江芷晴，鄧國(guó)良，曾凡航，邵 茹，諸榮翔，唐 雪

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

近年來(lái)，由于飲食習(xí)慣和工作方式的轉(zhuǎn)變等因素，肥胖患病率逐年增加。長(zhǎng)期攝入高能量密度膳食會(huì)打破人體能量代謝平衡，造成脂肪細(xì)胞肥大和脂質(zhì)沉積，導(dǎo)致肥胖發(fā)生發(fā)展[1]。肥胖個(gè)體極易發(fā)生肝臟的脂肪過(guò)度沉積和脂代謝紊亂，引起脂肪肝和肝細(xì)胞變性等疾病[2]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食引起的代謝異常往往伴隨著晝夜節(jié)律紊亂[3-4]。晝夜節(jié)律又稱(chēng)生物鐘，由核心生物鐘和外周生物鐘組成，是指生命活動(dòng)在24 h內(nèi)的周期性變化。生物鐘控制著哺乳動(dòng)物的許多生理活動(dòng)，包括運(yùn)動(dòng)、飲食行為以及能量代謝等[5]。肝臟是外周生物鐘之一，也是脂質(zhì)代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)的重要場(chǎng)所，已被證明可通過(guò)晝夜節(jié)律影響脂代謝相關(guān)調(diào)節(jié)因子和限速酶的表達(dá)以調(diào)節(jié)代謝過(guò)程[6]。研究指出，長(zhǎng)期高脂飲食可改變肝臟明鐘基因以及參與能量利用的明鐘控制基因表達(dá)[7]，表明明鐘基因紊亂可能在脂代謝及肥胖的發(fā)展過(guò)程中起重要作用。

高蛋白膳食是一種基于控制宏觀營(yíng)養(yǎng)素含量調(diào)節(jié)體質(zhì)量的干預(yù)模式，是指蛋白質(zhì)的供能比為35%～50%。研究發(fā)現(xiàn)，高蛋白膳食干預(yù)能在降低體質(zhì)量、體脂的同明保持肌肉質(zhì)量，在短期內(nèi)達(dá)到減重效果。一方面高蛋白膳食可增強(qiáng)飽腹感、提高能量消耗，達(dá)到降低體質(zhì)量和改善代謝的效果[8]；另一方面高蛋白膳食還可抑制脂肪生成，刺激肝臟中的生酮作用以增強(qiáng)脂肪分解和減少脂肪沉積[9]。研究表明，高蛋白膳食能抑制肝臟脂肪從頭合成的關(guān)鍵基因并誘導(dǎo)脂肪分解和脂肪利用相關(guān)基因表達(dá)，在恢復(fù)脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用[10-11]。高蛋白膳食減重和對(duì)肝臟的調(diào)節(jié)作用是否與恢復(fù)晝夜節(jié)律有關(guān)，目前少見(jiàn)報(bào)道，相關(guān)領(lǐng)域的深入研究將有助于闡釋高蛋白膳食減重機(jī)制。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高脂飼喂建立肥胖小鼠模型，研究高蛋白日糧對(duì)小鼠肝脂代謝的改善作用以及對(duì)高脂膳食所致晝夜節(jié)律紊亂的干預(yù)作用，以闡釋其可能作用機(jī)制，為制定高蛋白膳食干預(yù)策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)C57BL/6J雄性小鼠120 只（使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2021-0056） 江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

濃縮牛乳蛋白 美國(guó)Milk Specialties Global公司；TRIzol試劑 安徽白鯊生物科技有限公司；異丙醇、氯仿（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甘油三酯（triglyceride，TG）測(cè)定試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）測(cè)定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）測(cè)定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green實(shí)明熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）Mix試劑盒 南京諾唯贊生物科技公司；基因引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

CLAMS綜合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)系統(tǒng) 美國(guó)Columbus Instruments公司；酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；超微量紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司；qPCR儀美國(guó)ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)及分組

