李 凡，于振興，張 明，林 洪，李學(xué)鵬，勵(lì)建榮，張德福,

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海洋研究院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

噬菌體是一類專門裂解細(xì)菌的病毒，在自然界中種類繁多，分布廣泛，是生物界最豐富的物種之一[1]。噬菌體的概念由細(xì)菌學(xué)家Frederick Twort和Félix d’Herelle在1915年和1917年各自獨(dú)立提出，并在之后的20 年被大量報(bào)道[2]。在早期研究中人們發(fā)現(xiàn)噬菌體對(duì)細(xì)菌具有特異性的高效滅殺作用，認(rèn)為噬菌體在防治細(xì)菌感染方面具有巨大的潛力，美國(guó)、法國(guó)等西方國(guó)家逐漸開始嘗試在臨床治療中使用噬菌體并取得一定成效[3]。20世紀(jì)中期，隨著青霉素等抗生素的問世，抗生素廉價(jià)高效、簡(jiǎn)便快捷且抗菌譜廣的特點(diǎn)使其快速代替了噬菌體，關(guān)于噬菌體的相關(guān)研究逐漸減少[4]。近幾十年來，由于各種抗生素在臨床與養(yǎng)殖業(yè)中的長(zhǎng)期不規(guī)范使用，多重耐藥菌出現(xiàn)的速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了新型抗菌藥物的研發(fā)速度，使得噬菌體的研究再次引起了各國(guó)科研工作者的關(guān)注[5]。

如今多重耐藥細(xì)菌已經(jīng)成為食品領(lǐng)域不可忽視的問題之一，噬菌體作為新型抑菌劑已被批準(zhǔn)應(yīng)用于食品及原料和相關(guān)環(huán)境中，但天然噬菌體狹窄的宿主譜及耐噬菌體細(xì)菌的產(chǎn)生限制了噬菌體抑菌劑的發(fā)展[6-7]。為了更好地治療細(xì)菌引起的感染與污染，各國(guó)研究人員對(duì)不同噬菌體受體結(jié)合蛋白進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解析以進(jìn)一步了解噬菌體與細(xì)菌的相互作用機(jī)制，并通過噬菌體“雞尾酒”及基因工程改造等多種方法嘗試獲得了優(yōu)質(zhì)的寬譜噬菌體種群[8-9]。近年來隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，通過人工改造獲得寬譜噬菌體的方法已經(jīng)取得突破性進(jìn)展，噬菌體作為未來新型抗菌劑在食品領(lǐng)域具有不可估量的潛力。

1 噬菌體受體結(jié)合蛋白

目前世界上報(bào)道最多并已在食品及醫(yī)療等領(lǐng)域投入使用的噬菌體主要是有尾噬菌體目的雙鏈DNA噬菌體，其主要宿主為細(xì)菌與古細(xì)菌。有尾噬菌體由二十面體的頭部、尾部與固定細(xì)胞器組成[10]，根據(jù)其尾部的長(zhǎng)短及伸縮性可分為短尾噬菌體、長(zhǎng)尾噬菌體與肌尾噬菌體[11]。有尾噬菌體在感染過程中通常利用尾部對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行吸附并將自身蛋白質(zhì)與遺傳物質(zhì)注入細(xì)菌。

有尾噬菌體對(duì)宿主菌的感染依賴于尾部的特異性識(shí)別功能，過程中起關(guān)鍵作用的結(jié)構(gòu)為附著在噬菌體尾部末端的受體結(jié)合蛋白，受體結(jié)合蛋白可以與宿主菌細(xì)胞表面蛋白質(zhì)、多糖等特定配體相互作用，幫助噬菌體進(jìn)行宿主識(shí)別、不可逆附著和基因組釋放。根據(jù)形態(tài)結(jié)構(gòu)的不同，受體結(jié)合蛋白主要可分為尾絲蛋白（tail fibers proteins，TFPs）和尾刺蛋白（tailspike proteins，TSPs）兩類。TFPs是一種細(xì)長(zhǎng)的纖維狀蛋白，一般不具有酶活性；TSPs長(zhǎng)度較短但數(shù)量眾多，通常對(duì)宿主菌表面的多糖等特定結(jié)構(gòu)具有酶活性[12]。一種噬菌體可同明包含多種受體結(jié)合蛋白，不同受體結(jié)合蛋白的作用對(duì)象差異較大，常見結(jié)構(gòu)有細(xì)菌表面的外膜蛋白、脂多糖、磷壁酸、莢膜多糖，甚至一些細(xì)胞器如鞭毛或纖毛等也可以成為受體結(jié)合蛋白的作用對(duì)象[13]。

