圖爾遜娜依·艾力,吳軍強,雒怡倩,王瀟,楊潔,岳海濤

(新疆大學生命科學與技術學院,新疆 烏魯木齊 830046)

植物生長調(diào)節(jié)劑(plant growth regulator, PGR)是人工合成的對植物生長發(fā)育有調(diào)節(jié)作用的化學物質(zhì),具有促進坐果、增加產(chǎn)量、提高果實品質(zhì)、改變果蔬品相等重要作用[1],在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領域具有巨大增產(chǎn)潛力和可觀的經(jīng)濟效益。截至2022年3月,我國共有有效期內(nèi)植物生長調(diào)節(jié)劑登記產(chǎn)品1 375個,登記作物涉及紅棗、葡萄、油菜、番茄、小麥、水稻等70余種。與傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)技術相比,植物生長調(diào)節(jié)劑的應用具有毒性低、成本低、收效快、效益高等優(yōu)點[2]。氯吡脲和赤霉酸是2種在葡萄、紅棗、西瓜、獼猴桃等植物中廣泛使用的植物生長調(diào)節(jié)劑,通過調(diào)節(jié)作物內(nèi)各種內(nèi)源激素水平來促進生長,或通過直接調(diào)節(jié)酶活性從而調(diào)控植株的生理生化過程來促進細胞分裂、果實膨大,提高坐果率,改善品相。

赤霉素(gibberellin,GA,C19H22O6)是四環(huán)雙帖類結構的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì),調(diào)控著植物許多重要生長和發(fā)育過程[3],赤霉素目前已在小麥、葡萄、黃瓜等40種農(nóng)作物登記使用,在果蔬種植環(huán)節(jié)中普遍用于膨大果實、促進生長等,市面上以赤霉素為主要成分的產(chǎn)品有200余種[4]。雖然國內(nèi)外針對植物生長調(diào)節(jié)的最大殘留限量值都制定了嚴格的限制標準,但我國將赤霉酸列為豁免物質(zhì)之一,而日本制定各類果蔬中赤霉素最大殘留限量值范圍為0.05～2.00 mg·kg-1[5]。

氯吡脲(forchlorfenuron,CPPU,C12H10ClN3O)屬于苯脲類細胞分裂素,具有促進細胞分裂、增大細胞體積、提高光合作用效率等生理功能[6],從而可以起到促進果實增產(chǎn)、提高品質(zhì)等作用,目前已登記的氯吡脲成分產(chǎn)品有34種,使用于西瓜、葡萄、黃瓜等10種作物,氯吡脲常見殘留限量是0.05～0.10 mg·kg-1[4]。

在我國赤霉素和氯吡脲等植物生長調(diào)節(jié)劑歸于農(nóng)藥類進行統(tǒng)一管理,由于植物生長調(diào)節(jié)劑是一類調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的激素類物質(zhì),且在成熟的瓜果蔬菜中殘留量較低,在烹飪或加工過程中也會遭到不同程度的破壞,所以,其毒性一般定義為低毒或微毒。但是植物生長調(diào)節(jié)劑同其他合成農(nóng)藥一樣,盲目地使用會造成食品、環(huán)境中的高殘留,引起人畜的急、慢性中毒,導致疾病的發(fā)生[7]。根據(jù)相關研究報道,GA引起腫瘤發(fā)育[8-9],降低肝臟的抗氧化防御功能,損傷其組織結構和生化功能[10]。濫用氯吡脲等植物激素增加蔬果產(chǎn)量和美化蔬果外觀帶來的食品安全問題逐漸受到了社會的關注[11]。有研究表明,氯吡脲對鵪鶉經(jīng)口急性毒性LD50>2 250 mg·kg-1,LC50>5 260 mg·kg-1;對魚類、水蚤和羊角月牙藻有中等毒性;對無脊椎動物影響較小。CPPU對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)的增殖、遷移和管狀結構的形成具有抑制作用[13]?，F(xiàn)有的赤霉素和氯吡脲體外細胞毒性進而致突變毒性研究較少,大量的動物實驗結果顯示赤霉素和氯吡脲具有肝毒性[14-15],因此赤霉素和氯吡脲的體外安全性值得關注。

