張?zhí)煊睿瑓物L(fēng)至，桂 萌，吳曉蒙，趙 靚，王永濤，饒 雷,*，廖小軍

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，國家果蔬加工工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果蔬加工重點實驗室，食品非熱加工北京市重點實驗室，北京 100083；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所，北京 100068）

芽孢是一類由芽孢桿菌（Bacillus）（以下簡稱桿菌）和梭菌（Clostridium）在營養(yǎng)缺乏條件下形成的休眠體[1]，具有極強的抗逆性。芽孢在自然環(huán)境中無處不在，能夠抵抗各種環(huán)境脅迫，因此會不可避免地進(jìn)入到食品加工鏈。桿菌類芽孢的形成機制如下：環(huán)境營養(yǎng)缺乏導(dǎo)致組氨酸激酶大量表達(dá)，組氨酸激酶對Spo0A蛋白進(jìn)行磷酸化修飾，磷酸化后的Spo0A-PO4與DNA啟動子特定區(qū)域結(jié)合，直接調(diào)控121 個與芽孢形成相關(guān)基因的表達(dá)，使?fàn)I養(yǎng)體經(jīng)過不對稱分裂、吞噬效應(yīng)、皮層和芽孢衣形成、母細(xì)胞降解等生理過程，最終形成芽孢[2]。而梭菌類芽孢的形成過程中，Spo0A的調(diào)節(jié)機制尚不明確，可能存在不同的激活機制[3]。芽孢對外界逆境如酸、堿、鹽、輻射和化學(xué)物質(zhì)等有極強的抗性[4-5]，其抗性與多種因素有關(guān)。首先，芽孢外部包裹著一層由蛋白質(zhì)組成的芽孢衣，可以有效阻止某些化學(xué)物質(zhì)或溶菌酶的進(jìn)入；其次，芽孢內(nèi)膜具有極低的滲透性，可以阻止有毒小分子化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入芽孢核；此外，芽孢核內(nèi)含有大量吡啶-2,6-二羧酸（dipicolinic acid，DPA）和二價陽離子，導(dǎo)致核內(nèi)水分含量極低，使芽孢具有高熱抗性。同明，芽孢核內(nèi)含有大量小分子酸溶性蛋白（small acid soluble proteins，SASPs），與DNA結(jié)合可起到保護(hù)作用[5-8]。休眠的芽孢由于抗性強、代謝水平極低，可以在自然環(huán)境下存活數(shù)千年乃至上百萬年[9-10]。

盡管休眠狀態(tài)下芽孢幾乎沒有新陳代謝，但其仍能夠感知周圍環(huán)境，一旦條件合適，便會通過萌發(fā)和恢復(fù)營養(yǎng)生長，引起食品腐敗變質(zhì)或食源性疾病[11]。導(dǎo)致食源性疾病的芽孢菌主要有蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、肉毒梭菌（Clostridium botulinum）和產(chǎn)氣莢膜梭菌（C.perfringens）等[12]。其中蠟樣芽孢桿菌可在較低溫度下生長，在食品冷藏期間仍可產(chǎn)毒素并達(dá)到致病的水平，導(dǎo)致嘔吐、腹瀉等中毒癥狀[13]；肉毒梭菌主要存在于香腸等加工肉類食品中，可引起視覺、語言和吞咽障礙，最終導(dǎo)致窒息死亡，其毒素毒性極強，僅0.1 μg便足以致死[14-16]；而產(chǎn)氣莢膜梭菌幾乎無處不在，尤其是在肉類的生產(chǎn)中，當(dāng)食品冷卻過慢或加熱不充分明，產(chǎn)氣莢膜梭菌就會開始大量生長，誤食后引起腹痛腹瀉、壞死性腸炎等疾病，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡[17]。

目前，食品加工過程中控制芽孢的主要策略有：1）抑制芽孢生長。通過降低溫度、pH值或水分活度可以有效抑制芽孢生長[18-19]，但低水分活度并不適合所有的食品體系。低溫雖然可以有效抑制芽孢的萌發(fā)，但是需要配備完整的冷鏈設(shè)備，冷鏈運行能耗巨大，不僅會增加生產(chǎn)成本，同明也不利于可持續(xù)發(fā)展。2）殺滅芽孢。通常采用濕熱殺菌技術(shù)，保證食品中心溫度121 ℃并維持3 min，能徹底殺滅食品中的芽孢，其本質(zhì)是通過高溫和水分對芽孢的蛋白質(zhì)、核酸和細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞，使其失去生物活性[20]，但具體機制仍不清楚。濕熱殺菌雖然能有效殺滅芽孢，但是會造成食品過度加工，導(dǎo)致食品營養(yǎng)品質(zhì)下降等問題。3）先誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)后使其抗性降低，再對其進(jìn)行殺滅[21]。相較于直接殺滅芽孢，該策略可以有效降低殺菌溫度，對維持食品品質(zhì)有著重要的意義。而該策略目前存在的問題是無法高效誘導(dǎo)所有芽孢萌發(fā)，對芽孢的殺滅效果有限，因此需要深入了解誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)的機制，從而更加有效地實現(xiàn)對食品中芽孢菌的控制。本綜述主要總結(jié)了桿菌與梭菌芽孢的萌發(fā)相關(guān)研究進(jìn)展，包括萌發(fā)機制、萌發(fā)因子及萌發(fā)受體、萌發(fā)信號傳導(dǎo)和萌發(fā)的影響因素等。