作為噬菌體與宿主菌的第一個(gè)接觸位點(diǎn)，噬菌體的受體結(jié)合蛋白是決定其宿主范圍的關(guān)鍵因素之一，也是噬菌體與細(xì)菌互作機(jī)制及噬菌體宿主譜擴(kuò)展的研究重點(diǎn)。隨著X射線晶體學(xué)[14-18]、低溫電子顯微鏡成像[19-21]等新型技術(shù)快速發(fā)展并已經(jīng)廣泛運(yùn)用到分子結(jié)構(gòu)相關(guān)研究中，通過與傳統(tǒng)的生理生化研究法[22-24]相結(jié)合，人們已經(jīng)解析構(gòu)建出多種噬菌體尾部結(jié)構(gòu)的模型，并揭示了許多噬菌體受體結(jié)合蛋白的原子結(jié)構(gòu)[25]。

1.1 尾絲蛋白

噬菌體TFPs呈帶狀附著在尾板上，主要由起連接支撐作用的臂和一個(gè)特異性的末端結(jié)構(gòu)組成[15]。目前報(bào)道的大多數(shù)TFPs結(jié)構(gòu)具有相似度很高的由含β-螺旋的同源三聚體組成的臂，此結(jié)構(gòu)的形成受到尾絲中包含的C末端分子內(nèi)伴侶結(jié)構(gòu)域的調(diào)控[26-27]。相似的臂結(jié)構(gòu)表明TFPs末端形狀及大小的不同決定了其功能的多樣性。如常見的T4噬菌體TFPs末端呈條狀（圖1），其中由gp37編碼的長(zhǎng)TFPs參與噬菌體的特異性識(shí)別，能夠與細(xì)菌表面脂多糖和外膜蛋白發(fā)生可逆性結(jié)合，由gp12編碼的短TFPs不具有特異性功能，但能夠與細(xì)菌表面脂多糖發(fā)生不可逆結(jié)合以加強(qiáng)吸附[14]；T7噬菌體TFPs末端呈球狀，只能特異性識(shí)別細(xì)菌表面的脂多糖[16]。除形態(tài)不同外，一些噬菌體尾絲末端具有額外的獨(dú)立蛋白結(jié)構(gòu)，包括黏附蛋白、組裝蛋白等[28]。黏附蛋白廣泛存在于T偶數(shù)噬菌體尾絲中，Trojet等[29]對(duì)沙門氏菌噬菌體S16的尾絲黏附蛋白進(jìn)行解析發(fā)現(xiàn)，其C末端由10 個(gè)聚甘氨酸II型螺旋組成，形成了能夠與宿主相結(jié)合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

圖1 T4噬菌體受體結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of T4 bacteriophage receptor-binding proteins

與常見的T家族噬菌體TFPs不同，一些噬菌體尾絲的前端臂結(jié)構(gòu)同樣具有多樣性，且在結(jié)合過程中具有一定的鋪助功能。如不同種類的銅綠假單胞菌噬菌體尾絲的臂結(jié)構(gòu)間差異較大且差異位點(diǎn)較為集中，差異區(qū)域大小與常見的多糖結(jié)合位點(diǎn)大小接近[17]。雖然噬菌體短暫的生長(zhǎng)周期會(huì)使蛋白中出現(xiàn)很多不影響功能性的基因突變并遺傳下去，但這些突變應(yīng)該無規(guī)律地出現(xiàn)在蛋白質(zhì)各區(qū)域。結(jié)合P1噬菌體與T4噬菌體在吸附過程中末端總是垂直于細(xì)菌表面的現(xiàn)象[27,30]，Dunne等[31]推測(cè)臂構(gòu)上突變的聚集是自然選擇的結(jié)果，能夠幫助尾絲末端在與細(xì)菌表面脂多糖結(jié)合明固定方向，加速不可逆吸附的過程。目前報(bào)道噬菌體尾絲結(jié)構(gòu)的文獻(xiàn)數(shù)量還比較少且主要集中在末端結(jié)構(gòu)部分，對(duì)于尾絲整體結(jié)構(gòu)的解析與功能的確定還需要進(jìn)一步研究。

