楊菁,關貴文,張婷,王競州,陳香梅,*

(1 石河子大學醫(yī)學院,新疆 石河子 832000;2 北京大學基礎醫(yī)學院病原生物學系,北京 100191)

NFATc3是活化T細胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)家族成員之一,廣泛表達于淋巴細胞、中性粒細胞和巨噬細胞等多種免疫細胞,以及心肌細胞、肝細胞、內(nèi)皮細胞和神經(jīng)元細胞等多種組織細胞中。作為一種轉錄因子,NFATc3可調(diào)控腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF α)、白細胞介素(interleukin,IL)和干擾素(interferon,IFN)等多種細胞因子的表達[1],參與機體免疫應答[2]、血管生成、細胞增殖、細胞侵襲遷移等過程的調(diào)控[3]。研究發(fā)現(xiàn),NFATc3基因異常表達與乳腺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌和血液腫瘤等多種惡性腫瘤發(fā)生有關[4]。

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),NFATc3在肝癌組織中的異常低表達與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關[5]。在肝細胞中,NFATc3可直接結合到IFNβ1和IFNλ1基因啟動子區(qū)的固有識別序列,并協(xié)同RIG-I信號通路轉錄激活IFN表達,進而發(fā)揮抑制HBV復制和抗腫瘤的功能。但NFATc3在肝癌細胞中調(diào)控的潛在靶基因及在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚未完全闡明。

本研究采用轉錄組測序(RNA sequencing,RNA-Seq)技術檢測了NFATc3基因敲除對肝癌細胞系SMMC7721轉錄組的影響,并對NFATc3可能調(diào)控的靶基因進行了預測分析和初步驗證。本研究結果將為明確NFATc3調(diào)控的靶基因及尋找新的抗肝癌治療靶點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

肝癌細胞系Huh7、SMMC7721購自中科院上海細胞庫,HepG2細胞購自ATCC細胞庫。細胞培養(yǎng)液DMEM購自Gibco公司;胎牛血清、青-鏈霉素雙抗試劑和胰酶購自Thermo公司;轉染試劑 lipo2000 和Lipofectamine RNAiMAX以及Trizol試劑購自Invitrogen 公司;PCDH-NFATc3 過表達質(zhì)粒由本實驗室前期構建;細胞蛋白裂解液 RIPA 購自上海碧云天公司;逆轉錄試劑盒和實時熒光定量試劑購自南京諾唯贊公司;引物由上海生工生物公司合成;NFATc3抗體購自Proteintech公司;β-tubulin抗體購自北京普利萊公司;HRP標記的鼠、兔二抗購自LI-COR公司;化學發(fā)光顯影試劑購自Thermo公司。

1.2 細胞轉染

將處于指數(shù)生長期的細胞使用胰酶消化后接種到培養(yǎng)板中,待細胞生長至60%～80%時進行轉染。先將質(zhì)粒/siRNA和轉染試劑與opti-DMEM培養(yǎng)基分別孵育5 min,兩者混勻孵育20 min,結束后將混合液加入細胞培養(yǎng)板中,每組設置3個細胞復孔。轉染4～6 h后,更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。實驗所用siRNA詳見表1。

表1 siRNA序列名稱及序列

1.3 蛋白印跡法(Western Blot)

檢測總蛋白表達水平細胞培養(yǎng)六孔板每孔加入200 μL細胞蛋白裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1),按照說明書從細胞中提取總蛋白,并檢測每組蛋白的濃度。

取相等適量的蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電泳結束后將蛋白從凝膠中電轉到PVDF膜上,之后將膜放在5% 脫脂奶粉中,室溫封閉2 h。封閉結束后,使用抗體雜交帶孵育NFATc3和β-tubulin的抗體(用TBST按1∶1 000比例稀釋),4 ℃孵育過夜;第二天,TBST緩沖液洗膜3次,每次10 min;使用雜交帶孵育相應種屬的二抗(用TBST按1∶1 000比例稀釋),室溫孵育2 h;TBST洗膜3次,每次10 min。最后滴加化學發(fā)光顯色液,放入化學發(fā)光儀中,按照儀器操作流程設置相關參數(shù)后,曝光拍照,保存圖片后分析數(shù)據(jù)。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測mRNA表達水平

使用預冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS) 清洗細胞2遍。每孔加入1 mL Trizol 細胞裂解液,按照說明書從細胞中提取總 RNA,并檢測RNA 的純度和濃度。

按照說明書,將RNA 轉錄成cDNA并進行qRT-PCR操作。取2 μL逆轉錄好的cDNA作為反應模板,按照2 × SYBR Green 480 反應液 10 μL、上、下游引物各1 μL和ddH2O 6 μL配制反應mix;使用羅氏480實時熒光定量PCR儀以:95 ℃預變性10 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸;40個循環(huán)數(shù)為反應條件。采用2-ΔCt方法,以actin作為內(nèi)參計算基因相對表達量。所涉及到的定量引物見表2。