近年來,隨著人們安全意識的提高,對赤霉素和氯吡脲是否存在潛在的危害成了消費者關注話題,闡明其產(chǎn)生的毒性是否對人體健康造成危害是非常有必要的。本研究利用人正常肝細胞(WRL68)對赤霉素和氯吡脲在細胞水平的毒性做初步探究,通過小鼠淋巴瘤細胞(L5178Y)TK基因突變試驗、鼠傷寒沙門氏菌Ames試驗對赤霉素和氯吡脲致突變性進行評價,以期能夠為赤霉素、氯吡脲等植物生長調(diào)節(jié)劑的規(guī)范使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1 主要試劑

胎牛血清、馬血清:以色列生物科技公司;青霉素-鏈霉素雙抗、MEM培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液(pH7.2)、0.25%胰蛋白酶、丙酮酸鈉:美國Hyclone公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜、三氟胸苷、甘氨酸、次黃嘌呤、胸腺嘧啶脫氧核苷、氨甲喋呤、甲磺酸甲酯、輔酶II(NADP)、6-磷酸葡萄糖(G-6-P):美國Sigma公司;臺盼藍、氨芐青霉素、四環(huán)素、赤霉素、氯吡脲:生工生物工程(上海)股份有限公司;S9:美國MOLTOX公司;RPMI1640培養(yǎng)基:美國 Gibco 公司;L-組氨酸、D-生物素、瓊脂粉、磷酸氫二鉀、磷酸氫銨鈉:上海源葉生物科技有限公司;氯化鈉、牛肉膏、葡萄糖、胰蛋白胨:北京化工有限公司。

1.1.2 主要儀器

試驗所用儀器設備情況見表1。

表1 儀器與設備

1.2 實驗方法

人正常肝細胞(WRL68)由新疆大學生物資源基因工程重點實驗室提供;小鼠淋巴瘤細胞(L5178Y)購自武漢普諾賽生命科技有限公司;鼠傷寒沙門氏菌購自美國MOLTOX公司。

1.2.1 WRL68細胞培養(yǎng)

WRL68細胞培養(yǎng)于10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素的MEM培養(yǎng)基中,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待細胞生長至70%～80%后加入胰酶消化,消化后將細胞稀釋制成1×105個·mL-1的細胞懸液,150 μL·孔-1接種于96板中,待其貼壁后,棄上清,將GA和CPPU用培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的GA(0.25 mg·mL-1,0.5 mg·mL-1,1 mg·mL-1,1.5 mg·mL-1,2 mg·mL-1,2.5 mg·mL-1,3 mg·mL-1,3.5 mg·mL-1,4 mg·mL-1,4.56 mg·mL-1)和CPPU(0.19 μg·mL-1、0.375 μg·mL-1、0.75 μg·mL-1、1.5 μg·mL-1、3 μg·mL-1、6.25 μg·mL-1,12.5 μg·mL-1,25 μg·mL-1,50 μg·mL-1,100 μg·mL-1),每孔加入150 μL進行24 h染毒。實驗結束后,棄去上清液,每孔加入20 μL MTT(終濃度為5 mg·mL-1)培養(yǎng)4 h,后加200 μL DMSO溶解結晶顆粒(另設6個空白孔),于490 nm波長處測定OD值。細胞存活率的計算參考侯志梅等[16]的方法。

1.2.2 小鼠淋巴瘤細胞(L5178Y)培養(yǎng)

在進行細胞系培養(yǎng)時,需要的培養(yǎng)液有RPMI-5、RPMI-10和RPMI-20。以上各培養(yǎng)液所用馬血清均經(jīng)56 ℃滅活,并在每毫升培養(yǎng)基中添加200 μg丙酮酸,和1%的青-鏈霉素。