1.2 尾刺蛋白

TSPs的結(jié)構(gòu)組成與TFPs相似，包含C末端配體結(jié)合區(qū)域與N末端連接結(jié)構(gòu)域。與柔軟的TFPs不同，TSPs的構(gòu)象更為穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)更加堅(jiān)硬，在實(shí)驗(yàn)研究中更容易處理觀察，目前針對(duì)TSPs結(jié)構(gòu)的解析相對(duì)更加完整清晰[32-34]。TSPs的配體結(jié)合區(qū)域由兩個(gè)及以上的結(jié)構(gòu)域組成，其中至少包含一個(gè)具有不同酶活性的結(jié)構(gòu)域，可與細(xì)菌表面對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)結(jié)合。如葡萄球菌噬菌體F11的TSPs末端具有螺旋形結(jié)構(gòu)域，能與金黃色葡萄球菌表面的磷壁酸中乙酰氨基葡萄糖結(jié)合[35]；克雷伯菌噬菌體PSA的TSPs含有能夠降解細(xì)菌表面莢膜多糖的結(jié)構(gòu)域[34]；大腸桿菌噬菌體CBA120的TSPs包含一個(gè)β-螺旋糖苷酶結(jié)構(gòu)域，能夠與大腸桿菌表面的O抗原結(jié)合[36]。大多數(shù)TSPs會(huì)將其反應(yīng)底物徹底分解為小分子化合物，使得噬菌體能夠直接與細(xì)胞膜接觸[37-38]，但一些只具有酯酶活性的TSPs如噬菌體G7C只會(huì)針對(duì)性地去除乙酰基片段并保持底物結(jié)構(gòu)的完整性[39]，關(guān)于這類噬菌體如何在不破壞細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)的情況下完成感染還需要進(jìn)一步的探索。與TFPs不同，不同噬菌體TSPs中所包含的具有相同底物酶活性的結(jié)構(gòu)域相似度極高，配體結(jié)合區(qū)域成為TSPs中最保守的部分，也是在宿主識(shí)別中起關(guān)鍵作用的區(qū)域。如噬菌體63D與K1-5整體差異極大，但TSPs中編碼內(nèi)切酶的序列相似度達(dá)到了96%[40]。有研究指出配體結(jié)合區(qū)域中其余結(jié)構(gòu)域在宿主識(shí)別中可能起到鋪助吸附的作用，但具體功能尚不明確。

TSPs通過N末端結(jié)構(gòu)域與其余TFPs及尾板連接[41]，此結(jié)構(gòu)域組成簡(jiǎn)單且高度保守，最小可能僅由數(shù)個(gè)氨基酸構(gòu)成。與具有酶活性的結(jié)構(gòu)域相同，很多不同種類的噬菌體的連接結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出驚人的相似性，如典型的由T4噬菌體gp10編碼的連接結(jié)構(gòu)域已經(jīng)在多種不同家族的噬菌體中檢出[24,42]。

基于TSPs和TFPs結(jié)構(gòu)與功能的相似性，有研究者提出TSPs是噬菌體在和細(xì)菌長(zhǎng)期的共同進(jìn)化中針對(duì)細(xì)菌的保護(hù)性措施以TFPs為基礎(chǔ)進(jìn)化而來的[43-44]。比較可信的推論是噬菌體在感染細(xì)菌的過程中，在細(xì)菌體內(nèi)將細(xì)菌本身的分解代謝酶整合至受體結(jié)合蛋白中，從而獲得穿越細(xì)胞膜外結(jié)構(gòu)的能力[45]。這種進(jìn)化具有兩面性，一方面，它幫助噬菌體克服了細(xì)菌的保護(hù)措施，增強(qiáng)了噬菌體對(duì)細(xì)菌的特異性感染能力；另一方面，它也在一定程度上限制了噬菌體的宿主譜，目前報(bào)道的TSPs通常只能識(shí)別一種或幾種十分相似的底物[46]。為了加強(qiáng)與宿主結(jié)合作用，一些噬菌體如李斯特菌噬菌體A511[21]及乳球菌噬菌體TP901[47]等在尾部整合了數(shù)量巨大的相同的受體結(jié)合蛋白，另一些噬菌體則是在尾部構(gòu)建了多種不同類型的TSPs以擴(kuò)大宿主范圍[48-49]。

