楊瑞瑞,王浩,陸恒,李海燕,王同玲,張麗媛,郭恒,丁玉松

(石河子大學醫(yī)學院預(yù)防醫(yī)學系,新疆 石河子 832000)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是一種胰島素的絕對或相對不足的代謝綜合癥。在T2DM發(fā)病過程中,年齡、超重或肥胖、體力活動不足等危險因素,引起機體肌肉、脂肪及外周組織發(fā)生進行性胰島素抵抗,進而引起機體糖脂代謝紊亂[1]。胰島β細胞對糖脂毒性極為敏感,當患者明確診斷為T2DM時,胰腺功能已顯著降低[2]。盡管做了大量研究,但是糖脂毒性導(dǎo)致胰島β細胞死亡的機制并未完全闡明。因此,探討行之有效的干預(yù)策略,對于T2DM的防控具有重大的公共衛(wèi)生學意義。

早期研究顯示,凋亡是糖脂毒性誘導(dǎo)的β細胞死亡以及胰腺功能衰竭的主要機制[3],然而Bellini等[4]研究發(fā)現(xiàn),現(xiàn)有抗凋亡干預(yù)只能部分緩解糖脂毒性導(dǎo)致的β細胞死亡,提示糖脂毒性誘導(dǎo)β細胞損傷存在新的死亡方式。Li等[5]發(fā)現(xiàn)T2DM模型小鼠胰島β細胞存在鐵死亡,免疫組化染色顯示鐵沉積在胰島中心,電鏡顯示胰島線粒體縮小,嵴丟失等鐵死亡特征性表現(xiàn)。張麗媛等[6]研究顯示高糖高脂誘導(dǎo)胰島β細胞發(fā)生鐵死亡。因此,胰島β細胞鐵死亡可能成為T2DM的潛在干預(yù)靶點,具體機制有待進一步研究。

研究發(fā)現(xiàn),自噬參與調(diào)節(jié)鐵死亡[7]。Sheng等[8]研究顯示在糖尿病C57BL/6小鼠中,高糖高脂飲食使胰島β細胞發(fā)生氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量ROS,使微管相關(guān)蛋白l輕鏈3Ⅱ(Microtubule-associated protein1 light chain3,LC3Ⅱ)和P62表達升高阻斷自噬流,使β細胞對高糖高脂更為敏感,導(dǎo)致β細胞功能障礙。Liu等[9]的研究表明,膠質(zhì)細胞成熟因子β誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細胞自噬流阻滯,使酰基輔酶A 合成酶長鏈家族成員4 (acyl-CoA synthetase long-chain family member 4,ACSL4)累積,導(dǎo)致細胞發(fā)生鐵死亡。Liu[10]研究發(fā)現(xiàn)在C57BL/6小鼠腦損傷模型中,自噬激動劑雷帕霉素(rapamycin,RAPA)干預(yù)可通過激活自噬改善鐵死亡。因此本次研究選取小鼠胰島瘤細胞株MIN6細胞,通過添加外源高糖和棕櫚酸鈉(high Glucose and high Sodium Palmitate,GP)模擬糖尿病微環(huán)境,建立體外胰島β細胞損傷模型,以自噬激動劑RAPA進行干預(yù),探討自噬激動劑RAPA能否通過激活自噬改善高糖高脂誘導(dǎo)的小鼠β細胞鐵死亡,為T2DM的防治提供新的思路及干預(yù)靶點。

1 材料與方法

1.1 主要材料

小鼠胰島瘤細胞株MIN6細胞購自上海富衡生物科技有限公司(XF0390)。胎牛血清和1640培養(yǎng)基購自美國 Gibco 公司,CCK8試劑盒購自Biosharp公司,谷胱甘肽(glutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒、DCFH-DA 探針和Lillie染色檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所,自噬激動劑RAPA購自美國selleck生物科技有限公司,鐵死亡抑制劑(Ferrostatin-1,Fer-1)、鐵死亡激動劑(erastin,Era)、凋亡抑制劑(Z-VAD-FMK)、壞死抑制劑(necrostatin-1,Nec-1)均購自美國MCE公司,谷胱甘肽過氧化物酶4(Glutathione Peroxidase 4,GPX4 貨號:ab125066),ACSL4(貨號:ab155282),鐵蛋白(Ferritin,FE 貨號:ab75973)抗體購自美國Abcom公司;LC3(貨號:14600-1-AP)、P62(貨號:18420-1-AP)購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。鼠抗β-actin購自武漢博士得生物工程有限公司。羊抗兔IgG,羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。葡萄糖和棕櫚酸鈉購自西安鯤創(chuàng)科技有限公司。