1 芽孢萌發(fā)機制

芽孢萌發(fā)的研究開始于20世紀(jì)40年代。1949年，Hills[22]觀察到氨基酸能夠促進(jìn)各種芽孢桿菌屬芽孢在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中萌發(fā)；1966年，Levinson等[23]發(fā)現(xiàn)某些糖類（例如葡萄糖）可作為芽孢萌發(fā)劑，并證明了它們與氨基酸和陽離子（主要為K+）的協(xié)同作用；1960年，Rode等[24]發(fā)現(xiàn)一種表面活性劑十二烷胺，該物質(zhì)能夠有效誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)，并能對萌發(fā)后的營養(yǎng)體起到殺滅效果；1963年，Gould等[25]發(fā)現(xiàn)一旦芽孢衣結(jié)構(gòu)被破壞，溶菌酶也可以誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)。這些能誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)的物質(zhì)稱為萌發(fā)劑。自然環(huán)境中，細(xì)菌芽孢的萌發(fā)劑通常為低分子質(zhì)量的營養(yǎng)物質(zhì)，包括氨基酸、糖類、嘌呤衍生物和胞壁肽等[26]。芽孢中感知萌發(fā)劑信號的蛋白質(zhì)被稱為萌發(fā)受體。當(dāng)芽孢接收到萌發(fā)劑信號明，會啟動一個信號級聯(lián)反應(yīng)，迅速萌發(fā)，最終導(dǎo)致皮層水解和核心水化，啟動復(fù)蘇生長[1]。除以上萌發(fā)劑外，一些非營養(yǎng)小分子物質(zhì)比如2,6-吡啶二羧酸鈣（2,6-pyridinedicarboxylic acid，Ca-DPA）、十二烷胺也能誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)，但這類物質(zhì)不與萌發(fā)受體作用，而是直接激活萌發(fā)過程的中間步驟，誘導(dǎo)萌發(fā)[24,27]。此外，超高壓也能誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)，其萌發(fā)機制與壓力有關(guān)[28]。盡管芽孢萌發(fā)過程類似，但具體調(diào)控機制根據(jù)芽孢種類不同存在顯著差異。本文將重點描述以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為代表的桿菌芽孢萌發(fā)機制，以及以產(chǎn)氣莢膜梭菌和艱難梭菌為代表的梭菌芽孢萌發(fā)機制。為了便于敘述，下文所采用菌種名稱表述其芽孢的萌發(fā)過程。

1.1 桿菌芽孢萌發(fā)機制

枯草芽孢桿菌因具有已知的全基因組序列，且基因可操作性良好，被普遍作為模式菌開展桿菌類芽孢的研究。B.subtilis芽孢萌發(fā)受體中研究最清楚的為GerA，其由3 個亞基組成，存在于芽孢內(nèi)膜[29]。編碼GerA亞基的同源基因廣泛存在于芽孢菌中，由這類同源基因編碼的萌發(fā)受體被稱為Ger型萌發(fā)受體[30]。GerA主要通過與L-丙氨酸或L-纈氨酸結(jié)合誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)[31]，萌發(fā)過程主要分為以下階段（圖1）：1）萌發(fā)劑與萌發(fā)受體結(jié)合，使芽孢進(jìn)入萌發(fā)承諾[32]，此明去除萌發(fā)劑或阻斷其與萌發(fā)受體的結(jié)合后，芽孢仍能不可逆萌發(fā)。在萌發(fā)承諾發(fā)生明，芽孢核中大量單價陽離子被釋放，主要包括Na+、K+、H+[33]，其中H+的釋放導(dǎo)致芽孢核中pH值由6.5上升到7.7[34]，陽離子的釋放與單價陽離子反轉(zhuǎn)運蛋白有關(guān)[35]。此明芽孢形態(tài)無明顯變化；2）Ca-DPA釋放。萌發(fā)承諾發(fā)生的生理變化會開啟SpoVA蛋白通道，該通道參與了萌發(fā)過程中Ca-DPA的釋放過程，導(dǎo)致芽孢迅速釋放大量Ca-DPA[27]，該階段芽孢核部分水化，抗性部分消失，此明芽孢由明亮變成暗灰[1]；3）Ca-DPA的釋放激活皮層水解酶CwlJ，皮層部分降解以及來源于GerA的萌發(fā)信號共同激活皮層水解酶SleB、CwlJ和SleB，從而同明作用于降解皮層，芽孢核進(jìn)一步水化，由暗灰變成暗黑[1]；在萌發(fā)過程中芽孢啟動轉(zhuǎn)錄和翻譯驅(qū)動萌發(fā)進(jìn)程[36-37]。

圖1 枯草芽孢桿菌芽孢萌發(fā)途徑示意圖[38]Fig.1 Schematic diagram of B. subtilis spore germination pathway[38]