THMG和THG的配制參考《GB 15193.20-2014食品安全國家標準體外哺乳類細胞TK基因突變試驗(標準狀態(tài):現(xiàn)行)》的標準。分別將THMG和THG配成100倍濃度母液,濾膜過濾除菌后分裝,-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 小鼠淋巴瘤細胞(L5178Y)突變頻率測定

首先用RPMI-5調(diào)整細胞密度為 5×105個·mL-1,每組取20 mL加入50 mL塑料離心管中。按1%體積加入赤霉素和氯吡脲,另設溶劑對照(DMSO)、空白對照組,振搖處理3 h(振蕩頻率為70次·min-1)。處理結束后,離心(1 000 rpm,5 min),棄上清,用PBS洗滌細胞1次,重新懸浮于RPMI-10中,并調(diào)整細胞密度到2×105個·mL-1。

將處理后的L5178Y細胞,用RPMI-20梯度稀釋至8個·mL-1,每組25 mL(對照組為50 mL)。用八通道加樣槍以200 μL·孔-1接種1塊96孔培養(yǎng)板。置于5% CO2、37 ℃ 飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 d,計數(shù)每塊培養(yǎng)板有集落生長的孔數(shù),記為PE0。隨后將剩余的L5178Y細胞表達培養(yǎng)2 d。每天計數(shù)細胞密度,調(diào)整細胞密度到2×105個·mL-1,并計算每日細胞增長率(DCG),據(jù)此求算兩天內(nèi)相對懸浮增長率(RSG)。取一定量細胞梯度稀釋后接種96孔板,測定PE2。表達培養(yǎng)結束后,取適量細胞,用RPMI-20培養(yǎng)液調(diào)整密度至1×104個·mL-1,每組50 mL(陰性對照為100 mL),加入三氟胸苷(TFT),使其終濃度為3 μg·mL-1。以200 μL·孔-1(2 000個細胞/孔)接種2塊96孔培養(yǎng)板(對照接種4塊),置于5%CO2、37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 d,計數(shù)各培養(yǎng)板有集落生長的孔數(shù)。平板接種效率和突變頻率、細胞毒性指標和小集落百分數(shù)(%SC)的計算參考《GB/T 15670.20-2017 農(nóng)藥登記毒理學實驗方法第20部分:體外哺乳動物細胞基因突變實驗》[17]中的方法。

1.2.4 鼠傷寒沙門氏菌的培養(yǎng)

所用培養(yǎng)基有頂層瓊脂培養(yǎng)基、Vogel-Bonner (V-B)培養(yǎng)基、底層瓊脂培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,培養(yǎng)基的配制參考何珍等[18]的方法。經(jīng)30 ℃培養(yǎng)后,鑒定合格的菌種放在加入1.5 mL的9%色譜級二甲基亞砜作為冷凍保護劑的超低溫(-80 ℃)冰箱中保存。

2 結果與分析

2.1 赤霉素和氯吡脲對WRL68細胞增殖的影響

通過3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法檢測GA和CPPU對WRL68細胞增殖的影響,結果如圖1所示。利用不同濃度的GA(0.25 mg·mL-1,0.5 mg·mL-1,1 mg·mL-1,1.5 mg·mL-1,2 mg·mL-1,2.5 mg·mL-1,3 mg·mL-1,3.5 mg·mL-1,4 mg·mL-1,4.56 mg·mL-1)對WRL68細胞暴露24 h后,MTT結果顯示隨著赤霉素濃度逐漸增加WRL68細胞存活率呈下降趨勢,存在明顯劑量依賴性。GA對WRL68細胞的半數(shù)抑制濃度為1.377 mg·mL-1,赤霉素濃度大于3 mg·mL-1時明顯抑制了WRL68細胞增長(圖1a)。

