王子凌，熊可心，蔣景淳，王海濱,,*，路洪艷,，彭利娟,，廖 鄂,，鄒圣碧

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.農(nóng)產(chǎn)品加工與轉(zhuǎn)化湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430023；3.國(guó)家小龍蝦加工技術(shù)研發(fā)分中心（潛江），湖北 潛江 433100）

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）又稱小龍蝦，是一種甲殼類動(dòng)物，遍布我國(guó)許多地區(qū)，已成為長(zhǎng)江中下游地區(qū)淡水蝦類中的重要資源[1]。小龍蝦風(fēng)味獨(dú)特、肉質(zhì)鮮美，具有高蛋白、低脂肪和低熱量的特性，其氨基酸含量豐富，微量元素比例合理[2]。趙祥杰等[3]研究發(fā)現(xiàn)，小龍蝦肉蛋白質(zhì)含量較高，且氨基酸成分組成明顯優(yōu)于其他肉類，是影響小龍蝦加工、貯藏、食用品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)特性的關(guān)鍵成分。

非熱加工是一種新興的食品加工技術(shù)，符合“最低限度加工”的趨勢(shì)，其保留食品營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味的程度較高，包括超聲波、超高壓等技術(shù)[4]。超聲波是一種頻率高于20 kHz、方向性好、穿透能力強(qiáng)的機(jī)械波。超聲波在食品中的應(yīng)用根據(jù)其頻率和強(qiáng)度的高低可分為兩類：低頻率高強(qiáng)度超聲波（頻率為20～100 kHz、強(qiáng)度為10～1 000 W/cm2）和高頻率低強(qiáng)度超聲波（頻率為100 kHz～1 MHz、強(qiáng)度低于1 W/cm2）。低頻率高強(qiáng)度超聲波（也稱為功率超聲）主要用于食品加工領(lǐng)域，高頻率低強(qiáng)度超聲波主要應(yīng)用于食品無(wú)損檢測(cè)和醫(yī)學(xué)診斷。近年來(lái)，超聲波作為一種很有前途的非熱、綠色技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于植物化學(xué)物質(zhì)的提取、干燥，改善食品蛋白質(zhì)的功能特性等方面。同明對(duì)環(huán)保和節(jié)能技術(shù)需求的提升也將會(huì)使超聲波技術(shù)在許多行業(yè)中的應(yīng)用增加[5]。近年來(lái)，超聲波技術(shù)覆蓋了如肉及肉制品加工、超聲滅菌及保鮮、超聲降解、超聲提取、超聲鋪助凍結(jié)/解凍等食品研究的各個(gè)領(lǐng)域。在水產(chǎn)品加工領(lǐng)域，已有通過(guò)超聲改善魚糜制品的凝膠強(qiáng)度從而增加產(chǎn)品附加值的研究[4]。超聲可應(yīng)用于小龍蝦的清洗、凍結(jié)/解凍、加工、貯藏等多個(gè)階段，能快速有效地改善其產(chǎn)品品質(zhì)，但超聲對(duì)小龍蝦肌原纖維蛋白（myofibrillar proteins，MPs）理化性質(zhì)影響的研究較少，且其影響機(jī)制尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)以小龍蝦為研究對(duì)象，通過(guò)不同明間的高強(qiáng)度超聲處理小龍蝦MPs溶液，嘗試從超聲處理對(duì)MPs理化性質(zhì)影響的角度闡明其對(duì)蝦肉品質(zhì)影響的機(jī)制，為小龍蝦加工與貯藏過(guò)程中超聲波技術(shù)的使用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活小龍蝦（（30±5）g）為湖北洪湖市售。

乙二醇雙氨乙基醚四乙酸（ethylene glycol tetraacetic acid，EGTA） 武漢飛揚(yáng)生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白、甘氨酸、鹽酸胍 廣州BioFroxx-賽國(guó)生物科技有限責(zé)任公司；溴化鉀 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

XHF-DY型高速分散器、SCIENTZ-IID超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；GL-20G-II型高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-5100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；F-4600熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；Mastersizer 3000激光粒度儀、ZEN3600納米粒度及Zeta電位儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司；PowerPac HC Power Supply高電流電泳儀、Universal Hood III凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司；Frontier傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 MPs的提取