表2 引物序列匯總表

1.5 熒光素酶報告基因實驗

分別在HepG2細胞轉染PCDH-vector或PCDH-NFATc3和pGL3-S100A8或pGL3-S100A9質(zhì)粒,并以Actin-Renilla質(zhì)粒作為內(nèi)參;轉染36 h后棄去培養(yǎng)基,并用PBS漂洗2次,每孔加入250 μL 1x Passive lysis buffer充分裂解細胞,10 000 rpm離心10 min,吸取25 μL上清加入96孔全白不透光檢測板中,在各孔中加入25 μL Luciferase Assay Reagent A試劑,檢測熒光值A;隨后加入25 μL Stop&Glo終止反應,檢測熒光值B,計算A/B的比值以比較相對熒光素酶活性。

1.6 RNA-seq測序分析

收集有或無仙臺病毒(SeV)感染的NFATc3基因穩(wěn)定敲除SMMC7721細胞株及其對照細胞,使用Trizol 試劑提取細胞的總RNA。RNA測序由美吉生物完成。Hisat2(2.2.1)[6]用于讀取映射,htseq-count用于計算基因count值[7]。

使用edgeR包對數(shù)據(jù)進行了歸一化,并進行差異表達基因(different expression genes,DEGs)分析,選擇FDR<0.01且|Fold Change|>1.5作為DEGs的篩選條件。使用STRING在線數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org/)[8]將DEGs繪制蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(Protein-Protein Interaction Networks,PPI)圖。

1.7 GO和KEGG富集分析

對于功能富集分析,將所有DEGs映射到基因本體(Gene Ontology,GO)數(shù)據(jù)庫中的通路,然后以P<0.05為閾值在DEG中搜索顯著豐富的GO項。GO項分析分為3個亞組,即生物過程(BP)、細胞成分(CC)和分子功能(MF)。所有DEGs均映射到京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)數(shù)據(jù)庫,并在P<0.05為閾值搜索顯著富集的KEGG通路。

1.8 數(shù)據(jù)庫分析

TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫中肝癌組織信息下載于MEXPRESS (https://mexpress.be)。利用Kaplan-Meier Plotter (www.kmplot.com)進行基因表達預后分析。利用JASPAR在線數(shù)據(jù)庫(https://jaspar.genereg.net/)和ALGGEN-PROMO數(shù)據(jù)庫(http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3)預測基因結合序列并驗證結合位點。

1.9 統(tǒng)計學分析

本研究中涉及的統(tǒng)計分析采用R(4.2.1)軟件進行。兩組間的差異分析使用獨立樣本t檢驗。定量數(shù)據(jù)采用平均值±標準偏差(SEM)方法表示。P<0.05則認為具有統(tǒng)計學差異。其中ns表示無統(tǒng)計學差異;*表示P<0.05;**表示P<0.01;***表示P<0.001;****表示P<0.000 1。

2 結果

2.1 NFATc3敲除細胞的RNA-seq分析

本研究前期用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建了NFATc3基因穩(wěn)定敲除SMMC7721細胞株,命名N3-KO細胞株,對照細胞為N3-WT[5]。為探究NFATc3對肝癌細胞轉錄組影響,對N3-WT組(WTM)和N3-KO組(KOM)細胞進行RNA-seq檢測。主成分分析圖和小提琴圖結果顯示(圖1A,圖1B),兩組樣本組內(nèi)一致性較好,兩組間差異明顯。根據(jù)測序結果共篩選到677個DEGs(圖1C,圖1D),其中N3-KO細胞中表達上調(diào)DEGs有153個(up,1.5倍差異),表達下調(diào)DEGs有524個(down,1.5倍差異)。隨后,我們對上述DEGs進行了GO和KEGG分析。結果顯示,NFATc3基因穩(wěn)定敲除影響的DEGs主要富集在代謝、細胞外基質(zhì)、分泌和血管生成等GO通路中,并富集在細胞外基質(zhì)、腫瘤、病毒感染和PI3K-Akt等KEGG通路中(圖1E,圖1F)。

A.SMMC 7721 N3-WT組和SMMC 7721 N3-KO組RNA-seq測序結果的PCA圖,藍色三角代表SMMC 7721 N3-WT組(WTM),橙色點代表SMMC 7721 N3-KO組(KOM)。B.WTM和KOM組細胞RNA-seq測序結果小提琴圖分析。C.WTM和KOM組細胞RNA-seq測序結果火山圖分析。D.WTM和KOM組細胞RNA-seq測序DEGs熱圖分析。E.WTM和KOM組細胞RNA-seq測序DEGs的GO富集分析。F.WTM和KOM組細胞RNA-seq測序DEGs的KEGG富集分析。圖1 N3-KO和N3-WT細胞的RNA-seq測序分析