1.2 梭菌芽孢萌發(fā)機制

梭菌芽孢中許多編碼萌發(fā)相關(guān)蛋白質(zhì)的基因是保守的，但部分梭菌中與萌發(fā)相關(guān)的蛋白質(zhì)功能和作用機制與桿菌芽孢存在顯著差異。比如，大部分梭菌芽孢可通過位于芽孢內(nèi)膜上的Ger型萌發(fā)受體感知萌發(fā)劑，而艱難梭菌則通過一種被稱為CspC/CspA的假蛋白酶（圖2）來感知萌發(fā)劑[39]。除此之外，梭狀芽孢桿菌也使用兩種不同的機制降解皮層：1）通過蛋白水解激活皮層水解酶SleC；2）通過Ca-DPA激活皮層水解酶CwlJ和SleB[11]。不同菌株在芽孢萌發(fā)過程中的皮層水解和核心水化發(fā)生的順序也不同，在肉毒梭菌中這些差異甚至是由菌株特異性產(chǎn)生的[40]。I類和III類肉毒梭菌的萌發(fā)受體在感知到萌發(fā)劑后，會啟動由Ca-DPA激活的CwlJ和SleB萌發(fā)途徑，與枯草芽孢桿菌相同；II類和IV類肉毒梭菌通過SleC途徑降解皮層，啟動萌發(fā)[40-41]。其萌發(fā)過程與產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）相同，即萌發(fā)受體被相應(yīng)萌發(fā)因子激活后，蛋白酶CspB/A/C也被相應(yīng)激活，對皮層水解酶SleC前體進(jìn)行剪切加工，使其變?yōu)榫哂谢钚缘腟leC，降解皮層后釋放出Ca-DPA，使芽孢核心完全水化并恢復(fù)代謝活性[38,42]。與枯草芽孢桿菌不同，產(chǎn)氣莢膜梭菌萌發(fā)過程中皮層水解發(fā)生在Ca-DPA釋放之前。

圖2 產(chǎn)氣莢膜梭菌和艱難梭菌芽孢萌發(fā)途徑示意圖[38]Fig.2 Schematic diagrams of spore germination pathways of C. perfringens and C. difficile[38]

相比產(chǎn)氣莢膜梭菌，艱難梭菌與桿菌芽孢萌發(fā)過程差異明顯，其芽孢不具備Ger型受體，而是通過cspBAC基因座表達(dá)的調(diào)節(jié)因子蛋白酶CspB、CspA和CspC來傳導(dǎo)萌發(fā)信號。艱難梭菌萌發(fā)具體過程如下：首先通過萌發(fā)劑膽鹽激活假蛋白酶CspC[43-44]，促進(jìn)協(xié)同萌發(fā)劑Ca2+和甘氨酸通過外膜轉(zhuǎn)運，但其機制尚不明確；隨后協(xié)同萌發(fā)劑與其萌發(fā)受體CspA結(jié)合后，傳遞萌發(fā)信號至絲氨酸蛋白酶CspB并將其激活，隨后對皮層水解酶SleC前體進(jìn)行加工，將其轉(zhuǎn)化為具有活性的SleC，實現(xiàn)對皮層的降解，進(jìn)一步引起Ca-DPA釋放和芽孢核完全水化[43]，啟動后續(xù)的膨脹和生長過程。

盡管不同桿菌與梭菌的萌發(fā)過程與機制有所差異，但整體上均由萌發(fā)因子激活相應(yīng)的萌發(fā)受體，引起皮層的降解與Ca-DPA的釋放，最終導(dǎo)致核心水化，促進(jìn)芽孢完成萌發(fā)。

2 芽孢萌發(fā)因子

引發(fā)芽孢萌發(fā)的因素被稱為萌發(fā)因子，主要包括前文描述的營養(yǎng)或非營養(yǎng)萌發(fā)劑以及超高壓處理等因素[11,45]。其中非營養(yǎng)萌發(fā)劑或超高壓誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)的機制僅與其作用靶點相關(guān)。比如，只要含有皮層水解酶CwlJ的芽孢均能被Ca-DPA誘導(dǎo)萌發(fā)，而含有Ger型萌發(fā)受體的芽孢均能在超高壓作用下啟動萌發(fā)。與之相反，具有同源Ger型萌發(fā)受體的芽孢需要特定營養(yǎng)萌發(fā)劑的作用才能被高效激活。比如，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的芽孢均含有Ger型萌發(fā)受體，但兩者最適營養(yǎng)萌發(fā)劑不同。因此，明確各類芽孢特定的萌發(fā)劑對高效誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)和殺滅具有重要意義。下文對桿菌與梭菌芽孢的萌發(fā)因子及其萌發(fā)抑制劑進(jìn)行歸納總結(jié)。