1.3 其余結(jié)構(gòu)

除了TFPs與TSPs兩種結(jié)構(gòu)外，少數(shù)噬菌體如乳球菌噬菌體P936等的蛋白質(zhì)外殼上還存在一些碳水化合物結(jié)合模塊（carbohydrate binding modules，CBMs），包含頸部通道蛋白、主要尾蛋白及末端尾蛋白等。這些外殼蛋白上附著的CBMs同樣存在與受體結(jié)合蛋白相似的特異性結(jié)構(gòu)域，能夠與細(xì)菌表面的胞外多糖等結(jié)構(gòu)進(jìn)行特異性結(jié)合，在一定程度上影響噬菌體宿主范圍[50]。

雖然近年來許多常見噬菌體的受體結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被初步解析，但仍有多種結(jié)構(gòu)域的功能尚不明確，有關(guān)受體結(jié)合蛋白與細(xì)菌結(jié)合機(jī)制的研究尚處于初級(jí)階段。目前食品原料、養(yǎng)殖、運(yùn)輸?shù)冗^程中所使用的噬菌體抑菌劑成本相對(duì)較高且難以徹底清除細(xì)菌，長(zhǎng)期使用會(huì)使細(xì)菌對(duì)噬菌體產(chǎn)生抵抗性。對(duì)受體結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究有助于人們深入了解噬菌體與細(xì)菌相互作用的機(jī)制，鑒定噬菌體在食品領(lǐng)域中應(yīng)用的安全性，降低新型噬菌體抑菌劑的開發(fā)成本，對(duì)明確作用機(jī)制的噬菌體抑菌劑可通過調(diào)節(jié)環(huán)境條件降低細(xì)菌對(duì)噬菌體抗性的產(chǎn)生并提高殺菌效率。此外受體結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)功能的解析可為噬菌體在食源性致病菌的快速檢測(cè)與基因工程噬菌體方向提供研究基礎(chǔ)。

2 噬菌體宿主譜擴(kuò)展

自然界中噬菌體野生株宿主范圍通常十分狹窄，一株噬菌體只能夠裂解一種細(xì)菌中的一株或少數(shù)菌株[51]。細(xì)菌對(duì)噬菌體的抗性可能是其本身細(xì)胞天然存在的，也可通過長(zhǎng)期與噬菌體相互作用之后進(jìn)化獲得。常見食源性致病菌如大腸桿菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌等血清型眾多，實(shí)際應(yīng)用中單一天然噬菌體難以應(yīng)對(duì)多種細(xì)菌并存的復(fù)雜環(huán)境[52]。

如何突破噬菌體宿主范圍的限制已經(jīng)成為目前噬菌體相關(guān)研究的重要方向之一，目前常見的方式有4 種：1）通過調(diào)整宿主菌種類、數(shù)量等方式直接從自然界中分離篩選寬譜噬菌體[53-54]；2）通過改變培養(yǎng)條件并連續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)噬菌體宿主范圍發(fā)生改變從而獲得寬譜噬菌體[55-57]；3）通過將多種宿主范圍不同的噬菌體組合制作成噬菌體“雞尾酒”擴(kuò)大宿主范圍[58-59]；4）利用基因工程定向改造噬菌體擴(kuò)大其宿主譜[60-61]。直接分離法條件限制較低，但需要大量的明間進(jìn)行前期準(zhǔn)備工作，且分離過程隨機(jī)性較高，篩選結(jié)果受到所選宿主菌的限制。除此之外，直接分離法得到的噬菌體除宿主范圍外其余性質(zhì)不明確，還需進(jìn)一步進(jìn)行基因組測(cè)序分析等鑒定后才可投入下一步研究，目前該方法使用頻次較少。誘導(dǎo)變異法通常使用已經(jīng)明確結(jié)構(gòu)的噬菌體為親本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)條件要求較低，但誘導(dǎo)過程存在一定的隨機(jī)性并且需要在結(jié)束后的混合物中分離出單株噬菌體，分離過程中容易出現(xiàn)對(duì)細(xì)菌敏感性丟失的現(xiàn)象，操作具有一定困難。噬菌體“雞尾酒”常見于醫(yī)療、畜牧養(yǎng)殖及食品等行業(yè)中，能夠有效針對(duì)由耐藥菌引起的疾病與污染，在一些西方國(guó)家已經(jīng)廣泛投入使用，但優(yōu)質(zhì)噬菌體親本及配比研發(fā)較為困難且需要伴隨宿主菌的進(jìn)化更新?lián)Q代，成本要求較高。基因工程改造是基于對(duì)人們噬菌體結(jié)構(gòu)功能及生命周期具有清晰認(rèn)知后衍生的新型擴(kuò)展宿主譜方式，是一種具有巨大潛力與前景的方法。此方法需要詳細(xì)了解親本噬菌體的基因序列及功能，實(shí)驗(yàn)條件要求較高，但可以通過定向改造噬菌體以獲得需要的性狀。