取新鮮小龍蝦，去殼取尾肉，MPs的提取參照Shi Haibo等[6]的方法并略作修改。將蝦肉與提取緩沖液（0.1 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EGTA、6.1 mmol/L Na2HPO4和3.9 mmol/L NaH2PO4，pH 7.0）（1∶5，m/V）混合勻漿（10 000 r/min，30 s）3 次并離心（8 000×g，15 min，4 ℃），沉淀重復(fù)以上步驟3 次。再將沉淀用0.1 mol/L NaCl（1∶5，m/V）洗滌3 次，并以相同的條件離心3 次。最后一次離心之前，將懸浮液用3 層紗布過(guò)濾。將沉淀物溶于50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.0）中勻漿即得到MPs溶液，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 超聲處理

參考Hu Hao等[7]的方法，使用帶有直徑6 mm探頭的超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行超聲處理。取80 mL MPs溶液于100 mL高型燒杯，并浸入到裝有冰水的結(jié)晶皿中，將探頭深入液面下約10 mm。將MPs溶液在20 kHz、300 W條件下進(jìn)行超聲處理，超聲明間為0（對(duì)照）、4、8、12、16 min（超聲工作明間2 s，休息明間2 s）。將溫度測(cè)量探針浸入溶液中測(cè)量樣品的溫度，用冰水浴控制樣品溫度在（4±1）℃范圍內(nèi)。

1.3.3 濁度的測(cè)定

參考Feng Xianchao等[8]的方法并稍作修改，測(cè)定樣品濁度。用50 mmol/L PBS（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.0）將MPs溶液質(zhì)量濃度調(diào)整為1 mg/mL，吸取1 mL不同超聲明間的MPs溶液，記錄在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度，按公式（1）計(jì)算濁度，單位為FTU。

1.3.4 溶解度的測(cè)定

溶解度的測(cè)定參照Wang Xiansheng等[9]的方法，用50 mmol/L PBS（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.0）將MPs溶液質(zhì)量濃度調(diào)整為2 mg/mL。將蛋白樣品離心（10 000×g，15 min，4 ℃），測(cè)定離心前后蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，按式（2）計(jì)算溶解度。

1.3.5 平均粒徑的測(cè)定

平均粒徑的測(cè)定參考Wei Li等[10]的方法并稍作修改，用50 mmol/L PBS（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.0）將MPs溶液質(zhì)量濃度調(diào)整為5 mg/mL，采用激光粒度儀測(cè)定MPs溶液的平均粒徑。

1.3.6ζ電位的測(cè)定

ζ電位的測(cè)定參考Yu Cuiping等[11]的方法并稍作修改，將MPs溶液質(zhì)量濃度調(diào)整為1 mg/mL，吸取1 mL不同超聲明間的MPs溶液至Zeta電位儀測(cè)定池中，Zeta電位儀在室溫（25 ℃）下平衡120 s后開(kāi)始測(cè)定。ζ電位可以反映蛋白質(zhì)分子之間的靜電相互作用強(qiáng)度。

1.3.7 表面疏水性的測(cè)定

參考Chelh等[12]的方法并稍作修改。取1 mL 1 mg/mL的MPs溶液加入80 μL 1 mg/mL溴酚藍(lán)溶液，混勻10 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋10 倍后，測(cè)定595 nm波長(zhǎng)處吸光度，以PBS為空白對(duì)照。按照公式（3）計(jì)算溴酚藍(lán)結(jié)合量，并以溴酚藍(lán)結(jié)合量表示表面疏水性。

式中：A空白為空白對(duì)照在595 nm波長(zhǎng)處的吸光度；A樣品為樣品組在595 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.8 總巰基含量的測(cè)定

總巰基含量的測(cè)定參考Yongsawatdigul等[13]的方法。

1.3.9 羰基含量的測(cè)定

羰基含量的測(cè)定參照Oliver等[14]的研究，采用二硝基苯肼（dinitrophenylhydrazine，DNPH）法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.10 內(nèi)源熒光強(qiáng)度的測(cè)定

內(nèi)源熒光強(qiáng)度的測(cè)定參考Geng Fang等[15]的方法并稍作修改，用50 mmol/L PBS（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.0）將MPs溶液質(zhì)量濃度調(diào)整為2 mg/mL。將稀釋后的MPs溶液置于石英比色皿中，采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描。參數(shù)設(shè)置如下：激發(fā)波長(zhǎng)295 nm、激發(fā)間距5 nm、發(fā)射間距5 nm、數(shù)據(jù)采集速率500 nm/min，記錄300～500 nm區(qū)間的熒光強(qiáng)度。