圖1 GA(a)和CPPU(b)對WRL68細胞增殖的影響

不同濃度的CPPU(0.19 μg·mL-1、0.375 μg·mL-1、0.75 μg·mL-1、1.5 μg·mL-1、3 μg·mL-1、6.25 μg·mL-1,12.5 μg·mL-1,25 μg·mL-1,50 μg·mL-1,100 μg·mL-1)對WRL68染毒24 h后,MTT結果顯示W(wǎng)RL68細胞存活率隨著濃度的升高有下降的趨勢。氯吡脲對WRL68細胞的半數(shù)抑制濃度為57.72 μg·mL-1,濃度大于100 μg·mL-1時明顯抑制了WRL68細胞增長(圖1b)。

根據(jù)MTT實驗中得出的IC50結果,選取IC50上下兩個濃度進行24 h染毒處理。隨機選取顯微鏡下不同視野拍照,觀察細胞形態(tài),將24孔板原有的培養(yǎng)基棄掉,加入100 μL·孔-10.5%臺盼藍染液,靜置5 min后,觀察細胞凋亡情況,結果如圖2所示。

圖2 GA和CPPU對WRL68細胞形態(tài)及凋亡的影響(200×)

高劑量組的受試物可使WRL68細胞的正常形態(tài)發(fā)生改變,細胞皺縮;染毒后細胞數(shù)量較對照組也明顯減少,在中劑量和低劑量組有不同程度的細胞凋亡和皺縮;高、中、低劑量組存活的細胞密度與藥物劑量呈相關性,隨著劑量越高細胞凋亡越嚴重。藥物對WRL68細胞產(chǎn)生毒性從而導致細胞凋亡,使細胞皺縮,形態(tài)改變,甚至細胞數(shù)量減少,這與MTT實驗結果相一致。

2.2 赤霉素、氯吡脲對小鼠淋巴瘤細胞(L5178Y)TK基因突變的影響

小鼠淋巴瘤細胞(L5178Y)TK基因突變試驗結果如表2和表3所示,因是短期試驗所以需進行活化系統(tǒng)(+S9)(表2)和非活化系統(tǒng)(-S9)(表3)兩種試驗條件。

表2 TK基因突變測定(無活化系統(tǒng))

表3 TK基因突變測定(活化系統(tǒng))

結果發(fā)現(xiàn),隨著赤霉素、氯吡脲劑量增加,TK基因突變頻率增加,赤霉素、氯吡脲誘發(fā)的突變頻率與自發(fā)突變率相比未呈現(xiàn)2倍以上的倍數(shù)關系。在無活化系統(tǒng)實驗條件下,赤霉素1.6 mg·mL-1、1.3 mg·mL-1、1 mg·mL-1劑量組與自發(fā)突變率相比呈1.78倍、1.52倍、1.07倍關系;在活化系統(tǒng)中分別是1.4倍、1.36倍、1.19倍。氯吡脲100 μg·mL-1、50 μg·mL-1、25 μg·mL-1劑量組與自發(fā)突變率相比呈1.89倍、1.09倍、1.01倍關系;在活化系統(tǒng)中分別是1.50倍、1.38倍、1.14倍。這就說明赤霉素、氯吡脲在設計的劑量范圍內(nèi)對L5178Y細胞TK基因無致突變毒性。

2.3 赤霉素、氯吡脲對細菌回復突變的影響

測試菌株的回變特性主要是檢驗菌株的敏感性,操作步驟與正式實驗相同,菌株生物學特性鑒定結果如表4所示,菌株生物學特性鑒定結果符合標準規(guī)范要求。部分致突變物需要代謝活化后才能引起回復突變,故需加入經(jīng)誘導劑誘導的大鼠肝制備的S9 混合液。

表4 菌株回變特性鑒定結果

Ames試驗結果如表5和表6所示。氯吡脲和赤霉素在測試范圍內(nèi),無論是否有代謝活化系統(tǒng)存在(S9),各菌株的平均回變菌落數(shù)均小于陰性對照組的2倍,說明氯吡脲和赤霉素對鼠傷寒沙門氏菌無致突變性。這進一步表明氯吡脲和赤霉素無致突變毒性。