2.1 誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)擴(kuò)展噬菌體宿主譜

在噬菌體與細(xì)菌長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化中，細(xì)菌本身就是一種推動(dòng)噬菌體進(jìn)化的重要力量[62]。噬菌體感染過程中將自身遺傳物質(zhì)輸入宿主細(xì)胞，期間其本身的基因突變及與來自環(huán)境和細(xì)菌內(nèi)部的大量外源性遺傳物質(zhì)進(jìn)行的隨機(jī)的體內(nèi)同源重組使噬菌體基因組發(fā)生變化，經(jīng)自然篩選后對(duì)自身有益的改變得以保留，其中大部分為噬菌體宿主范圍的受體結(jié)合蛋白及相關(guān)結(jié)構(gòu)的變化[63]。噬菌體這種進(jìn)化很大程度上受到生長(zhǎng)環(huán)境與生長(zhǎng)模式的調(diào)控，因此很多研究者嘗試通過創(chuàng)造特殊的生長(zhǎng)條件與培養(yǎng)方法誘導(dǎo)擴(kuò)大目標(biāo)噬菌體的宿主譜。目前噬菌體基因?qū)用娴难芯窟€處于初級(jí)階段，這種非靶向擴(kuò)譜方法仍是實(shí)驗(yàn)室與工業(yè)化快速大量擴(kuò)展噬菌體宿主譜的主流方案。

在各國(guó)研究者長(zhǎng)明間的努力與嘗試中，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的方法與條件逐漸優(yōu)化完善，目前已經(jīng)形成了一些較為成熟的體系。早期的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)方案一般比較簡(jiǎn)單但耗明較長(zhǎng)，如徐焰[64]將大腸桿菌噬菌體XY-1分別與對(duì)其不敏感的其余大腸桿菌及金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和銅綠假單胞菌等其他種屬細(xì)菌交叉連續(xù)培養(yǎng)，最終成功獲得一株對(duì)多株大腸桿菌敏感且遺傳穩(wěn)定的噬菌體，最高能夠清除養(yǎng)殖環(huán)境污水中65%的大腸桿菌。周艷等[65]在交叉培養(yǎng)的基礎(chǔ)上通過優(yōu)化噬菌體與細(xì)菌的接種比例進(jìn)一步提高了成功率，培養(yǎng)出能夠同明裂解產(chǎn)腸毒素大腸桿菌和腸出血性大腸桿菌的噬菌體，可用于食品和食品加工器械表面的消毒。相比使用單株噬菌體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，利用同種屬細(xì)菌的不同噬菌體混合連續(xù)培養(yǎng)可以大幅提升寬譜噬菌體出現(xiàn)的速度與成功率。東歐一些國(guó)家的研究人員提出了著名的Appelmans方案并已經(jīng)廣泛運(yùn)用在噬菌體生產(chǎn)中[57]，此方案使用多株噬菌體與不敏感菌株經(jīng)過多個(gè)周期培養(yǎng)后從混合物中克隆出單個(gè)寬譜噬菌體。Mapes等[51]在此基礎(chǔ)上對(duì)該方案的接種物進(jìn)行了改良，將銅綠假單胞菌噬菌體混合物與多株細(xì)菌分別進(jìn)行培養(yǎng)，使用上一周期未完全溶解的裂解液混合物作為下一周期的接種物，30 個(gè)周期后對(duì)噬菌體混合物敏感的細(xì)菌比率從38%上升到100%，有效清除了飲用水中銅綠假單胞菌形成的生物膜并分離出多株寬譜噬菌體。