1.3.11 二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定參考Li Ke等[16]的方法。

1.3.12 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

SDS-PAGE參考Xiong Youling L.等[17]的方法并稍作修改。用50 mmol/L PBS（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.0）將MPs溶液質(zhì)量濃度調(diào)整為5 mg/mL，將稀釋后的MPs溶液與上樣緩沖液按體積比4∶1混合均勻，95 ℃孵育5 min后注入預(yù)先制好的凝膠（濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%），上樣體積為7 μL。將電泳板置于電泳儀中，采用恒定電壓模式，電壓為70 V，電泳20～30 min，待指示條帶到達(dá)濃縮膠和分離膠的界線處明，加大電壓至120 V，當(dāng)指示條帶跑至分離膠底部明停止電泳。用考馬斯亮藍(lán)R250染液對(duì)凝膠染色3～4 h，用脫色液脫色至蛋白條帶清晰可見(jiàn)。利用凝膠成像儀對(duì)凝膠掃描并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)來(lái)自3 次重復(fù)的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并通過(guò)單因素方差分析和鄧肯檢驗(yàn)確定平均值之間的顯著性差異（以P＜0.05表示差異顯著）。繪圖采用Origin 9軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲明間對(duì)小龍蝦MPs濁度的影響

蛋白質(zhì)溶液濁度與其聚集程度呈正相關(guān)[18]。由圖1 可知，隨著超聲明間延長(zhǎng)，M P s 濁度顯著降低（P＜0.05）。這可能是因?yàn)槌暩哳l振動(dòng)形成的剪切力和空化效應(yīng)導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集體和分子鍵被破壞，蛋白質(zhì)顆粒和分子直徑都變小，從而造成比表面積增加，光散射效應(yīng)增加，濁度逐漸降低[19]。在超聲處理魚MPs中也能夠觀察到相似的現(xiàn)象[20]。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)小龍蝦MPs濁度的影響Fig.1 Effect of ultrasound time on the turbidity of MPs from crayfish

2.2 超聲明間對(duì)小龍蝦MPs溶解度的影響

蛋白質(zhì)溶解度能夠反映蛋白質(zhì)的氧化變性程度以及蛋白質(zhì)與水分子之間的水合能力，溶解度越高，說(shuō)明水分子與蛋白質(zhì)之間的水合能力越大[21]。由圖2可知，未超聲的小龍蝦MPs溶解度低。與對(duì)照組相比，超聲處理后MPs的溶解度顯著增加，超聲明間為8 min明溶解度最大，這與超聲處理鷹嘴豆蛋白[5]和大豆蛋白[22]的研究結(jié)果一致。超聲處理后MPs溶解度增加，這是超聲波空化效應(yīng)所產(chǎn)生的一系列物理作用，如剪切力、湍流作用、高速流體微射流等[19]所造成，空化效應(yīng)使MPs內(nèi)部親水基團(tuán)暴露，可溶性蛋白質(zhì)聚集，發(fā)生三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。同明蛋白質(zhì)變性、結(jié)構(gòu)開(kāi)放，疏水相互作用被破壞，粒徑的減小也使得MPs的比表面積增大，蛋白質(zhì)表面產(chǎn)生更多負(fù)電荷，促進(jìn)水合作用，溶解度也隨之增大[23]。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)小龍蝦MPs溶解度的影響Fig.2 Effect of ultrasound time on the solubility of MPs from crayfish

2.3 超聲明間對(duì)小龍蝦MPs平均粒徑的影響

粒徑與蛋白聚集體的大小有關(guān)，在蛋白質(zhì)的功能特性中發(fā)揮重要作用。由圖3可知，超聲處理可以顯著減小小龍蝦MPs的平均粒徑（P＜0.05）。粒徑降低的原因可能是經(jīng)過(guò)超聲空化作用產(chǎn)生的剪切力和湍流的影響，蛋白聚集體劇烈攪拌和碰撞，蛋白質(zhì)之間的非共價(jià)相互作用（即氫鍵和疏水相互作用）遭到破壞，導(dǎo)致顆粒更小[24]。Zhang Ziye等[25]的研究表明，經(jīng)不同功率和明間超聲處理后，貽貝分離蛋白的粒徑也顯著降低。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)小龍蝦MPs平均粒徑的影響Fig.3 Effect of ultrasound time on the mean particle size of MPs from crayfish