1.2 檢測方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

用含90% 1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗+0.1% β-巰基乙醇培養(yǎng)MIN6細胞,置于培養(yǎng)箱(37 ℃,5% CO2)24 h后觀察細胞數(shù)量與形態(tài)。選取70%～80%密度的細胞進行后續(xù)試驗。

1.2.2 實驗分組

將MIN6細胞分為以下6組(1)對照組:完全培養(yǎng)基培養(yǎng),(2)GP組:25 mmol·L-1高糖+200 μmol·L-1高脂,(3)RAPA組:完全培養(yǎng)基+RAPA 60 nmol·L-1,(4)GP+RAPA組:25 mmol·L-1高糖+200 μmol·L-1高脂+RAPA 60 nmol·L-1,(5)Era組:完全培養(yǎng)基+Era 20 μmol·L-1,(6)GP+Era組:25 mmol·L-1高糖+200 μmol·L-1高脂+ Era 20 μmol·L-1。

1.2.3 CCK8法檢測細胞活力

將MIN6細胞按7 000個·孔-1接種于96孔板中,每組設(shè)5個復(fù)孔,按照分組施加不同處理24 h后,各孔加入10 μL的CCK8溶液,避光孵育1.5 h后,在酶標儀450 nm波長處測定吸光度,計算細胞存活率。

1.2.4 GSH,MDA和SOD的檢測

將MIN6細胞按1×105個·孔-1接種于6孔板中,待提取細胞上清及BCA法測蛋白濃度后,分別按照試劑盒說明書操作,GSH含量測定采用微量酶標法。MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法。SOD活力測定采用WST-1法。

1.2.5 ROS水平測定

將MIN6細胞按5×104個·孔-1接種于24孔板中。將藥物干預(yù)24 h的細胞與2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA)分子探針(1 μmol·L-1)在37 ℃下孵育45 min,然后用PBS沖洗3次。使用熒光顯微鏡收集熒光圖像(×200)。用DCFH-DA (10 μmol·L-1)法測定細胞 ROS 水平。

1.2.6 細胞中亞鐵含量測定

用Lillie染色試劑盒檢測細胞二價鐵離子,藥物干預(yù)24 h后,按照試劑盒說明書操作,使用熒光顯微鏡收集熒光圖像(×400)。

1.2.7 Western blot 檢測鐵死亡、自噬相關(guān)蛋白

在六孔板中加入預(yù)冷的PBS洗滌一次,然后每孔加入150 μL的RIPA裂解液于冰上裂解30 min,超聲破碎離心20 min(4 ℃、12 000 g)收集細胞上清,使用BCA測定總蛋白含量,然后加入總體積1/4的5×上樣緩沖液配平,最后置于100 ℃金屬浴煮10 min備用。配置12%分離膠及濃縮膠,加入適量蛋白后恒壓電泳電轉(zhuǎn)適量時間后,5%脫脂奶粉常溫封閉2 h,TBST洗滌3次。分別使用一抗GPX4、LC3、P62(1∶1 000)、ACSL4(1∶10 000)、FE(1∶600)4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次。加入相應(yīng)的二抗(1∶20 000)室溫孵育2 h。TBST洗滌3次,最后使用ECL化學發(fā)光法進行曝光,使用ImageJ分析所有的條帶。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS26.0軟件進行統(tǒng)計分析,Graphpad Prism8.0軟件繪圖。數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布用均數(shù)±標準差進行描述。多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用Bonferroni法。P<0.05,為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 GP誘導(dǎo)MIN6細胞發(fā)生鐵死亡

根據(jù)課題組前期研究[6],本次選用25 mmol·L-1高糖和200 μmol·L-1棕櫚酸鈉處理細胞,建立損傷模型,在此基礎(chǔ)上,進一步使用Fer-1(鐵死亡抑制劑)、Era(鐵死亡激動劑)、Nec-1(壞死抑制劑)、Z-VAD-FMK(凋亡抑制劑)干預(yù)MIN6細胞24 h,使用CCK8檢測細胞活力。見圖1A,與對照組相比,GP組細胞活力明顯降低(P<0.05)。

A. 細胞存活率;B-D. 鐵死亡關(guān)鍵蛋白(GPX4,ACSL4及其定量);E-F. ROS熒光(×200)及定量;G-H. 亞鐵離子表達(×400)及定量。*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05),#表示與GP處理組相比差異顯著(P<0.05)。圖1 GP對MIN6細胞鐵死亡的影響