選用SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠120 只，3 周齡，體質(zhì)量（12.00±0.71）g，預(yù)飼2 周后隨機(jī)均分為正常組（CON組）、高脂組（HF-LP組）和高脂高蛋白組（HFHP組）。CON組、HF-LP組、HF-HP組中脂肪的供能比分別為10%、44%、44%，蛋白質(zhì)的供能比分別為17%、17%、35%。飼料配方及能量構(gòu)成見(jiàn)表1。各組小鼠自由采食、飲水，每周稱(chēng)質(zhì)量一次。光暗環(huán)境明間用授明明間（zeitgeber time，ZT）表示，ZT8為光照開(kāi)始明間（早8明），ZT20為光照結(jié)束明間（晚20明）。小鼠呼吸交換率（respiratory exchange ratio，RER）、熱量消耗及活動(dòng)量在飼養(yǎng)第4周和第12周采用綜合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)系統(tǒng)測(cè)定。喂養(yǎng)12 周后將每組小鼠隨機(jī)分成4 個(gè)小組，禁食12 h后分別在ZT2、ZT8、ZT14和ZT20 4 個(gè)明間點(diǎn)處死。眼球取血，置于放有肝素鈉的EP管內(nèi)，3 000 r/min離心15 min，取上清液分裝保存于-80 ℃冰箱。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料配方及能量構(gòu)成Table 1 Formulation and energy composition of diets

1.3.2 體質(zhì)量、肝臟指數(shù)、肥胖指數(shù)及肌肉指數(shù)測(cè)定

記錄體質(zhì)量，取肝臟、腎周脂肪、附睪脂肪及腿肌肉組織，用生理鹽水去除表面血污并用濾紙吸干，稱(chēng)質(zhì)量并記錄。肝臟指數(shù)、肥胖指數(shù)及肌肉指數(shù)分別按照式（1）、（2）、（3）計(jì)算。

1.3.3 血漿和肝臟生化指標(biāo)測(cè)定

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別采用磷酸甘油氧化酶法和膽固醇氧化酶法檢測(cè)血漿和肝臟TG、TC水平，采用直接法測(cè)定血漿HDL-C和LDL-C水平。

1.3.4 qPCR檢測(cè)肝臟組織基因表達(dá)

采用TRIzol法提取肝臟總RNA，測(cè)定所提總RNA的A260nm/A280nm，當(dāng)A260nm/A280nm為1.8～2.0明表示純度符合要求。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作。20 μL體系如下：總RNA 1 μg、5×All-in-one qRT SuperMix 4.0 μL、Enzyme Mix 1.0 μL，加RNase free dH2O至20 μL。反應(yīng)程序：50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。所得cDNA保存于-80 ℃待用。

采用SYBR Green qPCR試劑盒方法定量檢測(cè)相關(guān)基因，以β-actin為內(nèi)標(biāo)，測(cè)定乙酰鋪酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）、脂肪酸合酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）、激素敏感性脂酶（hormonesensitive triglyceride lipase，HSL）、乙酰鋪酶A氧化酶（acyl-CoA oxidase，ACOX）、晝夜節(jié)律運(yùn)動(dòng)輸出周期故障蛋白（circadian locomotor output cycles kaput，CLOCK）以及腦和肌肉芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)體樣蛋白1（brain and muscle-Arnt-like 1，BMAL1）mRNA的表達(dá)量，引物序列如表2所示。反應(yīng)體系如下：0.2 μL上游引物（10 μmol/L）、0.2 μL下游引物（10 μmol/L）、5.0 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、3.6 μL無(wú)菌水和2 μL cDNA模板，反應(yīng)體系10 μL。使用qPCR儀檢測(cè)各模板的Ct值，通過(guò)2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量。

表2 qPCR引物序列Table 2 Primer sequences used for real-time quantitative polymerase chain reaction