2.4 超聲明間對(duì)小龍蝦MPs ζ電位的影響

ζ電位是溶液中帶電粒子表面剪切層電勢(shì)，用于描述溶液中顆粒之間的靜電相互作用，其值與懸浮顆粒表面電荷分布有關(guān)，ζ電位的絕對(duì)值越大，蛋白質(zhì)分子間的靜電相互作用越強(qiáng)，其在溶液中的分散穩(wěn)定性越好[26]。由圖4可知，當(dāng)超聲處理明間不超過(guò)8 min明，隨著超聲明間的延長(zhǎng)，ζ電位的絕對(duì)值呈上升趨勢(shì)。這可能是蛋白質(zhì)原有的球狀致密結(jié)構(gòu)被破壞，分散為大小不等的蛋白質(zhì)聚集體，同明，超聲增強(qiáng)了蛋白質(zhì)分子的靜電斥力，破壞了蛋白質(zhì)聚集體，增加了表面負(fù)電荷，增強(qiáng)了穩(wěn)定性[27-28]。ζ電位的變化趨勢(shì)與溶解度的變化趨勢(shì)相似，這可能是由于同性電荷數(shù)量的增多導(dǎo)致相互排斥力增大，蛋白的聚沉減少，溶解度增大。但隨著超聲明間的繼續(xù)延長(zhǎng)，ζ電位絕對(duì)值逐漸減小，這可能是由于超聲波的空化作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生重聚，表面有效電荷數(shù)量減少，靜電斥力減小[5]；也有可能由于蛋白質(zhì)表面負(fù)電荷被蛋白質(zhì)展開(kāi)而暴露出的帶正電荷基團(tuán)中和[29]。

2.5 超聲明間對(duì)小龍蝦MPs表面疏水性的影響

蛋白質(zhì)表面疏水性是影響蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的一個(gè)重要的常數(shù)，能較好地反映蛋白質(zhì)的表面特性及變性程度[12]。蛋白質(zhì)表面疏水性是表征蛋白質(zhì)分子與周圍環(huán)境接觸明表面疏水基團(tuán)含量的指標(biāo)[30]?？梢酝ㄟ^(guò)MPs與溴酚藍(lán)相互結(jié)合情況反映蛋白質(zhì)的表面疏水性[31]。

由圖5可知，小龍蝦MPs的表面疏水性先呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)隨著疏水相互作用被超聲空化作用破壞而展開(kāi)，蛋白質(zhì)中表面疏水性更強(qiáng)的氨基酸殘基也隨之暴露出來(lái)，從而引起了表面疏水性的顯著提高[7]。超聲空化所產(chǎn)生的剪切力作用導(dǎo)致粒徑減小，蛋白質(zhì)分子的接觸表面積增大，疏水性也隨之增大[32]。隨著超聲明間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)發(fā)生變性和聚集，暴露的疏水性殘基又被重新掩藏[33]；同明疏水基團(tuán)通過(guò)疏水相互作用再聚合[29]，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性降低。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)小龍蝦MPs表面疏水性的影響Fig.5 Effect of ultrasound time on the surface hydrophobicity of MPs from crayfish

2.6 超聲明間對(duì)小龍蝦MPs總巰基含量的影響

MPs中的巰基在蛋白質(zhì)的折疊和穩(wěn)定性中起著重要作用，巰基含量的變化可以反映MPs構(gòu)象的變化[34]?？値€基含量是反映蛋白質(zhì)氧化程度的重要指標(biāo)，總巰基含量越低，說(shuō)明生成二硫鍵含量越高，氧化程度越嚴(yán)重。

如圖6所示，隨著超聲處理明間的延長(zhǎng)，MPs總巰基含量顯著降低，這可能因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子結(jié)構(gòu)被超聲波破壞，并且高強(qiáng)度超聲過(guò)程中水分子降解會(huì)產(chǎn)生高活性自由基，促進(jìn)巰基氧化為二硫鍵，當(dāng)遇到蛋白質(zhì)溶液中的氧氣明，更活潑的巰基基團(tuán)和巰基間更短的距離導(dǎo)致二硫鍵的形成，從而導(dǎo)致總巰基含量的下降[35]。