與GP組相比,Fer-1顯著提高細胞存活率(P<0.05)。而凋亡抑制劑Z-VAD-FMK、壞死抑制劑Nec-1對MIN6無改善作用。Era被認為是經(jīng)典的鐵死亡激動劑,與GP聯(lián)用,使細胞存活率進一步降低(P<0.05)。鐵死亡是一種鐵和ROS依賴的細胞死亡,為了進一步證明GP誘導(dǎo)MIN6細胞發(fā)生鐵死亡,檢測了ROS、亞鐵離子含量及鐵死亡關(guān)鍵蛋白的表達,如圖1B～圖1H所示,與對照組相比,GP使MIN6細胞產(chǎn)生大量ROS及亞鐵離子,使GPX4表達降低,ACSL4表達增加,而給予Era干預(yù)后,進一步增加了ROS及亞鐵離子的含量,使GPX4表達進一步降低,ACSL4表達進一步增加(P<0.05)。以上結(jié)果說明,GP誘導(dǎo)MIN6細胞發(fā)生鐵死亡。

2.2 RAPA對GP誘導(dǎo)的MIN6細胞的存活率的影響

使用不同濃度的RAPA(0～100 nmol·L-1)干預(yù)MIN6細胞24 h后,如圖2所示,與0 nmol·L-1組相比,10～60 nmol·L-1RAPA 對MIN6細胞存活率無影響(P<0.05)。為了觀察60 nmol·L-1RAPA對GP誘導(dǎo)的MIN6細胞是否具有損傷,使用60 nmol·L-1RAPA聯(lián)合GP干預(yù)細胞24 h后,結(jié)果顯示與GP組相比,聯(lián)合干預(yù)可改善MIN6細胞存活(P<0.05)。因此,本次研究選擇60 nmol·L-1RAPA進行后續(xù)實驗。

*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05),#表示與GP處理組相比差異顯著(P<0.05)。圖2 RAPA對GP誘導(dǎo)的MIN6細胞存活率的影響

2.3 RAPA對GP誘導(dǎo)的MIN6細胞氧化應(yīng)激的影響

β細胞抗氧化酶較少,極易受到氧化損傷,為了評估MIN6細胞的氧化損傷,本次采用試劑盒檢測GSH、MDA含量及SOD活力。由圖3可知,與對照組相比,GP組GSH含量和SOD活力均降低,MDA含量升高(P<0.05);與GP組相比,RAPA干預(yù)后GSH含量和SOD活力在一定程度上得到恢復(fù),MDA含量降低(P<0.05)。提示RAPA可改善GP誘導(dǎo)的MIN6細胞氧化損傷。

*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05),#表示與GP處理組相比差異顯著(P<0.05)。圖3 RAPA對GP誘導(dǎo)的MIN6細胞氧化應(yīng)激的影響

2.4 RAPA對GP誘導(dǎo)的MIN6細胞ROS的影響

鐵死亡的發(fā)生依賴于ROS的累積,為了檢測MIN6細胞內(nèi)ROS水平,使用DCFH-DA熒光探針檢測MIN6細胞內(nèi)ROS含量的變化。

由圖4可知,與對照組相比,GP處理MIN6細胞后,細胞內(nèi)綠色熒光增多,ROS明顯增加(P<0.05);經(jīng)RAPA干預(yù)后,細胞內(nèi)綠色熒光減弱,ROS明顯減少(P<0.05)。提示RAPA可以清除部分ROS。

*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05),#表示與GP處理組相比差異顯著(P <0.05),ROS熒光,×200。圖4 RAPA對GP誘導(dǎo)的MIN6細胞ROS的影響

2.5 RAPA對GP誘導(dǎo)的MIN6細胞亞鐵離子的影響

發(fā)生鐵死亡時出現(xiàn)鐵離子的累積,為了檢測GP誘導(dǎo)MIN6細胞內(nèi)Fe2+含量的變化,使用Lillie染色法檢測細胞內(nèi)亞鐵離子,由圖5可知,對照組有少量亞鐵離子Fe2+,經(jīng)GP干預(yù)后,MIN6細胞內(nèi)出現(xiàn)大量陽性細胞(P<0.05);與GP組相比,加入RAPA處理后,陽性細胞數(shù)量減少,Fe2+含量顯著降低(P<0.05)。提示GP誘導(dǎo)的MIN6細胞存在鐵穩(wěn)態(tài)失衡,而RAPA可以改善亞鐵水平。

