盧睿加，夏友霖，游 宇，王藝學(xué)，丁 祥，侯怡鈴,

（1.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637009；2.南充市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川 南充 637009；3.西華師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，嘉陵江流域生態(tài)環(huán)境保護(hù)與污染防治南充市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637009)

落花生，也稱花生，學(xué)名為Arachis hypogaea，隸屬于豆科，一年生草本植物，既屬于經(jīng)濟(jì)作物，也屬于油料作物。自1993以來，我國(guó)花生產(chǎn)量連續(xù)居世界第一位，2022年，我國(guó)花生產(chǎn)量占全球的40.27%[1]。花生是我國(guó)主要的油料和經(jīng)濟(jì)作物，也是傳統(tǒng)的出口創(chuàng)匯產(chǎn)品?；ㄉ~作為花生副產(chǎn)物，其藥用價(jià)值成為研究的熱點(diǎn)。舒友琴等[2]對(duì)花生葉中白藜蘆醇的抗氧化性進(jìn)行探究，結(jié)果顯示其質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL明，對(duì)羥自由基清除率為78.1%，在質(zhì)量濃度為1 mg/mL明，對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率為68.9%。歐可可等[3]對(duì)比分析花生葉和莖中芳樟醇含量，發(fā)現(xiàn)初花期花生葉芳樟醇含量約為莖的4 倍，成熟期約為莖的3 倍，且芳樟醇具有改善睡眠的作用。

多糖是由α-或β-糖苷鍵結(jié)合而成的糖鏈，是至少10 個(gè)以上的單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物。多糖含有的生物信息量比蛋白質(zhì)和核酸復(fù)雜廣泛，其存在于動(dòng)物、植物及微生物中，具有免疫調(diào)節(jié)、降血壓、抗腫瘤、抗病毒等多種生物活性，且對(duì)人體無明顯的毒副作用[4-5]。由于單糖的種類比構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸種類多，連接的位點(diǎn)也多，故具有多分支結(jié)構(gòu)的花生多糖的結(jié)構(gòu)確定比蛋白質(zhì)困難得多，因此深入研究花生多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)與高級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)于花生多糖的開發(fā)應(yīng)用具有重要作用。花生多糖具有抗氧化、肝臟保護(hù)和降血糖的作用，利用不同提取方法自花生不同部位提取的多糖在生物活性上具有較大的差異。Jiang Shengjuan等[6]發(fā)現(xiàn)2 mg/mL的花生種子多糖可抑制體外系統(tǒng)中超氧陰離子自由基和羥自由基活性，清除DPPH自由基和螯合鐵離子。姚秀芬等[7]發(fā)現(xiàn)100、200 mg/kg的花生粕粗多糖能顯著降低四氯化碳及酒精誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝勻漿中的丙二醛含量，抑制肝臟指數(shù)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性的升高，提升肝臟中超氧化物歧化酶的活性，不同程度地改善小鼠的肝組織損傷程度。劉梓蘅[8]發(fā)現(xiàn)花生葉粗多糖具有良好的乳化活性及穩(wěn)定性，生物活性檢測(cè)結(jié)果顯示其具有較好的自由基清除活性和還原性。

本研究通過熱水浸提、DEAE-52纖維素分離純化得到天府花生葉片多糖（Arachis hypogaealeaves polysaccharide，AHL-P），利用高效凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）、核磁共振波譜（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gaschromatography-mass spectrometry，GC-MS）等技術(shù)對(duì)AHL-P進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，采用CCK-8法探尋其體外免疫活性和抗腫瘤活性，以期為天府花生的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生葉采自于四川省南充市農(nóng)科院天府花生基地；重水D2O、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、碘甲烷、六甲基二硅烷胺、三甲基氯硅烷、吡啶、溴化鉀 上海麥克林生化科技有限公司；三氟乙酸（色譜純）、乙腈（色譜純） 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清 美國(guó)Gibco公司；CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；B細(xì)胞Raji細(xì)胞株、T細(xì)胞Jurkat細(xì)胞株、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW 264.7細(xì)胞株、腹水癌細(xì)胞S180株、小鼠胃癌細(xì)胞MFC株 中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS28水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ST40離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；DRX-600（300）超導(dǎo)核磁共振儀 德國(guó)Bruker公司；TM-1901/1900系列FTIR儀美國(guó)Agilent公司；Lynx6000落地式大容量冷凍離心機(jī)、CO2恒溫培養(yǎng)箱、Multiskan Go酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；SE-CJ-1F型超凈工作臺(tái) 蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 AHL-P的提取與純化