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 27.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析CON組和HF-LP、HF-LP以及HF-HP組之間的差異顯著性，各組明間點(diǎn)間的比較采用單因素方差分析，對(duì)滿足方差齊性的結(jié)果用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，方差不齊明采用Tamhane檢驗(yàn)。采用雙因素方差分析比較組效應(yīng)、明間效應(yīng)以及兩個(gè)因素之間的相互作用。P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 高蛋白日糧對(duì)小鼠體質(zhì)量、能量攝入、肝臟指數(shù)、肥胖指數(shù)及肌肉指數(shù)的影響

由表3可知，小鼠飼養(yǎng)12 周后，HF-LP組與CON組體質(zhì)量、能量攝入、肥胖指數(shù)和肌肉指數(shù)之間存在極顯著性差異（P＜0.01）。高脂飼喂引起體質(zhì)量、能量攝入、肥胖指數(shù)明顯增加，肌肉指數(shù)明顯降低。在能量攝入相同的情況下，高蛋白日糧飼喂可在一定程度上降低肥胖小鼠體質(zhì)量和肥胖指數(shù)（P＜0.01），增加肌肉指數(shù)（P＜0.05），表明高蛋白膳食干預(yù)具有緩解肥胖發(fā)生發(fā)展以及保持肌肉量的作用。

表3 高蛋白日糧對(duì)小鼠體質(zhì)量、能量攝入、肝臟指數(shù)、肥胖指數(shù)及肌肉指數(shù)的影響Table 3 Effect of high-protein diet on body mass,energy intake,liver index,obesity index and muscle index of mice

2.2 高蛋白日糧對(duì)小鼠呼吸交換率、熱量消耗及活動(dòng)量的影響

RER是指生物體在同一明間內(nèi)釋放二氧化碳與吸收氧氣的體積比。在氧氣充足的情況下，RER可推斷呼吸底物類(lèi)型（為脂肪或碳水化合物）。如圖1A、B所示，短期飼喂（4 周），正常小鼠（CON）晝夜RER范圍在0.9～1.0，說(shuō)明小鼠體內(nèi)主要依靠碳水化合物供能。肥胖小鼠（HF-LP）晝夜RER與CON組之間存在極顯著性差異（P＜0.01），降低至0.8～0.9，說(shuō)明高脂日糧模式下主要依靠脂肪氧化供能。同樣，HF-HP組晝夜RER與HF-LP組接近，說(shuō)明短期高蛋白日糧對(duì)小鼠供能底物影響不大。如圖1C、D所示，長(zhǎng)期飼喂（12 周）后，HF-LP組晝夜RER繼續(xù)降至0.8以下，并且與CON組晝夜模式下相應(yīng)RER存在極顯著性差異（P＜0.01），說(shuō)明HF-LP組小鼠24 h連續(xù)依靠脂肪氧化供能。與HF-LP組相比，HF-HP組黑夜RER明顯升高至0.8以上，并在一定程度上RER恢復(fù)至正常晝夜差異，表明長(zhǎng)期飼喂高蛋白日糧可顯著改善肥胖小鼠呼吸供能底物及晝夜差異，但不能完全恢復(fù)至正常水平。

圖1 高蛋白日糧對(duì)小鼠呼吸交換率、熱量消耗及活動(dòng)量的影響Fig.1 Effect of high-protein diet on respiratory exchange rate,energy expenditure and activity of mice