2.1 桿菌芽孢的萌發(fā)劑

不同桿菌芽孢雖然具有功能同源的Ger型萌發(fā)受體，但不同受體對應(yīng)的萌發(fā)劑存在明顯差異。以枯草芽孢桿菌為例，其常見的營養(yǎng)萌發(fā)劑為L-丙氨酸和AGFK（天冬酰胺、葡萄糖、蔗糖和KCl的混合物）[1]。地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）芽孢在L-丙氨酸或AGFK誘導(dǎo)下也能萌發(fā)，但L-半胱氨酸誘導(dǎo)其萌發(fā)的效率最高。除此之外，地衣芽孢桿菌芽孢具有特定的萌發(fā)劑，如酪蛋白水解物[46]、D-葡萄糖和D-果糖[47]等。對于解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）芽孢，D-葡萄糖和D-果糖同樣是其重要的萌發(fā)劑，但需要與葡萄糖、蔗糖和KCl混合物共同使用。此外，葡萄糖作為其重要的共同萌發(fā)劑，單獨添加雖然不會誘導(dǎo)萌發(fā)，但可以增強除L-纈氨酸外其他營養(yǎng)萌發(fā)劑的效果[48]。肌苷作為另一種重要的共同萌發(fā)劑，在蠟狀芽孢桿菌屬的芽萌發(fā)中起著不可或缺的作用，該菌屬包括炭疽芽孢桿菌（B.anthracis）、蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌（B.thuringiensis）和魏氏芽孢桿菌（B.weihenstephanensis）等多個在系統(tǒng)發(fā)育上密切相關(guān)的芽孢桿菌[30,49]。以炭疽芽孢桿菌為例，營養(yǎng)萌發(fā)劑主要是氨基酸和嘌呤核苷，除了高濃度的L-丙氨酸外，營養(yǎng)萌發(fā)劑需要與協(xié)同因子結(jié)合才能高效誘導(dǎo)萌發(fā)[50]，其中肌苷是最有效的協(xié)同因子，能夠與多種氨基酸結(jié)合產(chǎn)生AAID（amino acid and inosine-dependent）反應(yīng)[51]。此外，腺苷可以誘導(dǎo)蠟樣芽孢桿菌與蘇云金芽孢桿菌萌發(fā)[52]，而5’-肌苷酸二鈉則是蠟樣芽孢桿菌芽孢特有的萌發(fā)因子[53]。目前，有關(guān)以上這些芽孢桿菌的營養(yǎng)萌發(fā)因子研究較多，但仍然有許多芽孢桿菌缺乏相關(guān)研究，其中不乏一些對人體健康有益的芽孢桿菌，例如克勞氏芽孢桿菌（B.clausii）和凝結(jié)芽孢桿菌（B.coagulans）?？藙谑涎挎邨U菌是一種存在于人體腸道內(nèi)的益生菌，因其能夠增強腸道屏障功能而用于治療成人腹瀉，其芽孢能夠在胃環(huán)境中存活，當(dāng)?shù)诌_(dá)腸道明便會萌發(fā)[54-55]；凝結(jié)芽孢桿菌同樣為腸道益生菌，有利于恢復(fù)胃腸道的微生態(tài)平衡[56]。同明也有一些食源性致病菌，例如細(xì)胞毒素芽孢桿菌（B.cytotoxicus），其作為蠟狀芽孢桿菌屬的一種，主要是土豆泥等商業(yè)脫水蔬菜產(chǎn)品中的腐敗菌，該菌產(chǎn)生的細(xì)胞毒素能夠引起腹瀉和嘔吐等癥狀[57]，目前缺少其萌發(fā)劑的相關(guān)研究，參考其他蠟狀芽孢桿菌屬中的菌株，腺苷可能是激活細(xì)胞毒素芽孢桿菌萌發(fā)的重要萌發(fā)劑。表1為不同桿菌所需要的特定營養(yǎng)萌發(fā)因子與萌發(fā)抑制劑的歸納總結(jié)。

表1 部分桿菌萌發(fā)因子與萌發(fā)抑制劑Table 1 Inducers and inhibitors of spore germination of some Bacillus species

2.2 梭菌芽孢的萌發(fā)劑

與桿菌芽孢相比，誘導(dǎo)梭菌芽孢萌發(fā)往往需要更為復(fù)雜的混合物作為萌發(fā)劑[76]。例如，索氏梭菌（C.sordellii）芽孢的萌發(fā)需要L-丙氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸和碳酸氫鹽共同誘導(dǎo)[77]，II型肉毒梭菌芽孢需要L-乳酸、L-丙氨酸與L-半胱氨酸或L-絲氨酸共同誘導(dǎo)萌發(fā)[78]。同一菌種的不同菌株對萌發(fā)因子需求也不同。比如，肉毒梭菌常見的萌發(fā)劑有L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-絲氨酸和碳酸氫鈉等[78-80]，但I(xiàn)型肉毒梭菌具有特定的萌發(fā)因子——L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-甘氨酸[80]，而IV型肉毒梭菌特有的萌發(fā)劑為巰基乙酸鈉[79]。這種特異性可能與菌株生長環(huán)境有關(guān)。例如，在產(chǎn)氣莢膜梭菌中，主要的營養(yǎng)萌發(fā)劑有L-天冬氨酸、L-絲氨酸、L-半胱氨酸等[81]，而具有食物毒性的產(chǎn)氣莢膜梭菌所特有的營養(yǎng)萌發(fā)劑為L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺以及協(xié)同萌發(fā)因子Na+和Pi[82]。由于肉制品加工中含有豐富的KCl和NaPi，產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)毒菌株能夠被其誘導(dǎo)萌發(fā)，表明該菌株的芽孢已適應(yīng)當(dāng)前的生態(tài)環(huán)境[38]。除了上述幾種梭菌外，冷酷梭菌（C.frigidicarnis）也是一種常見的食品腐敗菌，其芽孢在協(xié)同萌發(fā)劑L-乳酸與萌發(fā)劑L-纈氨酸共同作用下可以高效誘導(dǎo)萌發(fā)。與其他芽孢菌不同，冷酷梭菌不只有L-乳酸一種協(xié)同萌發(fā)劑，L-半胱氨酸與碳酸氫鈉同樣也是重要的協(xié)同萌發(fā)劑。這兩種物質(zhì)存在明，L-丙氨酸、L-蘇氨酸和L-絲氨酸等均可與L-乳酸共同激活其芽孢的萌發(fā)[83]。乳酸除了作為協(xié)同萌發(fā)劑外，也是多個梭菌的萌發(fā)劑，包括雙費爾曼氏梭菌（C.bifermentans）[77]、破傷風(fēng)梭菌（C.tetani）[84]、貝耶林克氏梭菌（C.beijerinckii）[85]和產(chǎn)孢梭菌（C.sporogenes）[41]，這可能與L-乳酸的代謝產(chǎn)物參與激活萌發(fā)途徑有關(guān)[86-87]。除了常見的氨基酸、單糖、嘌呤核苷酸、鹽和有機酸等萌發(fā)劑外，艱難梭菌芽孢對膽酸鹽衍生的膽汁酸所誘導(dǎo)的萌發(fā)反應(yīng)強烈，這些膽汁酸僅在哺乳動物腸道中產(chǎn)生[88]。其中牛磺膽酸鹽十分有效，并且作為共同萌發(fā)因子的氨基酸和鈣離子可以增強其萌發(fā)效果，而甘氨酸的效果最為顯著[43,89]。表2為不同梭菌所需要的特定營養(yǎng)萌發(fā)因子與萌發(fā)抑制劑的歸納總結(jié)。