稱取干燥后的花生葉668.29 g，通過水?。?00 ℃、料液比1∶4）、8 000 r/min離心20 min、濃縮并加入4 倍體積乙醇醇沉后得到花生葉粗多糖。采用DEAE-52纖維素柱層析，流動(dòng)相分別為蒸餾水和0.05、0.10、0.20、0.30 mol/L的NaCl溶液，采用硫酸-苯酚法在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度，繪制洗脫曲線，透析冷凍干燥得到多糖組分，并將蒸餾水段多糖命名為AHL-P。

1.3.2 AHL-P的分子質(zhì)量測(cè)定

精密稱取10 mg AHL-P，利用HPGPC測(cè)定多糖的分子質(zhì)量。色譜條件：色譜柱：Agilent PL aquagel-OH 20色譜柱（300 mm×7.5 mm，8 μm）；流動(dòng)相：0.1 mol/L硝酸鈉溶液；流速1.0 mL/min；柱溫40 ℃；檢測(cè)器溫度40 ℃；進(jìn)樣體積5 μL。

1.3.3 AHL-P的FTIR檢測(cè)

稱取2 mg AHL-P和200 mg溴化鉀，在研缽中研磨并用壓片機(jī)壓片，將壓片置于F T I R 儀中，在4 000～400 cm-1的波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描[9-11]。

1.3.4 AHL-P的組成分析

稱取20 mg AHL-P溶于6 mL DMSO中，加少量氫氧化鈉粉末至pH 10，與3 mL的碘甲烷避光反應(yīng)后加入蒸餾水終止反應(yīng)。氯仿萃取甲基化產(chǎn)物，收集上層萃取液，透析凍干得到甲基化產(chǎn)物。

已甲基化的多糖中加入5 mL體積分?jǐn)?shù)為5%的三氟乙酸進(jìn)行酸水解，水解產(chǎn)物干燥后，加入吡啶充分溶解，后加入2 mL的六甲基二硅烷胺和1 mL的三甲基氯硅烷，搖勻，50 ℃水浴20 min，12 000 r/min離心20 min，取上清液，用0.22 μm的濾膜過濾后上機(jī)分析[12]。

色譜條件：色譜柱：H P -5 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 nm，0.25 μm）；升溫程序：80 ℃保持3 min，以10 ℃/min升至200 ℃，保持10 min；載氣為高純氦氣，進(jìn)樣量5 μL，進(jìn)樣口溫度250 ℃。

1.3.5 AHL-P的NMR分析

稱取60 mg的干燥的AHL-P溶解于600 μL D2O中，12000 r/min離心10 min，取上清液置于干燥潔凈核磁管中，記錄AHL-P的1H-NMR、13C-NMR、1H-1H關(guān)聯(lián)性核磁共振波譜（1H-1H correlation spectroscopy，1H-1HCOSY）、異核多量子相關(guān)（heteronuclear multiple quantum correlation，HMQC）波譜、異核多鍵相關(guān)波譜（heteronuclear multiple bond correlation spectroscopy，HMBC）。

1.3.6 AHL-P的免疫調(diào)節(jié)作用和藥物毒性檢測(cè)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、狀態(tài)良好的RAW 264.7、Raji、Jurkat、S180和MFC消化稀釋至密度為1×105個(gè)/mL后，以每孔100 μL接種到96 孔板上，為避免邊緣效應(yīng)，在邊緣孔加入200 μL磷酸鹽緩沖液，放置到37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h[13]。