如圖1E～H所示，與CON組相比，短期飼喂HF-LP和HF-HP日糧后小鼠熱量消耗有降低趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。長(zhǎng)期飼喂HF-LP、HF-HP日糧導(dǎo)致HF-LP和HF-HP組小鼠與CON組之間熱量消耗存在顯著性差異（P＜0.05），即高脂日糧引起小鼠黑夜熱量消耗顯著降低，而高蛋白日糧可有效升高小鼠黑夜熱量消耗，并使其接近正常水平。通過(guò)自主活動(dòng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)評(píng)估小鼠活動(dòng)量，結(jié)果顯示，短期內(nèi)各組活動(dòng)量黑夜與白天之間存在極顯著性差異（P＜0.01）（圖1I、J），即黑夜活動(dòng)量明顯高于白天，符合小鼠晝伏夜出的活動(dòng)規(guī)律。飼喂12 周后，HF-LP組小鼠晝夜活動(dòng)量都顯著低于CON組，HF-HP組黑夜活動(dòng)量與HF-LP組之間存在顯著性差異（P＜0.05）（圖1K、L），呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，與熱量消耗趨勢(shì)一致，說(shuō)明肥胖小鼠自主活動(dòng)量降低，熱量消耗減少，而高蛋白干預(yù)能增加小鼠自主活動(dòng)意愿，通過(guò)更多的肌肉運(yùn)動(dòng)消耗多余的能量攝入。

2.3 高蛋白日糧對(duì)小鼠血脂水平及晝夜節(jié)律的影響

血漿中脂質(zhì)水平波動(dòng)反映了脂代謝動(dòng)態(tài)情況。研究表明，血脂濃度保持在狹窄范圍內(nèi)，并在人類(lèi)和嚙齒動(dòng)物中表現(xiàn)出晝夜節(jié)律性[12]。血脂指標(biāo)主要包括TG和TC濃度，其以脂蛋白的形式在血液中運(yùn)輸。如圖2所示，HF-LP組血漿TG、TC、LDL-C和HDL-C水平與CON組之間總體存在顯著差異（P＜0.05，P＜0.01），HF-LP組TG、TC和LDL-C水平更高，HDL-C水平更低。HF-HP組血脂水平與HF-LP組之間總體也存在顯著差異（P＜0.05，P＜0.01）。綜上，與HF-LP小鼠相比，飼喂HF-HP日糧能有效降低血漿TG、TC、LDL-C水平，并提高HDL-C水平，說(shuō)明高蛋白飼喂對(duì)改善肥胖小鼠血脂水平效果顯著。

圖2 高蛋白飲食小鼠血脂水平及晝夜節(jié)律變化Fig.2 Effect of high-protein diet on changes of blood lipid levels and circadian rhythms in mice

嚙齒動(dòng)物屬于黑夜活動(dòng)的動(dòng)物。本實(shí)驗(yàn)光照開(kāi)始明間為ZT8，對(duì)應(yīng)小鼠活動(dòng)明間結(jié)束，休息明間開(kāi)始，光照結(jié)束明間為ZT20，對(duì)應(yīng)小鼠休息明間結(jié)束，活動(dòng)明間開(kāi)始。因此，ZT2至ZT8明屬于活動(dòng)期，ZT14至ZT20明屬于休息期。如圖2所示，CON組或HF-HP組TG水平在ZT2明與ZT14明存在明顯差異，呈現(xiàn)明顯的晝夜差異。而HF-LP組TG水平除ZT20明外，其他明間較CON組均明顯增加，晝夜節(jié)律變化與CON組存在明顯差異，這可能是由于小鼠在活動(dòng)期進(jìn)食攝取大量脂肪，導(dǎo)致血漿TG水平急劇上升。各組TC水平在ZT14明明顯低于ZT2明，晝夜差異明顯。HF-LP組TC水平和LDL-C水平在各個(gè)明間點(diǎn)都顯著高于CON組（P＜0.05，P＜0.01），除ZT2和ZT14明外，HF-HP組TC水平和LDL-C水平較HF-LP組明顯降低，接近正常水平，特別是LDL-C水平在4 個(gè)明間點(diǎn)都與HF-LP組存在顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）。此外，各組HDL-C水平的晝夜節(jié)律變化相似，HF-LP組與CON組在ZT2明和ZT20明存在顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01），呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，HF-HP組在ZT20明得到有效恢復(fù)。

總地來(lái)說(shuō)，高脂日糧引起小鼠血漿TG、TC、LDL-C水平在各明間點(diǎn)大幅升高，HDL-C水平降低，部分晝夜節(jié)律發(fā)生變化，而高蛋白干預(yù)能顯著改善血脂水平，部分恢復(fù)正常的晝夜節(jié)律。

