且抗蛋白質(zhì)水解[1，19]。Sánchez 等[20]在不同的溫度下（72～85 ℃）將牛LF 在毛細(xì)管中加熱，通過(guò)差示掃描量熱儀（differential scanning calorimetry，DSC）來(lái)評(píng)估LF 的耐熱性。研究發(fā)現(xiàn)，holo-LF 的吸熱峰為雙峰，最大的吸熱溫度為74 ℃和86 ℃；而apo-LF的吸熱峰為單峰，最大吸熱溫度為61 ℃。在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，牛LF 有兩個(gè)最大的變性溫度，分別為60.4 ℃和89.1 ℃，且LF 的變性不可逆，這是因?yàn)長(zhǎng)F 在加熱過(guò)程中會(huì)與其他蛋白質(zhì)形成納米粒[21]。holo-LF 和apo-LF 兩種形式的LF 在超高溫處理后都會(huì)完全變性[22]。

2.4 熱加工工藝對(duì)巴氏殺菌乳α-La 的影響

α-La 標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程為y=23.74x-6.857 4，R2=0.999 5，線性關(guān)系良好。不同熱加工工藝對(duì)巴氏殺菌乳中α-La 的影響如圖3 所示。

圖3 熱加工工藝對(duì)巴氏殺菌乳中α-La 含量的影響Fig.3 Effect of thermal processes on α-lactalbumin in pasteurized milk

由圖3 可知，生牛乳中α-La 含量為（1 308.30±41.26）mg/kg，經(jīng)過(guò)巴氏殺菌后牛乳中依然含有大量的α-La，但與生牛乳相比已顯著下降（P<0.05），72 ℃/15 s 殺菌后的巴氏殺菌乳中α-La 含量為（1 142.98±39.89）mg/kg。α-La 在牛乳中的含量為1～1.5 g/L（約占牛乳總蛋白的3.4%），是一種熱敏性物質(zhì)，隨著熱處理強(qiáng)度的增加，α-La 的含量會(huì)逐漸降低[23]。α-La 熱變性會(huì)使其三級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞，分子內(nèi)部的二硫鍵會(huì)暴露出來(lái)，形成改性單體蛋白[24]。α-La 的變性程度與溫度有很大的關(guān)系，Jeanson 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在65 ℃下處理60 min 后α-La 基本未變性；當(dāng)加熱溫度升至75～85 ℃時(shí)，α-La的變性速率隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)而加快；當(dāng)溫度升至90 ℃時(shí)熱處理30 min 即可使天然的α-La 完全變性。Korhonen 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，α-La 的解鏈溫度為67 ℃，即在此溫度下蛋白部分變性，在72 ℃/15 s 的殺菌工藝下α-La 的活性可以保留69%。但隨著殺菌強(qiáng)度的增大，α-La 逐漸被降解，在105 ℃/15 s 的殺菌條件下α-La 的活性僅剩不到10%，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。因此在巴氏殺菌的工藝下，α-La 的變性率低，能夠在牛乳中大量保留。

2.5 熱加工工藝對(duì)巴氏殺菌乳β-Lg 的影響

β-Lg 標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程為y =24.611x-26.722，R2=0.998 2，線性關(guān)系良好。不同熱加工對(duì)巴氏殺菌乳中β-Lg 含量的影響如圖4 所示。

圖4 熱加工工藝對(duì)巴氏殺菌乳中β-Lg 含量的影響Fig.4 Effect of thermal processes on β-lactoglobulin in pasteurized milk

由圖4 可知，β-Lg 的變化規(guī)律與α-La 相似，都是隨著熱加工強(qiáng)度的增加而顯著減少（P<0.05）。生牛乳中β-Lg 的含量為（3 315.67±35.33）mg/kg，β-Lg 在80 ℃巴氏殺菌后含量急劇下降，含量?jī)H為（2 052.51±57.65）mg/kg。β-Lg 的解鏈溫度為77 ℃，75 ℃/15 s 可保留其76%的活性，85 ℃/15 s 保留其46%的活性。但通過(guò)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)95 ℃/15 s β-LgB的電泳條帶完全消失，β-LgA 電泳條在125 ℃/15 s 殺菌后消失[1，26]。Corredig 等[27]研究發(fā)現(xiàn)β-Lg 在蛋白聚集反應(yīng)中起到了關(guān)鍵性的作用，α-La 只有在β-Lg 存在時(shí)才會(huì)形成聚集體。α-La 與β-Lg 的聚集反應(yīng)與熱加工的溫度和時(shí)間有關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)，隨著熱處理時(shí)間和溫度的增加，牦牛乳清中α-La 與β-Lg 的含量顯著下降，當(dāng)熱加工溫度在80 ℃以上時(shí)，達(dá)到了β-Lg 的變性溫度，會(huì)發(fā)生蛋白聚集現(xiàn)象，這表明只有熱處理的溫度大于β-Lg 的變性溫度時(shí)才會(huì)出現(xiàn)蛋白聚合物[28]。因此在80 ℃/15 s 和85 ℃/15 s 的殺菌條件下，蛋白含量顯著下降，可能是由于α-La 和β-Lg 變性聚集。

3 結(jié)論

巴氏殺菌可殺滅牛乳中的致病微生物并減少熱加工對(duì)牛乳品質(zhì)的影響，本試驗(yàn)選擇目前市面上常用的巴氏殺菌工藝，使用高效液相色譜法檢測(cè)牛乳中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳鐵蛋白，探究不同的巴氏殺菌工藝對(duì)牛乳中微生物和乳清蛋白的影響。隨著熱加工強(qiáng)度的增加，牛乳中菌落總數(shù)和嗜冷菌的數(shù)量隨之降低，蛋白質(zhì)和脂肪的含量也顯著降低（P<0.05）。72 ℃/15 s 和75 ℃/15 s 的殺菌條件對(duì)牛乳中的3 種活性蛋白影響較?。划?dāng)殺菌溫度達(dá)到80 ℃以上，3 種活性蛋白的含量會(huì)顯著下降（P<0.05）。由此可見(jiàn)，不同的熱處理方式對(duì)巴氏殺菌乳中乳清蛋白有不同的影響。因此，在滿足產(chǎn)品安全性的前提下，應(yīng)盡可能降低殺菌處理的強(qiáng)度。本試驗(yàn)為企業(yè)生產(chǎn)出更高質(zhì)量的巴氏殺菌乳提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持。