表5 TA97a 菌株回復突變情況

表6 TA102 菌株回復突變情況

3 討論與結論

3.1 討論

GA和CPPU是生物活性最強的植物生長調(diào)節(jié)劑,在促進果實無核方面效果顯著,同時具有促進葡萄等果實膨大的作用[3,5]。在合理的劑量和使用頻次范圍內(nèi)使用GA和CPPU,可以促進水果果實的膨大和無核化,可以有效提高果品的產(chǎn)量和質(zhì)量。然而,由于過量使用GA和CPPU,對果實的安全性帶來潛在的風險尚不明確。關于GA、CPPU的細胞毒性目前研究較少,現(xiàn)有的研究主要是CPPU對心肌細胞(H9c2)、人體靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)[13]的影響。肝細胞具有多種功能且代謝旺盛,對外源污染物反應靈敏,離體培養(yǎng)的人肝細胞常用于毒理學、藥理學、生物化學及致癌作用等研究。

肝細胞的毒性一般從細胞活性、細胞形態(tài)等方面作為參考指標進行評價[19]。因此,本研究以人肝細胞WRL68為實驗對象,通過分析WRL68細胞增殖來評價膨大劑毒性。細胞存活率為毒性指標,檢測GA、CPPU不同暴露濃度下對WRL68的細胞毒性。結果表明,該細胞的存活率隨著GA和CPPU暴露濃度的增大而下降,說明WRL68細胞毒性與GA、CPPU的暴露濃度呈正相關。這一結果與郭毅煒等[20]研究斷乳至性成熟期間持續(xù)暴露赤霉素對大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的影響結果相一致,即GA高劑量組中有明顯可見的核固縮和凋亡小體,推測膨大劑可能加速了細胞凋亡。小鼠毒性試驗證明GA、CPPU對肝臟有一定的毒性,GA暴露導致小鼠肝臟脂變[8]。這也與本研究中GA和CPPU在劑量范圍內(nèi)不同程度抑制WRL68細胞增長的結果一致。

小鼠淋巴瘤細胞TK基因突變試驗(MLA)和細菌回復突變試驗是遺傳毒性試驗標準組合推薦方法之一,在藥物非臨床安全性評價及其他領域經(jīng)常被作為評價致突變毒性及遺傳毒性的關鍵方法[21]。本研究在劑量范圍內(nèi)回變菌落數(shù)均未超過菌種本身自發(fā)回變落數(shù)的2倍;而陽性組回變菌落數(shù)均大于自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍,這就說明GA和CPPU無致突變毒性。這一結果與林利美等[22]關于小鼠骨髓微核實驗結果相一致。這就表明膨大劑使用在合理范圍內(nèi)不存在致突變毒性。

目前,GA的遺傳毒性是存在爭議的。本研究結果表明赤霉素對鼠傷寒沙門氏菌和小鼠淋巴瘤細胞(L5178Y)在設計的劑量范圍內(nèi)不存在遺傳毒性。但商桑等[23]通過蠶豆根尖細胞微核實驗、小鼠骨髓細胞微核實驗證明在7.5 g·kg-1劑量下對植物細胞、動物的體細胞與生殖細胞均具有遺傳毒性。這一結果與前期研究人員的研究結果出現(xiàn)偏差,可能的原因是所采用的遺傳毒性探究方法和使用劑量不同。因此,有關赤霉素和氯吡脲的毒性效應評價還需更加全面的研究。

3.2 結論

本研究通過對兩種代表性植物生長調(diào)節(jié)劑赤霉素、氯吡脲對人肝細胞(WRL68)增殖、小鼠淋巴瘤細胞(L5178Y)TK基因突變以及鼠傷寒沙門氏菌回復突變的研究,得出不同濃度的赤霉素、氯吡脲暴露后均能不同程度的抑制WRL68細胞的存活,且細胞存活率隨著暴露濃度增大而下降;赤霉素、氯吡脲在劑量范圍內(nèi)不存在致突變毒性。該結果可為后續(xù)全面評估植物生長調(diào)節(jié)劑使用帶來的潛在風險性提供參考,也為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上進一步規(guī)范使用提供依據(jù)。