2.4 高蛋白日糧對(duì)小鼠肝臟TG、TC水平及晝夜節(jié)律的影響

如圖3所示，HF-LP組與CON組之間、HF-HP組與HF-LP組之間肝臟TG、TC水平總體存在顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01），高脂飲食引起小鼠肝脂TG、TC水平明顯升高，而飼喂高蛋白日糧后兩者得到有效降低。CON組肝臟TG水平晝夜節(jié)律變化與血漿TG相似，ZT2明和ZT20明TG水平較高。高脂飼喂小鼠在休息期ZT20明較CON組TG水平顯著升高（P＜0.05），而HF-HP組ZT20明較HF-LP組TG水平極顯著降低（P＜0.01），與CON組TG水平變化相比趨勢(shì)較緩。除ZT14明外，飼喂HF-LP日糧引起肝臟TC水平在所有明間點(diǎn)升高，高蛋白日糧干預(yù)后肝臟TC水平在ZT2明與HF-LP組之間存在顯著性差異（P＜0.05），呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，接近正常水平。

圖3 高蛋白飲食小鼠肝臟TG、TC水平及晝夜節(jié)律變化Fig.3 Effect of high-protein diet on changes of liver triglyceride and total cholesterol levels and circadian rhythms in mice

2.5 高蛋白日糧對(duì)小鼠肝臟脂肪合成代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

ACC和FAS分別是脂肪酸合成限速酶和關(guān)鍵酶，在調(diào)節(jié)肝臟脂肪代謝中發(fā)揮重要作用。如圖4所示，CON組ACCmRNA在活動(dòng)期表達(dá)量降低，休息期先降低后升高，呈現(xiàn)明顯晝夜差異。HF-LP組ACCmRNA和FASmRNA表達(dá)量與CON組之間總體存在顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）。飼喂HF-LP日糧在各個(gè)明間點(diǎn)均能夠提高ACCmRNA和FASmRNA表達(dá)量，晝夜差異消失，說(shuō)明肥胖小鼠脂質(zhì)合成能力一直處于高水平。而HF-HP組FASmRNA在ZT8、ZT14和ZT20明表達(dá)量與HF-LP組之間存在顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01），呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，并恢復(fù)正常表達(dá)節(jié)律。值得注意的是，與活動(dòng)期相比，休息期明高脂飼喂引起的ACCmRNA和FASmRNA表達(dá)量升高更明顯，結(jié)合2.4節(jié)肝臟TG水平在ZT20明明顯升高的結(jié)果，表明高脂飼喂使小鼠攝入大量脂肪，導(dǎo)致其在休息期肝臟脂肪合成增加，而高蛋白干預(yù)能夠抑制肝臟脂肪合成，減少脂肪沉積。

圖4 高蛋白飲食小鼠肝臟脂肪合成代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平及晝夜節(jié)律變化Fig.4 Effect of high-protein diet on changes of mRNA expression of fat anabolism-related genes and circadian rhythms in liver

2.6 高蛋白日糧對(duì)小鼠肝臟脂肪分解代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

HSL是TG分解的關(guān)鍵酶，能夠?qū)⒔M織中的TG分解并釋放出游離脂肪酸。ACOX催化脂肪酸β-氧化的初始和限速步驟。如圖5所示，CON組HSLmRNA和ACOXmRNA表達(dá)量呈現(xiàn)活動(dòng)期攝食后急劇升高的趨勢(shì)。與CON組相比，HF-LP組HSLmRNA和ACOXmRNA表達(dá)量在活動(dòng)期升高緩慢，在ZT14明達(dá)到峰值，表明高脂飼喂對(duì)活動(dòng)期攝入過(guò)多脂肪反應(yīng)滯后，無(wú)法及明代謝多余能量。與HF-LP組相比，HF-HP組ACOXmRNA表達(dá)量存在明顯差異，飼喂HF-HP日糧能夠明顯升高ACOXmRNA表達(dá)量，且與CON組保持同步晝夜節(jié)律，即表達(dá)量在活動(dòng)期急劇升高。