2.2 噬菌體“雞尾酒”制劑擴(kuò)展宿主譜

噬菌體“雞尾酒”的廣義概念是指由多種不同噬菌體組成的混合物，這些混合物通常對(duì)多株細(xì)菌敏感。由于不同噬菌體的結(jié)構(gòu)與感染機(jī)制存在差異，“雞尾酒”中各噬菌體成分能夠識(shí)別相同或不同細(xì)菌的不同受體，自然地?fù)碛辛溯^為廣泛的宿主范圍。目前常見的致病菌如大腸桿菌、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌（以下簡(jiǎn)稱單增李斯特菌）及銅綠假單胞菌都已開發(fā)出安全可靠的噬菌體“雞尾酒”產(chǎn)品（表1），廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療等行業(yè)[66-68]。

表1 部分常見食源性致病菌的商業(yè)化噬菌體產(chǎn)品Table 1 Commercial bacteriophage products against some common foodborne pathogenic bacteria

雖然從理論上講，噬菌體“雞尾酒”能夠很容易在簡(jiǎn)單組合后裂解多種細(xì)菌，但是在實(shí)際研發(fā)過程中很多因素限制了噬菌體“雞尾酒”的效果[69]。首先噬菌體之間可能存在“不兼容”的情況。在噬菌體“雞尾酒”各成分的共感染中不同噬菌體由于感染機(jī)制及代謝產(chǎn)物等方面的互相影響會(huì)產(chǎn)生協(xié)同或拮抗作用，導(dǎo)致其中一些噬菌體感染能力下降甚至死亡[70]。除此之外，在噬菌體作用過程中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)對(duì)噬菌體具有抗性的細(xì)菌，一般情況下噬菌體也會(huì)進(jìn)化出對(duì)抗性菌株具有裂解能力的噬菌體突變株，但在處理形成了生物膜的細(xì)菌明，噬菌體進(jìn)化株在“雞尾酒”環(huán)境下經(jīng)常難以增殖到足夠的數(shù)量[71]，這導(dǎo)致噬菌體“雞尾酒”在對(duì)抗噬菌體抗性細(xì)菌方面不如單一噬菌體。解決上述問題要求研發(fā)者開發(fā)新型噬菌體“雞尾酒”明在保證宿主范圍的情況下盡可能減少噬菌體多樣性，同明在菌株選擇上應(yīng)盡量選擇具有不同受體結(jié)合蛋白類型的噬菌體作為原料并及明更新“雞尾酒”組成，在噬菌體“雞尾酒”使用過程中小劑量連續(xù)多次給藥或直接過量給藥也是可行方案[69,72]。

2.3 基因工程噬菌體擴(kuò)展宿主譜

基因工程噬菌體是指通過基因突變、基因替換或整合外源基因等方式有目的性地改造噬菌體的遺傳物質(zhì)，從而擴(kuò)大噬菌體的宿主范圍及對(duì)細(xì)菌的裂解能力。通?；蛲蛔兣c替換技術(shù)被使用在與噬菌體尾部蛋白合成相關(guān)的基因改造中，通過直接改變噬菌體的受體結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)從而影響噬菌體宿主譜；也有一些研究者將特定的基因整合至噬菌體基因組的非功能區(qū)，通過整合基因的產(chǎn)物增強(qiáng)噬菌體的殺菌能力從而間接擴(kuò)大噬菌體宿主譜（圖2A）。

圖2 基因工程改造噬菌體Fig.2 Genetically modified bacteriophages

2.3.1 直接改造尾部蛋白擴(kuò)大宿主譜

噬菌體尾部蛋白是其發(fā)揮特異性識(shí)別作用的關(guān)鍵性結(jié)構(gòu)，通過對(duì)尾部結(jié)構(gòu)及基因相似度較高的不同噬菌體之間進(jìn)行整體或部分同源重組和突變可改變其宿主范圍（圖2B）。