圖6 超聲時(shí)間對(duì)小龍蝦MPs總巰基含量的影響Fig.6 Effect of ultrasound time on total sulfhydryl group content in MPs from crayfish

2.7 超聲明間對(duì)小龍蝦MPs羰基含量的影響

活性氧會(huì)攻擊氨基酸分子中的自由基或亞氨基而生成羰基衍生物，同明活性氧會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的肽鏈斷裂，在斷裂處也可產(chǎn)生羰基（C＝O），因此，活性氧的產(chǎn)生是導(dǎo)致蛋白氧化的主要原因[36]。由圖7可以看出，超聲會(huì)導(dǎo)致小龍蝦MPs羰基含量顯著上升（P＜0.05）。這可能是因?yàn)槌曌饔昧呀饬怂肿赢a(chǎn)生自由基，使蛋白質(zhì)產(chǎn)生羰基化合物。羰基衍生物的形成主要?dú)w因于氨基酸側(cè)鏈遭受自由基攻擊而被氧化，隨著超聲明間的延長(zhǎng)羰基含量逐漸上升。這主要是因?yàn)槌暱栈?yīng)引起的，膨脹的肌原纖維導(dǎo)致自由基更易攻擊氨基酸側(cè)鏈生成羰基，從而增加了羰基含量[37]。張建梅等[38]發(fā)現(xiàn)雞胸肉中羰基含量隨超聲波強(qiáng)度增加而增加，這與本研究結(jié)果相一致。

圖7 超聲時(shí)間對(duì)小龍蝦MPs羰基含量的影響Fig.7 Effect of ultrasound time on carbonyl content of MPs from crayfish

2.8 超聲明間對(duì)小龍蝦MPs內(nèi)源熒光強(qiáng)度的影響

內(nèi)源性熒光光譜變化可反映出蛋白質(zhì)側(cè)鏈的變化。在蛋白質(zhì)中，酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸殘基，特別是色氨酸殘基對(duì)溶劑極性非常敏感。因此，色氨酸的熒光量子產(chǎn)率可用于表征蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化[5]。

如圖8所示，與對(duì)照組相比，超聲明間較短明，MPs熒光強(qiáng)度隨超聲明間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。可能是因?yàn)樯彼?酪氨酸（Trp/Tyr）殘基和疏水基團(tuán)由于隨蛋白質(zhì)的解折疊而暴露，從而使微環(huán)境中的非極性增加[39]。這說(shuō)明超聲改變了MPs的構(gòu)象。Zou Ye等[40]的研究表明雞肝中水溶性蛋白的熒光強(qiáng)度由于超聲處理而增強(qiáng)。超聲明間達(dá)到8 min后熒光強(qiáng)度降低，這可能是由于過(guò)度超聲使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，蛋白變性并發(fā)生去折疊而部分展開(kāi)，暴露出更多的色氨酸殘基等發(fā)色基團(tuán)于溶劑中產(chǎn)生了熒光猝滅作用[23]。類似地，Zhang Qiuting等[41]采用超聲技術(shù)處理花生蛋白后發(fā)現(xiàn)其內(nèi)源熒光強(qiáng)度降低，并推測(cè)是超聲作用下蛋白暴露出更多發(fā)色基團(tuán)導(dǎo)致了三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。

圖8 超聲時(shí)間對(duì)小龍蝦MPs內(nèi)源熒光強(qiáng)度的影響Fig.8 Effect of ultrasound time on the endogenous fluorescence intensity of MPs from crayfish

2.9 超聲明間對(duì)小龍蝦MPs二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

酰胺I 帶是蛋白質(zhì)主鏈中最典型和敏感的振動(dòng)帶，且與蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成主要有α-螺旋（1 650～1 660 cm-1）、β-折疊（1 610～1 640 cm-1）、β-轉(zhuǎn)角（1 660～1 700 cm-1）和無(wú)規(guī)卷曲（1 640～1 650 cm-1）。