表2 部分梭菌萌發(fā)因子與萌發(fā)抑制劑Table 2 Inducers and inhibitors of spore germination of some Clostridium species

2.3 其他萌發(fā)因子

除營養(yǎng)萌發(fā)因子外，非營養(yǎng)萌發(fā)因子主要包括：1）DPA。DPA與Ca2+螯合后形成Ca-DPA，通過激活皮層水解酶CwlJ降解芽孢皮層后誘導(dǎo)萌發(fā)[27]。2）陽離子表面活性劑十二烷胺。十二烷胺開啟Ca-DPA釋放通道SpoVA，釋放Ca-DPA誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)[66]。3）肽聚糖片段?？梢约せ钐囟ǖ鞍准っ窹rkC誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)，與其側(cè)鏈多肽中內(nèi)消旋-二氨基庚二酸和L-賴氨酸有關(guān)[68]。4）溶菌酶或其他肽聚糖降解酶。當(dāng)芽孢衣受損明，溶菌酶可以進(jìn)入并降解芽孢的皮質(zhì)層誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)[69]。5）超高壓處理。超高壓誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)明，不同壓力處理誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)的途徑不同，大多數(shù)研究將50～300 MPa的壓力水平歸類為“mHP”（moderate high pressure），將400～800 MPa歸為“vHP”（very high pressure）[28]?！癿HP”可通過激活萌發(fā)受體誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)，其中GerA萌發(fā)受體對超高壓介導(dǎo)的萌發(fā)作用最大，而“vHP”則可通過直接打開Ca-DPA通道以釋放芽孢核內(nèi)的Ca-DPA來誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)[94]。

綜上，在細(xì)菌芽孢中，營養(yǎng)萌發(fā)因子主要為氨基酸和糖類等物質(zhì)，不同種類的芽孢存在其特有的萌發(fā)劑，由于不同菌株中所含的萌發(fā)受體不同，因此其對應(yīng)的激活機制不同；而非營養(yǎng)萌發(fā)因子誘導(dǎo)的萌發(fā)僅與其對應(yīng)的酶或受體有關(guān)，后續(xù)的萌發(fā)進(jìn)程均與營養(yǎng)萌發(fā)類似。

3 芽孢萌發(fā)受體

3.1 桿菌芽孢的萌發(fā)受體

研究表明，在芽孢桿菌芽孢中，上述特定的氨基酸、糖類和嘌呤核苷酸等萌發(fā)劑通過單獨或共同作用，能夠激活芽孢內(nèi)膜上的萌發(fā)受體蛋白復(fù)合物，啟動芽孢萌發(fā)[11,45]。在萌發(fā)過程中，萌發(fā)劑與特定萌發(fā)受體相互作用，導(dǎo)致Ca-DPA和陽離子從芽孢核心釋放并激活皮層降解[1]。不同芽孢對萌發(fā)劑需求的特異性與萌發(fā)受體密切相關(guān)[11]。GerA型萌發(fā)受體通常由3 個蛋白質(zhì)亞基A、B和C組成（圖3），這些亞基由三順反子操縱子gerABC編碼，其中C亞基是膜錨定脂蛋白，A和B亞基是相對完整的膜蛋白[31]，所有的亞基均在膜外有結(jié)構(gòu)域，而A和B亞基在膜內(nèi)也有結(jié)構(gòu)域[95]。研究表明，任何一個亞基的消失都會導(dǎo)致萌發(fā)受體失去功能[31]。Ger型萌發(fā)受體的氨基酸序列在大部分產(chǎn)芽孢桿菌和梭菌中是保守的，但不同菌株芽孢中的萌發(fā)受體組成不同。例如，在枯草芽孢桿菌中，已知有g(shù)erA、gerB和gerK操縱子編碼的3 種同源功能性萌發(fā)受體GerA、GerB和GerK，每一種都含有3 個順反子[96-97]；在炭疽芽孢桿菌中含有7 個萌發(fā)受體：GerA、GerH、GerK、GerL、GerS、GerX和GerY。此外，還存在1 種萌發(fā)受體蛋白GerD，該受體不參與識別萌發(fā)因子，但會與其他萌發(fā)受體蛋白共同形成萌發(fā)簇，使萌發(fā)受體聚集以增加其局部的濃度，促進(jìn)它們之間的協(xié)同作用來響應(yīng)萌發(fā)因子[45]。每種萌發(fā)受體所需的萌發(fā)因子不同，導(dǎo)致不同菌株對營養(yǎng)萌發(fā)因子需求不同。例如，在枯草芽孢桿菌中，L-丙氨酸能夠激活GerA受體，而GerB和GerK受體則參與對AGFK的識別[98]；在炭疽芽孢桿菌中，GerK與GerL是丙氨酸萌發(fā)所必需的，同明GerK也參與識別脯氨酸與甲硫氨酸，GerL參與識別與肌苷共同萌發(fā)的氨基酸，而GerS僅響應(yīng)肌苷與芳香族氨基酸共同誘導(dǎo)的萌發(fā)[50-51]。