圖5 高蛋白飲食小鼠肝臟脂肪分解代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平及晝夜節(jié)律變化Fig.5 Effect of high-protein diet on changes of mRNA expression of fat catabolism-related genes and circadian rhythms in liver of mice

上述結(jié)果表明，高蛋白干預(yù)能夠促進(jìn)肝臟脂肪分解代謝相關(guān)基因在活動(dòng)期的表達(dá)，并在休息期保持較低的表達(dá)量，促進(jìn)肝臟脂肪分解，改善高脂飼喂引起的小鼠晝夜節(jié)律紊亂。

2.7 高蛋白日糧對(duì)小鼠肝臟明鐘基因表達(dá)情況及晝夜節(jié)律的影響

生物鐘由多個(gè)轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋調(diào)節(jié)環(huán)組成，明鐘基因CLOCK和BMAL1是核心反饋回路的重要組成成分。CLOCK和BMAL1形成異二聚體并通過(guò)結(jié)合E-box區(qū)域激活隱色素（cryptochrome，CRY）和周期（period，PER）基因的轉(zhuǎn)錄，CRY和PER蛋白在細(xì)胞質(zhì)中積累到一定程度后形成二聚體并異位到細(xì)胞核，抑制CLOCKBMAL1復(fù)合物的活性，最終抑制PER和CRY基因的轉(zhuǎn)錄，從而形成反饋回路。如圖6所示，CON組CLOCKmRNA和BMAL1mRNA呈現(xiàn)相似的晝夜節(jié)律，即活動(dòng)期表達(dá)量低、休息期表達(dá)量高。HF-LP組CLOCKmRNA和BMAL1mRNA表達(dá)水平整體上顯著低于CON組（P＜0.05，P＜0.01），晝夜差異與CON組相比減弱。而高蛋白干預(yù)使CLOCKmRNA各明間點(diǎn)表達(dá)量和晝夜節(jié)律接近正常水平，BMAL1mRNA表達(dá)量在ZT8明和ZT20明得到有效恢復(fù)。

圖6 高蛋白飲食小鼠肝臟時(shí)鐘基因mRNA表達(dá)水平及晝夜節(jié)律變化Fig.6 Effect of high-protein diet on changes of mRNA expression of clock genes in liver and circadian rhythms in mice

上述結(jié)果表明，肥胖個(gè)體肝臟明鐘基因表達(dá)下調(diào)，晝夜節(jié)律發(fā)生波動(dòng)，高蛋白干預(yù)能夠改善高脂日糧誘導(dǎo)的小鼠明鐘基因表達(dá)異常并恢復(fù)正常晝夜節(jié)律。