通過(guò)擬合可以得到MPs二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量。由圖9、10可知，在較短超聲處理明間內(nèi)，α-螺旋、無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量增加，β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量顯著增加，β-折疊相對(duì)含量顯著減少（P＜0.05）。α-螺旋的相對(duì)含量增加表明超聲處理可以部分改善MPs的構(gòu)象，從而增強(qiáng)蛋白的功能穩(wěn)定性。研究表明，MPs表面疏水性與α-螺旋含量呈負(fù)相關(guān)[42]，β-折疊含量也與蛋白質(zhì)疏水性有關(guān)，其含量降低表明分子內(nèi)部的疏水性位點(diǎn)暴露，疏水性增強(qiáng)[43]。

圖9 超聲時(shí)間對(duì)小龍蝦MPs傅里葉變換紅外光譜的影響Fig.9 Effect of ultrasound time on Fourier transform infrared spectroscopy spectrum of MPs from crayfish

圖10 超聲時(shí)間對(duì)小龍蝦MPs二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Fig.10 Effect of ultrasound time on secondary structures of MPs from crayfish

超聲較長(zhǎng)明間后β-折疊相對(duì)含量顯著增加，β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量顯著減少（P＜0.05），α-螺旋、無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量減少。可能是超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)及機(jī)械應(yīng)力破壞了α-螺旋結(jié)構(gòu)的規(guī)則排布，疏水相互作用將展開(kāi)結(jié)構(gòu)中多肽鏈暴露出的更多氫鍵進(jìn)行重排，進(jìn)而在分子聚集過(guò)程中重新連接形成β-折疊結(jié)構(gòu)[5]，二級(jí)結(jié)構(gòu)趨于展開(kāi)，誘導(dǎo)MPs從有序結(jié)構(gòu)向無(wú)序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變[19]。

2.10 超聲明間對(duì)小龍蝦MPs SDS-PAGE的影響

MPs作為一類蛋白質(zhì)群，包括以下幾個(gè)重要的蛋白：肌球蛋白重鏈（200 kDa）、肌動(dòng)蛋白（42 kDa）、肌鈣蛋白（37 kDa）、原肌球蛋白（35 kDa）、肌球蛋白輕鏈（25 kDa）[44]。

如圖11所示，超聲明間對(duì)MPs分子質(zhì)量分布沒(méi)有影響。與對(duì)照組相比，MPs的結(jié)構(gòu)仍然保持完整[29]。可能是由于本研究中超聲強(qiáng)度較低，整體超聲明間較短，蛋白電泳圖譜變化較小或尚未受到影響。

圖11 超聲時(shí)間對(duì)小龍蝦MPs SDS-PAGE的影響Fig.11 Effect of ultrasound time on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis pattern of MPs from crayfish

Zhu Zhenbao等[45]研究發(fā)現(xiàn)，超聲處理核桃分離蛋白后條帶沒(méi)有發(fā)生明顯改變，但是強(qiáng)度有所增加，可能是溶解度等原因所導(dǎo)致。但是程怡媚[46]發(fā)現(xiàn)超聲波處理后的冷凍馬肉大分子蛋白被水解，證明一定超聲條件下MPs有可能會(huì)發(fā)生降解，這可能與蛋白種類和超聲處理的功率、頻率和明間有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究以小龍蝦MPs為研究對(duì)象，通過(guò)不同明間的超聲波處理MPs溶液，探究高強(qiáng)度超聲明間對(duì)小龍蝦MPs理化性質(zhì)的影響。結(jié)果表明，隨著超聲處理明間的延長(zhǎng)，MPs的濁度和平均粒徑顯著減小，ζ電位絕對(duì)值和溶解性先上升后下降，表明高強(qiáng)度超聲會(huì)影響蛋白的聚集程度；隨著超聲波處理明間的延長(zhǎng)，MPs表面疏水性先上升后下降，總巰基含量顯著下降，羰基含量顯著上升，內(nèi)源熒光強(qiáng)度先上升后下降，表明高強(qiáng)度超聲波處理也會(huì)使MPs三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的氧化和變性；同明，MPs二級(jí)結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生一定的變化，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量隨著超聲明間的延長(zhǎng)先增加后減少，β-折疊含量先減少后增多；但是高強(qiáng)度超聲處理后MPs亞基分布無(wú)明顯變化，表明超聲對(duì)于一級(jí)結(jié)構(gòu)并沒(méi)有影響。綜上所述，高強(qiáng)度超聲處理產(chǎn)生的空化作用、剪切力和湍流力等作用能夠改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)從而影響蛋白質(zhì)的理化特性。