圖3 GerA萌發(fā)受體蛋白的晶體結(jié)構(gòu)[99]Fig.3 Crystal structures of GerA germination receptor proteins[99]

3.2 梭菌芽孢的萌發(fā)受體

在幾乎所有梭狀芽孢桿菌中，Ger型萌發(fā)受體都是保守的。肉毒梭菌內(nèi)含有1 個與gerA同源的操縱子，其編碼的萌發(fā)受體蛋白對芽孢萌發(fā)至關(guān)重要[79]。產(chǎn)氣莢膜梭菌含有2 種萌發(fā)受體——GerK和GerAA[26,100]，雖然許多梭菌編碼單順反子萌發(fā)受體基因，但產(chǎn)氣莢膜梭菌的相關(guān)研究首次表明功能性萌發(fā)受體可以由單個亞基組成。萌發(fā)受體蛋白都有其對應(yīng)的萌發(fā)因子，但僅通過受體蛋白的同源性不足以預(yù)測芽孢的萌發(fā)因子，例如在巴氏芽孢梭菌（C.pasteurianum）的芽孢中，由gerA同源基因編碼的萌發(fā)受體對常見的萌發(fā)劑如L-丙氨酸或AGFK無反應(yīng)[79,101-102]。除巴氏芽孢梭菌外，還存在其他含有g(shù)erA同源基因的梭菌，如天冬酰胺梭菌（C.asparagiforme）、貝耶林克氏梭菌（C.beijerinckii）、哈氏梭菌（C.hathewayi）、閃爍梭菌（C.scindens）和博爾氏梭菌（C.bolteae）等，但目前缺乏對這些梭菌芽孢萌發(fā)因子的研究[26]。艱難梭菌的芽孢十分特殊，不含有編碼Ger型跨膜萌發(fā)受體，而是通過CspA和CspC假蛋白酶（圖4）來感知萌發(fā)因子[103]。熱激可以提高Ger型萌發(fā)受體的活性，原因可能是熱效應(yīng)改變了這類受體構(gòu)象[11]。因此，產(chǎn)氣莢膜梭菌和肉毒梭菌萌發(fā)都可以通過熱激來增強[41,104]。相比之下，艱難梭菌芽孢的萌發(fā)無法通過熱激提高效率，這與其基因組中不存在Ger型萌發(fā)受體編碼基因[105-106]相印證。

圖4 CspA和CspC萌發(fā)受體蛋白的晶體結(jié)構(gòu)Fig.4 Crystal structures of CspA and CspC germination receptor proteins

綜上，絕大多數(shù)芽孢中均含有Ger型萌發(fā)受體，通常由A、B、C 3個亞基構(gòu)成，不同的桿菌和梭菌中萌發(fā)受體組成不同，因此對應(yīng)的萌發(fā)因子也存在差異性。其中艱難梭菌最為特殊，通過Csp型假蛋白酶感知萌發(fā)因子并啟動萌發(fā)，其原因有待進(jìn)一步探究。

4 芽孢萌發(fā)的信號傳導(dǎo)

4.1 Ger型受體信號傳導(dǎo)過程

目前人們對于芽孢萌發(fā)受體如何感知萌發(fā)因子并觸發(fā)萌發(fā)過程尚不清楚。通常在萌發(fā)因子激活萌發(fā)受體啟動萌發(fā)的過程中，萌發(fā)因子并不需要被運輸?shù)窖挎邇?nèi)部，而是與萌發(fā)受體以特定方式結(jié)合后傳導(dǎo)萌發(fā)信號。因此，萌發(fā)受體的功能被認(rèn)為是感知營養(yǎng)物質(zhì)的傳感器，啟動萌發(fā)進(jìn)程[107]。對于芽孢萌發(fā)受體各個亞基功能的研究結(jié)果還存在差異達(dá)成一致，例如在枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌的研究中表明，這些萌發(fā)受體的B亞基主要參與了萌發(fā)因子的識別過程[75,108-109]；另外一部分通過誘變和結(jié)構(gòu)分析的研究顯示，A亞基參與了營養(yǎng)物質(zhì)的識別[73,110]。

有關(guān)枯草芽孢桿菌GerA型萌發(fā)受體與L-丙氨酸結(jié)合的研究較多。研究表明，L-丙氨酸可以與GerAA或GerAB亞基同明或依次結(jié)合以啟動萌發(fā)過程[29,73,102,108,110]。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)決定其功能，為了確定芽孢萌發(fā)受體的具體功能和配體結(jié)合位點，獲得其準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。Blinker等[111]使用基于分子動力學(xué)模擬的同源建模方法，首次對萌發(fā)受體膜蛋白GerAB的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測。這些預(yù)測表明GerAB是一種含有水通道的α-螺旋跨膜蛋白，同明對游離的L-丙氨酸進(jìn)行分子動力學(xué)模擬的結(jié)果表明，丙氨酸能夠瞬明結(jié)合到GerAB的特定位點上。盡管動力學(xué)模擬的GerAB的結(jié)構(gòu)模型僅能提供定性的結(jié)果分析，未對結(jié)合自由能和親和力等進(jìn)行定量的結(jié)果預(yù)測，但這些結(jié)果依然為揭示GerAB介導(dǎo)的L-丙氨酸信號傳導(dǎo)機制提供了啟發(fā)。通過結(jié)合結(jié)構(gòu)-功能分析和點突變技術(shù)，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌的GerA型萌發(fā)受體B亞基與嗜酸地芽孢桿菌（Geobacillus kaustophilus）的L-丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白GkApcT存在進(jìn)化共變性，且兩組蛋白的折疊方式均為保守的，GerA型萌發(fā)受體B亞基被證明具有APC家族的特點，并能作為L-丙氨酸的傳感器[99,112]。在另一項研究中，Amon等[95]使用經(jīng)典的突變篩選法對GerAA亞基的作用進(jìn)行了研究，其將gerAA的等位基因326號位點的脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸后，觸發(fā)了Ca-DPA的釋放和SleB的激活，隨后利用富集策略篩選了該位點的抑制因子，發(fā)現(xiàn)其中兩種不同的gerAB抑制因子，即突變位點E105K降低了GerA復(fù)合物對L-丙氨酸的反應(yīng)能力，而突變位點F259S破壞了L-丙氨酸識別下游的萌發(fā)信號。這些研究結(jié)果支持了如下觀點：萌發(fā)受體GerA的B亞基負(fù)責(zé)感知外界營養(yǎng)萌發(fā)因子信號，A亞基負(fù)責(zé)將GerAB感知的營養(yǎng)信號進(jìn)行傳導(dǎo)。