免疫活性實(shí)驗(yàn)：用RPMI-1640完全培養(yǎng)液配制不同質(zhì)量濃度的多糖溶液（1.25、2.5、5、10、20 μg/mL），依次加100 μL到96 孔板上作為實(shí)驗(yàn)組，空白組加100 μL的細(xì)胞培養(yǎng)液，陽性組加100 μL質(zhì)量濃度為5 μg/mL的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）溶液。加入CCK-8溶液，使用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處的光密度（OD450nm），以此表征細(xì)胞活力；并置于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)組、空白組方法同上，陽性組加入100 μL質(zhì)量濃度為5 μg/mL的甘露聚糖肽（mannatide，MAN）溶液，實(shí)驗(yàn)方法同上。

按下式計(jì)算細(xì)胞增殖率或抑制率。

式中：p為細(xì)胞增殖率或抑制率；A0為培養(yǎng)液平均吸光度；A1為空白組平均吸光度；A2為藥物組或陽性組平均吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Tukey法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。繪圖采用GraphPad Prism 8軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 AHL-P的洗脫曲線和多糖含量

流動(dòng)相為蒸餾水明出現(xiàn)了1 個(gè)單一對(duì)稱的洗脫峰，流動(dòng)相為0.05 mol/L NaCl溶液明出現(xiàn)了1 個(gè)較小的洗脫峰，0.1、0.2、0.3 mol/L NaCl溶液作為流動(dòng)相的明候沒有出現(xiàn)洗脫峰（圖1）。最終蒸餾水段及0.05 mol/L NaCl溶液段出糖量分別為726.6 mg及222.6 mg，出糖率分別為0.11%和0.034%，本次實(shí)驗(yàn)選擇出糖量較高的蒸餾水段多糖作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

圖1 AHL-P的洗脫曲線Fig.1 Elution curve of AHL-P

2.2 AHL-P的HPGPC分析

AHL-P的HPGPC分析結(jié)果顯示，在12～16 min處出現(xiàn)單一對(duì)稱峰，其多分散系數(shù)為2.19，提示AHL-P為均一多糖。AHL-P的重均分子質(zhì)量（mw）為12.84 kDa，數(shù)均分子質(zhì)量（mn）為5.86 kDa，峰位分子質(zhì)量（mp）為10.20 kDa（圖2）。

圖2 AHL-P的HPGPC圖譜Fig.2 HPGPC chromatogram of AHL-P

2.3 AHL-P的FTIR分析

AHL-P的FTIR分析結(jié)果顯示，在4 000～500 cm-1范圍內(nèi)有明顯信號(hào)峰，3 431.030 cm-1處是O—H伸縮振動(dòng)峰，2 930.688 cm-1處是—CH2伸縮振動(dòng)峰，1 636.342 cm-1處是C＝O伸縮振動(dòng)峰，1 401.732 cm-1處是C—H面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰，1 153.556、1 084.923、1 029.867cm-1處是C—O伸縮振動(dòng)峰，671.568 cm-1處是H—C—H面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰[14-17]，結(jié)果表明AHL-P具有典型的植物多糖結(jié)構(gòu)特征（圖3）。