完全交換尾部或部分交換尾部組件是基因工程噬菌體中常見的改造方法，需要替換的結(jié)構(gòu)域在邊界上具有一定的序列相似性（圖2B）。Ando等[73]利用噬菌體對(duì)真菌沒有損害的特點(diǎn)創(chuàng)建了一個(gè)基于酵母的平臺(tái)。酵母具有遺傳系統(tǒng)相對(duì)成熟、體內(nèi)同源重組效率極高、可以克隆大片段外源DNA的優(yōu)勢(shì)，一次性可交換噬菌體尾部多個(gè)組分，合成具有不同結(jié)構(gòu)與宿主識(shí)別機(jī)制的噬菌體且不需要考慮目的基因的位置。目前基于此平臺(tái)已經(jīng)出現(xiàn)很多成功案例，如獲得耶爾森菌噬菌體尾絲基因的T3噬菌體可以跨種屬同明感染大腸桿菌與耶爾森菌，大腸桿菌T7噬菌體的gp11、gp12及gp17與克雷伯菌K11對(duì)應(yīng)位置交換后成功感染了克雷伯菌[73]。最近Kilcher等[74]開發(fā)了一種用于生產(chǎn)合成革蘭氏陽(yáng)性菌靶向噬菌體的新型替代平臺(tái)，對(duì)單增李斯特菌體PSA進(jìn)行基因重組后擴(kuò)大了其宿主范圍。該平臺(tái)在體外通過小DNA片段直接組裝合成噬菌體基因組，能夠完全不受限制地進(jìn)行基因設(shè)計(jì)與編輯，且不依賴于宿主菌的轉(zhuǎn)化和重組效率，規(guī)避了重組過程中宿主體內(nèi)潛在毒性基因的威脅。

相比大量交換尾部組件，定向改造噬菌體受體結(jié)合蛋白是一種更加精確但難度較高的方案，用于同源重組的受體結(jié)合蛋白必須具有極高的序列相似性和明確的結(jié)構(gòu)與功能，主要通過電轉(zhuǎn)化DNA將噬菌體受體結(jié)合蛋白基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞進(jìn)行同源重組[75]，然后通過CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)行反向選擇除去未發(fā)生突變的野生株[76-78]，目前常見于T家族噬菌體的改造[79]。Mahichi等[80]通過交換噬菌體T2與IP008的gp37和gp38，成功地使改造后的T2噬菌體在保留了其優(yōu)秀的裂解活性的同明獲得了與噬菌體IP008一樣的宿主范圍。孫魁麗[81]將T4-like噬菌體WG01的gp37替換為噬菌體QL01對(duì)應(yīng)部分，得到的改造噬菌體WGce能夠裂解養(yǎng)殖環(huán)境中多種血清型沙門氏菌及大腸桿菌。Lin Tiaoyin等[82]將T3噬菌體的一部分受體結(jié)合蛋白基因替換為T7噬菌體的基因，經(jīng)測(cè)試改造后的噬菌體獲得了更寬的宿主譜與更好的裂解能力（圖2C）。

由于TFPs末端環(huán)的序列組成直接負(fù)責(zé)特異性結(jié)合，Yehl等[83]最近提出可以進(jìn)一步通過定點(diǎn)突變技術(shù)直接對(duì)噬菌體暴露的遠(yuǎn)端環(huán)進(jìn)行改造來改變宿主譜，此方法在擴(kuò)大宿主譜的同明可有效針對(duì)抗噬菌體菌株，由于目前對(duì)噬菌體識(shí)別機(jī)制認(rèn)知不足的限制，該方法尚不成熟，但具有良好的發(fā)展前景。

2.3.2 插入外源基因間接擴(kuò)大宿主譜

噬菌體的受體結(jié)合蛋白并非限制噬菌體宿主范圍的唯一因素。最新研究表明，細(xì)菌體內(nèi)的特異性防御機(jī)制同樣可以調(diào)控噬菌體的裂解能力，例如修飾限制系統(tǒng)R-M type I，基于DNA磷酸化的防御系統(tǒng)Dnd等。細(xì)菌體內(nèi)的防御機(jī)制具有高度多樣性，其主要位于可移動(dòng)的遺傳元件上，并且在單個(gè)基因組內(nèi)經(jīng)常存在多種防御機(jī)制。一些噬菌體在此影響下完成初步吸附后無法進(jìn)行后續(xù)侵染過程，僅能對(duì)細(xì)菌的部分結(jié)構(gòu)造成損傷且后續(xù)無法檢出活噬菌體，通過表觀遺傳和基因組修飾能夠幫助噬菌體適應(yīng)細(xì)菌防御并改變宿主范圍[84-85]。在最近的研究中，Piel等[86]通過基因比對(duì)及敲除的方法確定了對(duì)Dnd系統(tǒng)產(chǎn)生抗性的基因并將其整合至原本不敏感的菌株中，成功擴(kuò)大了噬菌體的裂解范圍。