萌發(fā)因子與受體蛋白結(jié)合后，萌發(fā)信號會被傳導(dǎo)到下游的效應(yīng)器。而營養(yǎng)萌發(fā)劑本身僅啟動芽孢萌發(fā)，卻并不參與代謝，目前這種信號的性質(zhì)及其傳導(dǎo)機制仍不清楚。結(jié)合之前的研究，可以推測由L-丙氨酸誘導(dǎo)的萌發(fā)過程如下（圖5）：丙氨酸首先被GerAC結(jié)合到GerAB的特定結(jié)合區(qū)域，經(jīng)過GerAB的識別后改變其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，將萌發(fā)信號傳導(dǎo)給GerAA，再由GerAA繼續(xù)將信號傳導(dǎo)至皮層水解酶SleB前體，同明促進(jìn)陽離子和Ca-DPA釋放，激活皮層水解酶CwlJ，與SleB共同水解皮層，啟動萌發(fā)[110]。

圖5 枯草芽孢桿菌萌發(fā)模型Fig.5 B. subtilis germination model

4.2 Csp型受體信號傳導(dǎo)過程

產(chǎn)氣莢膜梭菌和艱難梭菌是含有Csp型假蛋白酶的菌種。盡管產(chǎn)氣莢膜梭菌中含有Csp類假蛋白酶，但其功能不是作為萌發(fā)劑的受體，而是激活皮層水解酶SleC[38]，其萌發(fā)受體仍然是Ger型受體GerAA與GerK，其中GerKC是誘導(dǎo)萌發(fā)的唯一和必需的萌發(fā)受體[113]，盡管GerAA與GerKB受體起到鋪助作用，但GerAA是非食源型產(chǎn)氣莢膜梭菌萌發(fā)所必需的[114]（圖6）。當(dāng)萌發(fā)劑與受體結(jié)合后，將萌發(fā)信號傳導(dǎo)至CspB/A/C，三者共同激活皮層水解酶SleC前體，導(dǎo)致皮層水解，隨后Ca-DPA通道開啟，釋放核內(nèi)Ca-DPA并啟動萌發(fā)[38]。與枯草芽孢桿菌的萌發(fā)順序相反，產(chǎn)氣莢膜梭菌的皮層水解發(fā)生在Ca-DPA釋放前。

圖6 產(chǎn)氣莢膜梭菌萌發(fā)模型Fig.6 C. perfringens germination model

如前文所述，艱難梭菌不含有Ger型萌發(fā)受體，而是通過Csp型假蛋白酶感知萌發(fā)劑并啟動萌發(fā)[103]（圖7）。CspC是膽酸鹽類萌發(fā)劑的受體[39]，而CspA通過與Ca2+和甘氨酸等協(xié)同萌發(fā)劑結(jié)合來控制芽孢中CspC的水平，二者共同激活CspB，將皮層水解酶SleC酶原切割，使其變?yōu)榛钚孕问絒115]，水解皮層并打開SpoVA通道蛋白，釋放芽孢核內(nèi)Ca-DPA，啟動萌發(fā)，其萌發(fā)過程與產(chǎn)氣莢膜梭菌類似，Ca-DPA的釋放發(fā)生在皮層水解后[105]。然而萌發(fā)劑如何激活Csp型萌發(fā)受體以及其結(jié)合位點目前仍然未知。

圖7 艱難梭菌萌發(fā)模型Fig.7 C. difficile germination model

5 芽孢萌發(fā)的影響因素

5.1 環(huán)境因素

影響芽孢萌發(fā)過程的因素除了萌發(fā)因子外，還包括許多外界環(huán)境的變化，例如pH值、溫度、水分活度等。通常降低環(huán)境中的pH值會抑制芽孢的萌發(fā)，當(dāng)pH值從7.0降低至5.5明，肉毒梭菌的萌發(fā)被完全抑制[116]，而酸性pH值對枯草芽孢桿菌同樣具有抑制效果[117]。依賴萌發(fā)受體進(jìn)行萌發(fā)的芽孢可以通過熱激來增強或激活其萌發(fā)效果，該過程增加了芽孢的萌發(fā)率和萌發(fā)程度[118]。另外也有研究發(fā)現(xiàn)，降低芽孢膜外的水分活度可以有效抑制芽孢的萌發(fā)承諾階段，對單個芽孢的萌發(fā)受體依賴性萌發(fā)過程監(jiān)測表明，低水分活度對萌發(fā)承諾抑制作用最強，而對Ca-DPA釋放或皮層降解影響較小[119]。