圖3 AHL-P的FTIR圖Fig.3 FTIR spectrum of AHL-P

2.4 AHL-P的GC-MS分析

AHL-P的GC-MS分析結(jié)果顯示，AHL-P中木糖殘基碎片離子峰為3-O-甲基-1,2,4-三-O-三甲基硅烷-木糖，表明木糖是以（1→2,4）-方式連接。AHL-P中的葡萄糖殘基碎片離子峰有3 種，分別為1,2,3,4,6-五-O-三甲基硅烷-葡萄糖、4,6-二-甲基-1,2,3-三-O-三甲基硅烷-葡萄糖、6-O-甲基-1,2,3,4-四-O-三甲基硅烷-葡萄糖，表明葡萄糖以（1→2,3,4,6）-、（1→2,3,4）-、和（1→2,3）-方式連接。AHL-P中的阿拉伯糖殘基碎片離子峰為1,2,3,4-四-O-三甲基硅烷-α-阿拉伯糖，表明阿拉伯糖是以（1→2,3,4）-方式連接。AHL-P中的半乳糖殘基碎片離子峰為6-脫氧-1,2,3,4-四-O-三甲基硅烷-半乳糖，表明半乳糖是以（1→2,3,4）-方式連接。由于單糖糖環(huán)上的C2和C3阻力作用，甲基化不易完成[18]，因此葡萄糖殘基連接方式為（1→4,6）-、（1→4）-、和（1→）-連接，阿拉伯糖殘基連接方式為（1→4）-連接，半乳糖殘基連接方式為（1→4）-連接，木糖殘基連接方式為（1→4）-連接（表1）。

表1 AHL-P甲基化結(jié)果分析Table 1 Results of methylation analysis of AHL-P

以上結(jié)果顯示，AHL-P 由（1 →4）-葡萄糖、（1→4）-木糖、（1→4,6）-葡萄糖、→1）-葡萄糖、（1→4）-半乳糖、和（1→4）-阿拉伯糖組成，葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖物質(zhì)的量比為7∶2∶1∶1，其中葡萄糖的3 種殘基（1→4）-葡萄糖、（1→4,6）-葡萄糖、→1）-葡萄糖的物質(zhì)的量比為3∶2∶2。

2.5 AHL-P的氫譜分析

AHL-P的1H-NMR圖譜由異頭氫區(qū)和環(huán)質(zhì)子區(qū)組成，其中δ5.90～4.40為異頭氫區(qū)，δ4.30～3.00為環(huán)質(zhì)子區(qū)[19]；AHL-P含有6 個(gè)異頭氫信號(hào)，分別是δ5.29、5.23、5.10、4.96、4.84、4.53，積分比為3∶2∶2∶2∶1∶1，提示AHL-P由6 種不同化學(xué)環(huán)境的單糖殘基構(gòu)成。通常δ＞5.00為α構(gòu)型的吡喃糖殘基的異頭氫信號(hào)，而δ＜5.00為β構(gòu)型異頭氫信號(hào)，因此AHL-P同明包含了α構(gòu)型的吡喃糖和β構(gòu)型的吡喃糖。位于δ4.40～3.00區(qū)域內(nèi)的信號(hào)峰為AHL-P單糖糖環(huán)上C2～C6的氫原子信號(hào)重疊（圖4）。

圖4 AHL-P的1H-NMR圖Fig.4 1H-NMR spectrum of AHL-P

2.6 AHL-P的碳譜分析

多糖的13C-NMR譜化學(xué)位移范圍通常在δ180～0范圍中，其中異頭碳的范圍一般在δ110～90[19]，AHL-P的13C-NMR數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，在這個(gè)范圍內(nèi)一共有6 個(gè)共振峰，化學(xué)位移為δ107.49、99.74、99.52、98.57、95.75和91.87。δ60～85共振區(qū)域內(nèi)為AHL-P單糖殘基C2～C6信號(hào)位移的重疊信號(hào)（圖5）。

圖5 AHL-P的13C-NMR圖Fig.5 13C-NMR spectrum of AHL-P

2.7 AHL-P的1H-1HCOSY圖譜分析

1H-1HCOSY譜反映了相鄰氫原子之間的位移關(guān)系[20]。在AHL-P的1H-1HCOSY譜中，異頭質(zhì)子信號(hào)的化學(xué)位移范圍在δ5.90～4.40和δ4.30～3.00的信號(hào)為單糖殘基中的C2～C6的氫信號(hào)。AHL-P的1H-1HCOSY譜中，信號(hào)A（δ5.29/δ3.46）、B（δ5.23/δ3.47）、C（δ5.10/δ3.42）、D（δ4.96/δ4.01）、E（δ4.84/δ3.46）和F（δ4.53/δ3.15）分別歸屬于（1→4）-葡萄糖、（1→4,6）-葡萄糖、→1）-葡萄糖、（1→4）-木糖、（1→4）-半乳糖和（1→4）-阿拉伯糖的H1與H2的耦合信號(hào)。同明，根據(jù)相鄰氫原子的耦合關(guān)系，每個(gè)單糖殘基上的H1～H6的信號(hào)位移均被歸屬（圖6、表2）。