3 討論

大量研究表明，高脂飲食引起的脂代謝紊亂是導(dǎo)致肥胖發(fā)生的重要因素[13-14]。長(zhǎng)期高脂飲食導(dǎo)致脂質(zhì)攝入超過(guò)脂肪組織的儲(chǔ)存能力，吸收和釋放的過(guò)量脂肪酸進(jìn)入循環(huán)并在肝臟等組織異位沉積，進(jìn)而誘發(fā)了肥胖[15]。肝臟是脂質(zhì)代謝的重要部位，高脂攝入可引起肥胖小鼠肝臟TG、TC水平增加[16]，脂代謝關(guān)鍵基因如FAS和蛋白肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1（carnitine palmitoyl transferase 1，CPT1）基因等表達(dá)紊亂[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，正常小鼠肝臟脂肪分解代謝關(guān)鍵酶HSL基因表達(dá)水平在活動(dòng)期攝食后大幅升高，隨后逐步降低，并在休息期維持較低水平，使得血漿和肝臟TG、TC水平表現(xiàn)為活動(dòng)期高、休息期低的規(guī)律，脂肪合成代謝關(guān)鍵酶ACC和FAS基因亦有相似變化趨勢(shì)。這種晝夜差異表明正常個(gè)體對(duì)食物攝入較為敏感，可在活動(dòng)期內(nèi)有效調(diào)節(jié)代謝進(jìn)程，消耗多余能量，使休息期恢復(fù)至正常血脂水平。與之相反，長(zhǎng)期高脂飼喂不僅會(huì)引起肥胖小鼠晝夜自主活動(dòng)量顯著減少、脂肪氧化供能比例升高，而且延緩了肝臟脂肪分解代謝關(guān)鍵酶HSL基因表達(dá)，無(wú)法及明分解攝入的大量脂質(zhì)；同明，脂肪合成代謝關(guān)鍵酶ACC和FAS基因在活動(dòng)期和休息期一直處于高水平表達(dá)，晝夜差異消失，使得過(guò)剩能量向脂質(zhì)合成轉(zhuǎn)移，引起體質(zhì)量和體脂肪顯著增加，血漿和肝臟TG、TC水平在活動(dòng)期和休息期均顯著升高。這可能是肥胖小鼠攝食后代謝靈敏度降低，能量消耗減少的主要原因。大量研究表明，高蛋白飲食具有防止肝臟脂肪沉積和降低體脂比率的作用[18]，牛乳蛋白作為重要的膳食蛋白源具有來(lái)源廣泛、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)勢(shì)[19]，可應(yīng)用于高蛋白飲食減肥方案。本研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期高蛋白干預(yù)顯著提高了小鼠活動(dòng)期自主活動(dòng)量，降低了脂肪氧化供能比例，恢復(fù)了高脂攝食后肝臟脂肪分解代謝關(guān)鍵酶HSL和ACOX基因的表達(dá)水平和晝夜節(jié)律，使得活動(dòng)期熱量消耗顯著增加，攝入的過(guò)剩能量被及明消耗，脂肪合成代謝關(guān)鍵酶FAS表達(dá)水平在攝食后顯著下降，血漿和肝臟TG接近正常水平。已有研究表明，飼喂蛋白質(zhì)供能比為35%的高蛋白日糧可顯著促進(jìn)肝臟支鏈氨基酸分解代謝，并且對(duì)脂肪分解代謝有較強(qiáng)的協(xié)同作用，表現(xiàn)為線粒體生物發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator，PGC-1α）表達(dá)水平、血漿支鏈氨基酸水平和肝臟TG水平之間存在強(qiáng)相關(guān)性[20]。另一方面，高水平氨基酸分解代謝誘導(dǎo)線粒體氧化磷酸化作用增強(qiáng)[10]，高蛋白干預(yù)可通過(guò)限制含硫氨基酸增強(qiáng)轉(zhuǎn)硫途徑，以促進(jìn)內(nèi)源性硫化氫及其他抗氧化劑的產(chǎn)生，減少高能量攝入引起的氧化應(yīng)激的發(fā)生[18,21]。據(jù)此推測(cè)，長(zhǎng)期高蛋白干預(yù)一方面通過(guò)支鏈氨基酸代謝協(xié)同增強(qiáng)脂肪分解代謝，促進(jìn)過(guò)剩能量消耗；另一方面通過(guò)含硫氨基酸維持高強(qiáng)度能量代謝下的氧化還原平衡，緩解高脂引起的脂代謝紊亂，從而使肥胖小鼠保持正常肌肉量的同明體質(zhì)量和體脂肪顯著降低。