5.2 萌發(fā)抑制劑

除了環(huán)境因素之外，還存在一些能夠抑制芽孢萌發(fā)的化合物，被稱為萌發(fā)抑制劑。在枯草芽孢桿菌中，萌發(fā)抑制劑主要分為兩類（表1），一類是抑制單一營養(yǎng)萌發(fā)因子和萌發(fā)受體結(jié)合的抑制劑，主要通過阻止Ca-DPA釋放抑制萌發(fā)過程，如大部分烷基醇、臨氯甲酚等酚類以及山梨酸鉀等有機酸[120]。這些化合物專一性抑制L-丙氨酸誘導(dǎo)的芽孢萌發(fā)，因為L-丙氨酸的類似物如D-丙氨酸被證明是有效的萌發(fā)抑制劑[121]，由此可以推測這些抑制劑的作用位點是GerA萌發(fā)受體。而藥物硝苯地平可以專一性抑制AGFK誘導(dǎo)的萌發(fā)，因此推測其可能作用于GerB或GerK萌發(fā)受體[67]。第二類萌發(fā)抑制劑可以抑制多種萌發(fā)因子誘導(dǎo)的芽孢萌發(fā)，包括HgCl2、辛酸、阿米洛利、奎寧、丁卡因、苯甲基磺酰氟和TAME等。其中阿米洛利、奎寧和丁卡因作為3 種離子通道阻滯劑，分別能抑制Na+、K+和Ca2+的離子通道，進(jìn)而抑制萌發(fā)。同明此類化合物除抑制Ca-DPA釋放外，還會顯著抑制皮層降解。需要注意的是，上述兩類萌發(fā)抑制劑的抑制效果均為可逆的，同明對于十二烷胺誘導(dǎo)的萌發(fā)均無抑制效果[67]，可能是由于十二烷胺直接作用于芽孢內(nèi)膜上的通道蛋白，促進(jìn)Ca-DPA釋放以啟動萌發(fā)，而不依賴于萌發(fā)受體蛋白[66]。

在梭狀芽孢桿菌中，萌發(fā)抑制劑通常與萌發(fā)劑結(jié)構(gòu)類似，如D-丙氨酸、D-絲氨酸和D-半胱氨酸等立體異構(gòu)體可以與其對應(yīng)的氨基酸競爭性抑制產(chǎn)孢梭菌和部分肉毒梭菌的萌發(fā)[122]（表2）。例如，6-硫鳥苷能夠抑制由肌苷介導(dǎo)的炭疽芽孢桿菌萌發(fā)[58]，鵝去氧膽酸和黃體酮及其衍生物等抑制艱難梭菌的萌發(fā)[123]。但并非所有由氨基酸誘導(dǎo)萌發(fā)的梭菌均會被萌發(fā)劑的立體異構(gòu)體抑制，如索氏梭菌[77]。此外，肉桂醛、丁香酚和香芹酚等化合物是食物中毒型產(chǎn)氣莢膜梭菌與非食源性產(chǎn)氣莢膜梭菌的萌發(fā)抑制劑[124]，但其抑制機制目前尚不清楚。

綜上所述，影響芽孢萌發(fā)的因素主要是其所處環(huán)境或萌發(fā)抑制劑，環(huán)境條件的改變主要通過影響萌發(fā)受體的活性，而大部分萌發(fā)抑制劑通過作用于不同的萌發(fā)受體，與其對應(yīng)的萌發(fā)因子產(chǎn)生可逆的競爭性抑制，從而影響芽孢的萌發(fā)。

6 結(jié)語

繼首次提出萌發(fā)因子激活萌發(fā)受體啟動萌發(fā)的觀點[125]后，眾多研究者對芽孢萌發(fā)機制進(jìn)行了大量研究并取得了顯著進(jìn)展。目前對芽孢桿菌和梭菌的萌發(fā)過程，如不同芽孢菌的萌發(fā)因子、萌發(fā)受體蛋白結(jié)構(gòu)、影響因素及其萌發(fā)機制已經(jīng)有了較為全面的了解，并能采取有效措施對芽孢進(jìn)行殺滅或抑制其萌發(fā)生長，減少食品腐敗變質(zhì)和引發(fā)食源性疾病的概率，但未來仍然有許多關(guān)鍵問題需要解決。首先，需要明確萌發(fā)受體確切功能及其在分子水平上的作用機制，而目前關(guān)于芽孢萌發(fā)機制研究多集中于萌發(fā)現(xiàn)象的觀測以及獨立萌發(fā)事件[11]，對于萌發(fā)過程中各獨立事件之間信號傳導(dǎo)機制知之甚少。其次，對梭狀芽孢桿菌萌發(fā)的研究起步較晚，導(dǎo)致對其萌發(fā)過程的理解遠(yuǎn)不及桿菌。例如，仍不清楚艱難梭菌的芽孢如何生長成為營養(yǎng)細(xì)胞。另外，芽孢的萌發(fā)具有個體差異性，存在緩慢萌發(fā)或不萌發(fā)的超休眠芽孢[126-127]，需闡明其休眠機制并尋找有效誘導(dǎo)其萌發(fā)的方法。最后，仍需進(jìn)一步探究芽孢中尚未發(fā)現(xiàn)的萌發(fā)因子或抑制劑，及其在不同芽孢菌中的作用位點、效果和影響。隨著科技水平的不斷提高，許多新工具和技術(shù)的應(yīng)用有利于更加深入地了解芽孢的萌發(fā)過程，為食品加工中芽孢的控制提供更多新的思路。