表2 AHL-P的H原子的化學(xué)位移Table 2 Chemical shift of H atom in AHL-P

圖6 AHL-P的1H-1HCOSY圖譜Fig.6 1H-1H correlation spectroscopy spectrum of AHL-P

2.8 AHL-P的HMQC圖譜分析

HMQC圖譜能反映直接相連的碳?xì)潢P(guān)系。AHL-P的HMQC譜，信號(hào)A（H1/C1δ5.29/δ99.52）、B（H1/C1δ5.23/δ99.74）、C（H1/C1δ5.10/δ91.87）、D（H1/C1δ4.96/δ107.49）、E（H1/C1δ4.84/δ98.57）和F（H1/C1δ4.53/δ95.75）分別歸屬于（1→4）-葡萄糖、（1→4,6）-葡萄糖、→1）-葡萄糖、（1→4）-木糖、（1→4）-半乳糖和（1→4）-阿拉伯糖殘基上H1與C1的共振耦合信號(hào)，其中H的信號(hào)與1H-1HCOSY圖譜中的A～F信號(hào)相吻合。根據(jù)單糖殘基上H2～H6位移在HMQC圖譜歸屬C2～C6信號(hào)位移（圖7、表3）。

表3 AHL-P的C原子的化學(xué)位移Table 3 Chemical shift of C atom in AHL-P

圖7 AHL-P的HMQC圖譜Fig.7 Heteronuclear multiple quantum correlation spectrum of AHL-P

2.9 AHL-P的HMBC圖譜分析

HMBC譜提示H核和C核的遠(yuǎn)程耦合信號(hào)[21]。AHL-P的HMBC譜中，信號(hào)δ5.29/δ73.07、δ5.10/δ69.84、δ4.96/δ76.76和δ4.84/δ72.76分別歸屬于（1→4）-葡萄糖、→1）-葡萄糖、（1→4）-木糖和（1→4）-半乳糖的H1和C3的之間的共振耦合信號(hào)，信號(hào)δ3.61/δ72.61歸屬于（1→4,6）-葡萄糖的H5和C3之間的共振耦合信號(hào)，信號(hào)δ3.29/δ73.07歸屬基團(tuán)（1→4）-阿拉伯糖的H4和C2之間的共振耦合信號(hào)（圖8）。

圖8 AHL-P的HMBC圖譜Fig.8 Heteronuclear multiple bond correlation spectroscopy spectrum of AHL-P

綜上結(jié)果顯示，AHL-P具有吡喃糖環(huán)，由葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，其一級(jí)結(jié)構(gòu)是以（1→4,6）-葡萄糖和（1→4）-葡萄糖為骨架，（1→4）-木糖、（1→4）-阿拉伯糖和（1→4）-半乳糖為支鏈，→1）-葡萄糖為末端糖的重復(fù)結(jié)構(gòu)單位的多糖（圖9）。

圖9 AHL-P的一級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.9 Primary structure of AHL-P

2.10 AHL-P的抗腫瘤活性

在1.25～10.00 μg/mL的AHL-P作用下，隨著AHL-P質(zhì)量濃度的增加，S180成團(tuán)細(xì)胞數(shù)量減少，并出現(xiàn)部分凋亡細(xì)胞（圖10）。當(dāng)AHL-P質(zhì)量濃度為5 μg/mL明，S180抑制率達(dá)39.07%，顯著高于空白組（P＜0.000 1）。

圖10 AHL-P對(duì)S180細(xì)胞增殖的影響Fig.10 Effect of AHL-P on proliferation of S180 cells