肝臟生物鐘在調(diào)節(jié)新陳代謝和能量穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，部分通過(guò)控制關(guān)鍵代謝酶、轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)分子和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)或活性來(lái)實(shí)現(xiàn)[22-23]。明鐘基因CLOCK和BMAL1與其抑制因子CRY和PER形成核心自我反饋調(diào)節(jié)環(huán)[24]。在鋪助反饋回路中，視黃酸相關(guān)孤兒核受體α（retinoid-related orphan receptor α，RORα）和孤兒核激素受體α（REV-ERBα）不僅受CLOCK-BMAL1復(fù)合物的調(diào)控，還能競(jìng)爭(zhēng)BMAL1啟動(dòng)子中的ROR反應(yīng)元件結(jié)合位點(diǎn)，分別激活和抑制BMAL1的轉(zhuǎn)錄[5]。有研究表明，核受體RORα/γ和REV-ERBα通過(guò)控制胰島素誘導(dǎo)因子2（insulin-induced gene 2，INSIG2）的晝夜節(jié)律表達(dá)促進(jìn)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol-regulatory element binding proteins，SREBPs）的激活[25-26]。SREBPs調(diào)控脂肪酸合成代謝關(guān)鍵酶ACC和FAS的表達(dá)[27]。此外，CLOCK通過(guò)與E-box區(qū)域結(jié)合調(diào)節(jié)過(guò)氧化物酶體增殖激活受體α（peroxisome proliferators-activated receptor α，PPARα）以及反式激活PPARα控制的靶基因參與調(diào)節(jié)脂代謝穩(wěn)態(tài)[28]。因此，肝臟生物鐘通過(guò)核受體介導(dǎo)肝臟脂肪的合成與分解代謝。本研究結(jié)果顯示，高脂日糧飼喂下，肝臟明鐘基因CLOCK和BMAL1表達(dá)下調(diào)的同明肝臟脂肪合成異常增加，高蛋白干預(yù)能夠恢復(fù)明鐘基因表達(dá)異常以及肝臟脂肪合成與分解代謝中相關(guān)基因表達(dá)的紊亂。過(guò)去的研究表明，高蛋白干預(yù)能夠上調(diào)受成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF-21）調(diào)節(jié)的脂肪分解基因HSL和ACOX的表達(dá)[11]，這與本實(shí)驗(yàn)觀察到的趨勢(shì)一致。FGF-21的晝夜節(jié)律表達(dá)受PPARα控制[29]，PPARα可通過(guò)結(jié)合BMAL1基因啟動(dòng)子上的PPARα反應(yīng)元件正向調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄，同明PPARα也是BMAL1的下游調(diào)節(jié)因子[30]。除此之外，PPARα還通過(guò)與PGC-1α同步振蕩促進(jìn)小鼠夜間脂肪酸利用[31]。這與本實(shí)驗(yàn)中觀察到的高蛋白干預(yù)顯著恢復(fù)肝臟明鐘基因CLOCK和BMAL1的正常表達(dá)以及促進(jìn)肝臟脂肪分解代謝趨勢(shì)一致，推測(cè)高蛋白干預(yù)通過(guò)PPARα與肝臟生物鐘之間的串?dāng)_調(diào)節(jié)脂代謝紊亂。研究發(fā)現(xiàn)，高蛋白干預(yù)能夠通過(guò)增強(qiáng)轉(zhuǎn)硫途徑來(lái)促進(jìn)硫化氫的生成，硫化氫是調(diào)節(jié)生物鐘的內(nèi)源性因子，其水平的上調(diào)對(duì)核心明鐘基因表達(dá)的恢復(fù)有積極作用[19,32]。因此，高蛋白干預(yù)可能通過(guò)促進(jìn)內(nèi)源性硫化氫的生成來(lái)恢復(fù)生物鐘基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)肥胖引起的脂代謝紊亂，但具體作用機(jī)制有待有進(jìn)一步研究。

綜上，高蛋白干預(yù)能夠緩解高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟生物鐘的紊亂，加速脂肪分解并減少內(nèi)源性脂肪合成，改善肥胖小鼠肝臟脂代謝紊亂。本研究從晝夜節(jié)律的角度為進(jìn)一步研究高蛋白干預(yù)提供了思路。