*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05),#表示與GP處理組相比差異顯著(P<0.05)亞鐵離子染色,×400。圖5 RAPA對GP誘導(dǎo)的MIN6細胞亞鐵離子的影響

2.6 RAPA對GP誘導(dǎo)的MIN6細胞自噬相關(guān)蛋白LC3、P62的影響

LC3Ⅱ和P62是自噬標志物,由圖6可知,經(jīng)GP干預(yù)24 h后,與對照組相比,MIN6細胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ表達水平升高,自噬底物P62蛋白表達水平升高(P<0.05)。

*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05),#表示與GP處理組相比差異顯著(P<0.05)。圖6 RAPA對GP誘導(dǎo)的MIN6細胞自噬相關(guān)蛋白LC3、P62的影響

提示GP誘導(dǎo)的MIN6細胞內(nèi)自噬增加,自噬流阻滯,而RAPA干預(yù)后LC3Ⅱ蛋白表達水平升高(P<0.05),P62蛋白表達水平降低(P<0.05),提示RAPA激活自噬,使自噬流通暢。

2.7 RAPA對GP誘導(dǎo)的MIN6細胞鐵死亡的影響

FE是細胞內(nèi)儲存鐵的主要蛋白,對于維持細胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)具有重要作用,GPX4、ACSL4是鐵死亡標志蛋白。由圖7可知,經(jīng)GP干預(yù)24 h后,與對照組相比,MIN6細胞內(nèi)鐵死亡關(guān)鍵蛋白GPX4降低、ACSL4、FE蛋白表達水平升高(P<0.05),而RAPA干預(yù)使GPX4升高,ACSL4、FE蛋白表達水平降低(P<0.05),提示RAPA可改善GP誘導(dǎo)的MIN6細胞鐵死亡。

*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05),#表示與GP處理組相比差異顯著(P <0.05)。圖7 RAPA對GP誘導(dǎo)的MIN6細胞鐵死亡的影響

3 討論

T2DM是胰島素抵抗和β細胞分泌受損相互作用的結(jié)果,高糖和高脂是T2DM微環(huán)境的主要特征[11],可引起胰腺組織結(jié)構(gòu)和功能損傷,使胰島β細胞數(shù)量減少、分泌能力下降、功能障礙[12]。Elksnis等[13]的研究表明,ROS大量累積及β細胞功能障礙與T2DM病程呈負相關(guān)。Stancic等[14]的研究顯示在糖尿病模型中發(fā)現(xiàn)鐵死亡與胰島β細胞損傷有關(guān)。目前廣泛關(guān)注GP誘導(dǎo)胰島β細胞凋亡[15]的研究,關(guān)于GP誘導(dǎo)胰島β細胞發(fā)生鐵死亡研究相對較少,具體機制并未完全闡明。自噬參與T2DM的發(fā)生發(fā)展,激活自噬,有利于保護β細胞死亡,Bugliani等[16]研究顯示自噬激動劑RAPA可降低P62表達,激活自噬,改善T2DM患者胰島β細胞功能和存活。Yu等[17]的研究發(fā)現(xiàn),RAPA使氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的巨噬細胞激活自噬,改善鐵死亡。本研究中發(fā)現(xiàn)GP誘導(dǎo)MIN6細胞產(chǎn)生大量ROS及脂質(zhì)過氧化物(MDA),使自噬流阻滯及鐵死亡。而鐵死亡抑制劑Fer-1及小劑量的RAPA提高細胞存活率,抑制了GP誘導(dǎo)的MIN6細胞鐵死亡。

鐵死亡的特征是氧化還原性鐵的積累、GPX4的失活和脂質(zhì)過氧化物積聚[18]。FE通過儲存細胞內(nèi)過量的亞鐵以維持細胞鐵穩(wěn)態(tài),Zhang[19]等人對上海江川社區(qū)的橫斷面研究發(fā)現(xiàn),血清鐵蛋白升高是T2DM的獨立危險因素。細胞高濃度的鐵是導(dǎo)致鐵死亡的關(guān)鍵,鐵離子可通過fenton反應(yīng)產(chǎn)生大量ROS,過量ROS導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激。秦璐[20]等人研究顯示高脂誘導(dǎo)的MIN6細胞Fe2+含量升高。本研究顯示GP導(dǎo)致MIN6細胞Fe2+含量及FE表達上升。研究顯示,GPX4是一種抗氧化酶,可維持細胞內(nèi)氧化平衡,防止脂質(zhì)過氧化及GSH耗竭,從而抑制ROS生成發(fā)揮抗鐵死亡作用[21]。本研究顯示,GP誘導(dǎo)MIN6細胞GSH含量、SOD活力及GPX4表達降低。研究顯示,ACSL4催化長鏈脂肪酸導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物累積,使細胞發(fā)生鐵死亡[22]。Ansari等[23]的研究表明,ACSL4集中分布在人和大鼠胰島β細胞胰島素分泌顆粒周圍。本次研究發(fā)現(xiàn)GP誘導(dǎo)MIN6細胞,ROS水平、MDA含量及ACSL4表達升高,提示高糖高脂誘導(dǎo)的MIN6細胞發(fā)生鐵死亡。