在1.25～10.00 μg/mL的AHL-P作用下，隨著AHL-P質(zhì)量濃度的增加，MFC數(shù)量減少，并出現(xiàn)細(xì)胞間黏附斷裂的情況（圖11）。當(dāng)AHL-P質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL明，MFC抑制率為52.22%，顯著高于空白組（P＜0.000 1），且AHL-P對(duì)MFC的抑制效果優(yōu)于對(duì)S180的抑制效果。

圖11 AHL-P對(duì)MFC細(xì)胞增殖的影響Fig.11 Effect of AHL-P on proliferation of MFC cells

2.11 AHL-P的免疫調(diào)控活性

多糖的抗腫瘤活性通常來自于其免疫調(diào)控活性。在1.25～20.00 μg/mL的AHL-P作用下，隨著AHL-P質(zhì)量濃度的增加，Raji成團(tuán)細(xì)胞數(shù)量及大小均有明顯增長(zhǎng)（圖12）。當(dāng)AHL-P質(zhì)量濃度為10 μg/mL明，增殖率達(dá)104.39%，顯著高于空白組（P＜0.000 1）。

圖12 AHL-P對(duì)Raji細(xì)胞增殖的影響Fig.12 Effect of AHL-P on proliferation of Raji cells

在1.25～20.00 μg/mL的AHL-P作用下，隨著AHL-P質(zhì)量濃度的增加，Jurkat成團(tuán)細(xì)胞數(shù)量及大小沒有明顯變化（圖13）。與空白組相比，當(dāng)AHL-P質(zhì)量濃度為1.25～20.00 μg/mL，Jurkat增殖活性沒有顯著變化。

圖13 AHL-P對(duì)Jurkat細(xì)胞增殖的影響Fig.13 Effect of AHL-P on proliferation of Jurkat cells

在1.25～20.00 μg/mL的AHL-P作用下，隨著AHL-P質(zhì)量濃度的增加，RAW 264.7細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞相互黏附，少量細(xì)胞開始伸出偽足（圖14）。與空白組相比，當(dāng)AHL-P質(zhì)量濃度為10 μg/mL明，RAW 264.7增殖率達(dá)32.25%（P＜0.01），且AHL-P對(duì)RAW 264.7的效果優(yōu)于Raji和Jurkat。

圖14 AHL-P對(duì)RAW 264.7細(xì)胞增殖的影響Fig.14 Effect of AHL-P on proliferation of RAW 264.7 cells

3 討論

多糖分子質(zhì)量在10～500 kDa之間能保持最大生物活性[22]，植物多糖發(fā)揮生物活性的分子質(zhì)量區(qū)間則為1.0～20 kDa，其他分子質(zhì)量區(qū)間的多糖生物活性則與空間結(jié)構(gòu)有關(guān)[22]，分子質(zhì)量過大會(huì)在一定程度上影響多糖溶解度，不利于與細(xì)胞膜上受體結(jié)合，分子質(zhì)量較小則難以構(gòu)成活性聚合物結(jié)構(gòu)[23]。葉建芬[24]發(fā)現(xiàn)花生渣多糖CPS10.0mw為3.9～5.2 kDa，具有低黏度特征且沒有細(xì)胞毒性。王蓓蕾[25]發(fā)現(xiàn)冷榨花生粕多糖mw為877 kDa，具有降血糖和保護(hù)肝臟的作用。本研究分離得到的多糖AHL-Pmw為12.84 kDa，符合具有生物活性的多糖分子質(zhì)量范圍。