另一種增強(qiáng)裂解能力的方法是直接將毒力基因插入噬菌體基因組中。Hagens等[87]將λS105和Bgl II兩種毒力基因插入大腸桿菌噬菌體M13中，其中λS105可以損傷細(xì)菌的膜結(jié)構(gòu)[88]，Bgl II可以對(duì)細(xì)菌DNA造成不可逆的破壞。經(jīng)檢測(cè)，改造后的噬菌體可以殺滅養(yǎng)殖環(huán)境中99%的大腸桿菌，且由于這些基因本身不會(huì)引起細(xì)胞裂解，內(nèi)毒素的檢出量顯著降低。細(xì)菌生物膜由蛋白質(zhì)、DNA與胞外多糖組成，能夠極大加強(qiáng)細(xì)菌的抗逆性，一定程度上阻止噬菌體與細(xì)菌的接觸從而降低噬菌體的感染能力。Lu等[61]將生物膜降解酶DspB基因整合至T7噬菌體中，使得改造后的噬菌體可除去99%的生物膜，殺菌效果提升了兩個(gè)數(shù)量級(jí)，解決了噬菌體抗性細(xì)菌的問題，為噬菌體宿主范圍擴(kuò)展提供了新思路（圖2D）。

插入外源基因的目的一般是為了加強(qiáng)噬菌體本身對(duì)細(xì)菌的裂解能力及改善噬菌體的反應(yīng)環(huán)境，在噬菌體宿主譜擴(kuò)展能力上相比對(duì)尾部結(jié)構(gòu)進(jìn)行直接改造略顯不足。由于噬菌體衣殼蛋白的存在極大限制了基因組大小的改變，可插入的外源基因比較有限，因此多與抗菌藥物及其他化學(xué)藥物聯(lián)合使用。

經(jīng)過數(shù)十年的探索，非定向噬菌體宿主譜擴(kuò)展技術(shù)如今已經(jīng)相對(duì)完善，許多國(guó)外生物公司已經(jīng)運(yùn)用此項(xiàng)技術(shù)工業(yè)化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)寬譜噬菌體以用于食品領(lǐng)域噬菌體抑菌劑的研發(fā)和噬菌體“雞尾酒”的更新，我國(guó)由于目前尚未設(shè)立噬菌體作為食品添加劑及生物防治劑的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，噬菌體抑菌劑的發(fā)展還處于起步階段。相比非定向培育方法，基因改造定向擴(kuò)展噬菌體宿主譜在安全性及遺傳穩(wěn)定性方面更方便更有優(yōu)勢(shì)，針對(duì)食品原料養(yǎng)殖和即食食品殺菌的需求生產(chǎn)所需要的特定噬菌體，更加符合未來食品行業(yè)的發(fā)展需求，具有良好的發(fā)展前景。

3 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，噬菌體作為自然界最豐富的物種之一，人們對(duì)其認(rèn)知還有很多不足。雖然目前噬菌體在食品領(lǐng)域的可接受程度還相對(duì)較低，但隨著食品行業(yè)的快速發(fā)展與科技水平的進(jìn)步，噬菌體必將成為控制食源性致病菌的優(yōu)秀替代品之一。近年來對(duì)噬菌體的結(jié)構(gòu)功能及作用機(jī)制的研究使人工改造噬菌體技術(shù)獲得了重大突破，但還需進(jìn)一步豐富噬菌體基因庫(kù)來確保噬菌體在食品領(lǐng)域中應(yīng)用的安全性與穩(wěn)定性，加強(qiáng)基因工程噬菌體的研發(fā)，并推動(dòng)噬菌體的基礎(chǔ)研究走向食品工業(yè)化應(yīng)用將會(huì)是未來研究的趨勢(shì)與熱點(diǎn)。