研究顯示,自噬在調(diào)節(jié)鐵死亡中起關(guān)鍵作用,其通過鐵自噬[24]、脂噬[25]及分子伴侶介導(dǎo)的自噬[26]上調(diào)鐵水平、脂質(zhì)過氧化及促進GPX4降解導(dǎo)致鐵死亡。LC3Ⅱ和P62被廣泛用于表征自噬,是自噬標志物。當自噬小體形成時,LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化,隨著自噬小體與溶酶體融合,LC3Ⅱ逐漸降解;因此LC3Ⅱ表達增強可能是自噬增強或自噬降解障礙,因此需結(jié)合P62水平評估自噬水平,P62表達與自噬活性負相關(guān)[27]。Zhang等[28]的研究顯示GP誘導(dǎo)的MIN6細胞自噬流阻滯,表現(xiàn)為P62升高。研究顯示,自噬流阻滯使ROS累積,導(dǎo)致β細胞功能障礙[29]。Conlo等[30]研究顯示ROS及脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致細胞發(fā)生鐵死亡。Song[31]等人研究顯示自噬標志物核心調(diào)節(jié)因子通過上調(diào)脂質(zhì)過氧化抑制Xc-系統(tǒng)導(dǎo)致癌細胞發(fā)生鐵死亡。Zeng等[32]研究顯示,鎘暴露產(chǎn)生過量ROS和脂質(zhì)過氧化,導(dǎo)致TM3細胞鐵死亡及自噬流阻滯。本次研究結(jié)果顯示GP組細胞LC3Ⅱ及P62表達升高,提示GP誘導(dǎo)的MIN6細胞存在自噬流阻滯,而自噬激動劑RAPA干預(yù)MIN6細胞使LC3Ⅱ、GPX4水平升高及P62降低、ACSL4水平降低,提示RAPA可以改善GP誘導(dǎo)的β細胞鐵死亡。

然而RAPA對胰島功能的影響仍存有爭議。Tanemura等[33]的研究表明10 ng·mL-1的RAPA使GFP-LC3轉(zhuǎn)基因小鼠胰島細胞LC3Ⅱ表達增多,上調(diào)自噬,抑制胰島素分泌,導(dǎo)致細胞死亡和胰島β細胞功能障礙。而Deng等[34]研究表明,100 nM的RAPA改善高糖和高脂誘導(dǎo)的MIN6細胞胰島素分泌,調(diào)節(jié)葡萄糖耐量,防止細胞死亡,與本研究結(jié)果一致。Yu等[17]的研究發(fā)現(xiàn),10 μmol·L-1的RAPA干預(yù)0.5 h,激活自噬,抑制氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的巨噬細胞鐵死亡,與本研究結(jié)果一致。本次研究結(jié)果顯示60 nmol·L-1的RAPA可提高MIN6細胞存活及抗氧化酶GSH、SOD水平,降低MDA水平,減少細胞氧化損傷,抑制GP誘導(dǎo)的β細胞鐵死亡。以上兩種不同結(jié)局的原因可能與RAPA不同劑量、不同作用持續(xù)時間及種屬差異有關(guān),后續(xù)需要進一步的研究進行論證。

綜上所述,本研究在細胞層面上證實了鐵死亡參與GP誘導(dǎo)的MIN6細胞損傷,其機制可能與自噬流阻滯有關(guān)。而雷帕霉素可能通過激活自噬,改善β細胞鐵死亡。本研究存在一定的局限性,僅在細胞層面驗證GP誘導(dǎo)胰島β細胞發(fā)生鐵死亡和自噬的作用,未在動物或原代離體胰島內(nèi)進行驗證;此外,還需進一步探討GP誘導(dǎo)β細胞鐵死亡-自噬的分子機制,為T2DM的防治提供一定依據(jù)和干預(yù)靶點。