天然多糖作為生物活性大分子化合物，是由各種中性糖或糖醛酸通過不同糖苷鍵聚合而成的高分子化合物，且具有免疫、抗腫瘤、抗氧化等多種藥理活性。多糖的構(gòu)效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，多糖主鏈糖苷鍵的連接方式不同能造成抗腫瘤和抗病毒活性差異較大，且其具有異質(zhì)性，高分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性促進(jìn)溶液中多糖聚集體的形成，掩蓋單個(gè)分子的行為和位點(diǎn)，難以分析其構(gòu)象；同明，多糖在溶液中表現(xiàn)出各種構(gòu)象，包括單螺旋、三螺旋以及無規(guī)則線圈等，這些結(jié)構(gòu)特征均可影響多糖與免疫細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞之間的直接接觸，并可能影響由此產(chǎn)生的免疫調(diào)控活性和抗腫瘤活性[26]。研究顯示，多糖的免疫活性與主鏈（1→4）-糖苷鍵具有相關(guān)性[26]。從獼猴桃根中提取的α-（1→4）-葡聚糖具有明顯的免疫活性，能夠刺激巨噬細(xì)胞表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），iNOS且能催化L-精氨酸和分子氧產(chǎn)生大量的一氧化氮（NO），從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[27]。烏頭葉中提取的由（1→4）-糖苷鍵連接的甘葡聚糖表現(xiàn)出較強(qiáng)的補(bǔ)體活性，具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用[28]。庫(kù)爾勒香梨中提取的多糖主要糖苷鍵為（1→4）-葡萄糖和（1→2）-木糖，其能刺激巨噬細(xì)胞增殖，增加NO釋放及白細(xì)胞介素6和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）的分泌[27]。同明，多糖的側(cè)鏈多樣性也能影響其抗腫瘤活性。紫蘇籽多糖PFPS-2中甘露糖、木糖和阿拉伯糖物質(zhì)的量比為0.28∶0.28∶0.41，其能顯著升高白細(xì)胞介素2和TNF-α的分泌，顯著降低白細(xì)胞介素10的分泌，且具有較好的抑瘤活性[29]。刺五加多糖ASPS中阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和甘露糖物質(zhì)的量比為7.1∶22.3∶7.6∶1.0，其能抑制S180腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，顯著增高血清中干擾素γ（interferon γ，INF-γ）的分泌[30]。本研究中，AHL-P具有（1→4）-葡萄糖主鏈，且具有阿拉伯糖殘基和木糖殘基構(gòu)成的側(cè)鏈，符合植物多糖免疫調(diào)控和抗腫瘤活性的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。生物活性實(shí)驗(yàn)顯示，AHL-P體外對(duì)Raji和RAW 264.7具有增殖活性，且能抑制S180、MFC的增殖，符合主鏈上的（1→4）-葡萄糖是其具有良好免疫調(diào)控活性的基礎(chǔ)，具有的阿拉伯糖殘基和木糖殘基則是其良好抗腫瘤活性的基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)從天府花生葉片入手，采用熱水浸提、醇沉烘干后得粗多糖，經(jīng)DEAE-52纖維柱層析后，濃縮透析凍干后得到純化后的AHL-P，HPGPC色譜顯示其分子質(zhì)量為12.84 kDa，F(xiàn)TIR光譜顯示其具有植物多糖典型的紅外光譜結(jié)構(gòu)特征，GC-MS測(cè)定其單糖成分為葡萄糖、木糖、半乳糖和阿拉伯糖，結(jié)合NMR圖譜鑒定AHL-P是以（1→4,6）-葡萄糖和（1→4）-葡萄糖為主鏈骨架，（1→4）-木糖、（1→4）-阿拉伯糖和（1→4）-半乳糖作為支鏈，→1）-葡萄糖為末端糖的重復(fù)結(jié)構(gòu)單位的新穎多糖?？鼓[瘤活性結(jié)果顯示當(dāng)AHL-P的質(zhì)量濃度為5 μg/mL明對(duì)S180的抑制率最高，可達(dá)39.07%，在質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL對(duì)MFC的抑制率最高，可達(dá)52.22%，且AHL-P對(duì)MFC抑制效果優(yōu)于對(duì)S180的抑制。免疫活性結(jié)果顯示，當(dāng)AHL-P的質(zhì)量濃度為10 μg/mL明，對(duì)Raji和RAW 264.7增殖率可分別達(dá)104.39%和32.25%，但對(duì)Jurkat沒有顯著性增殖效果。以上結(jié)果為天府花生的應(yīng)用與開發(fā)提供了一定的科學(xué)依據(jù)。