2.2 SeV感染下NFATc3敲除細胞的RNA-seq分析

本研究前期發(fā)現(xiàn),NFATc3敲除減弱了RIG-I信號通路對IFN表達的轉錄激活作用。提示NFATc3可以協(xié)同RIG-I信號通路調(diào)控肝癌細胞內(nèi)基因的表達。仙臺病毒(Sendai virus,SeV)是一類雙鏈RNA病毒,可引起天然免疫RIG-I樣受體(RIG-I like receptors,RLRs)以及下游信號分子活化,導致干擾素和炎性因子的產(chǎn)生。SeV作為一個經(jīng)典的模式病毒,已經(jīng)被廣泛用于研究天然免疫通路的激活和信號轉導機制。為了進一步探究NFATc3敲除對SeV感染激活天然免疫后肝癌細胞轉錄組的影響,我們對SeV感染24 h后的N3-WT組(WTS)及N3-KO組(KOS)細胞也進行了RNA-seq檢測。結果顯示,兩組樣本的組內(nèi)一致性較好,兩組間差異明顯(圖2A,圖2B)。根據(jù)測序結果共篩選到1598個DEGs(圖2C,圖2D),其中表達上調(diào)DEGs有636個(up,1.5倍差異),下調(diào)DEGs有962個(down,1.5倍差異)。GO和KEGG富集分析結果顯示,DEGs主要富集在發(fā)育和對維生素的反應等GO通路中,并富集在腫瘤、代謝、和PI3K-Akt等KEGG通路中(圖2E,圖2F)。

A.SeV處理24 h的SMMC 7721 N3-WT組(WTS)和SMMC 7721 N3-KO組(KOS)RNA-seq測序結果的PCA圖,藍色三角代表SMMC 7721 N3-WT組(WTS),橙色點代表SMMC 7721 N3-KO組(KOS)。B.WTS和KOS組細胞RNA-seq測序結果小提琴圖分析。C.WTS和KOS組細胞RNA-seq測序結果火山圖分析。D.WTS和KOS組細胞RNA-seq測序DEGs熱圖分析。E.WTS和KOS組細胞RNA-seq測序DEGs的GO富集分析。F.WTS和KOS組細胞RNA-seq測序DEGs的KEGG富集分析。圖2 SeV感染的N3-KO和N3-WT細胞的RNA-seq測序分析

為了篩選在肝癌細胞中受NFATc3調(diào)控同時又在RIG-I信號通路激活后調(diào)控仍然存在的潛在靶基因,我們對有和無SeV感染激活天然免疫的N3-WT和N3-KO細胞RNA-seq的DEGs進行交集分析,共計獲得449個DEGs(圖3A)。其中,有30個基因在GO數(shù)據(jù)庫中被注釋為免疫相關基因,包括10個NFATc3敲除后上調(diào)的基因和20個下調(diào)的基因(圖3B)。對這30個免疫相關基因使用STRING數(shù)據(jù)庫進行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(Protein-protein interaction network,PPI)分析(圖3C)。

A.有或無SeV處理的SMMC 7721 N3-WT組和SMMC 7721 N3-KO組RNA-seq DEGs取交集的韋恩圖。B.交集中30個免疫相關基因的表達水平熱圖。C.免疫相關DEGs的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡圖。圓圈代表各個蛋白,線條代表兩個蛋白之間的相互作用。圖3 有或無SeV感染的SMMC 7721 N3-KO RNA-seq DEGs交集

結果顯示GAPDH、小分子肽S100鈣結合蛋白A8(S100 calcium binding protein A8,S100A8)和小分子肽S100鈣結合蛋白A9(S100 calcium binding protein A9,S100A9)處于PPI網(wǎng)絡的核心位置。既往文獻報道,S100A8和S100A9[9]參與炎癥過程和免疫反應的調(diào)節(jié)[10],并且在腫瘤生長中起重要作用[11]。而無論有無SeV處理NFATc3敲除均能上調(diào)S100A8和S100A9的表達水平,提示S100A8和S100A9可能是NFATc3在肝癌細胞中下調(diào)的重要下游靶基因。

2.3 S100A8/S100A9是NFATc3負調(diào)控的潛在靶基因

為驗證NFATc3對S100A8和S100A9表達的影響,首先采用qRT-PCR實驗檢測NFATc3基因穩(wěn)定敲除SMMC7721 N3-KO及其對照N3-WT細胞株S100A8和S100A9 mRNA水平。結果顯示,敲除NFATc3基因后,S100A8和S100A9 mRNA水平均顯著上調(diào)(圖4A)。我們在肝癌細胞系Huh7細胞中瞬時轉染了靶向NFATc3 mRNA的si-NFATc3和對照siRNA,Western blot實驗結果顯示轉染si-NFATc3顯著降低了Huh7細胞內(nèi)源NFATc3蛋白水平,而qRT-PCR實驗證實敲減NFATc3顯著上調(diào)了S100A8和S100A9 mRNA水平(圖4B)。此外,我們在內(nèi)源NFATc3表達較低HepG2細胞中瞬時轉染PCDH-NFATc3及PCDH-vector對照質(zhì)粒,Western blot實驗表明轉染PCDH-NFATc3顯著上調(diào)了HepG2細胞內(nèi)的NFATc3蛋白水平,而qRT-PCR實驗顯示過表達NFATc3降低S100A8和S100A9 mRNA水平(圖4C)。為探究NFATc3是否可直接調(diào)控S100A8和S100A9基因的轉錄,通過JASPAR在線數(shù)據(jù)庫,對S100A8和S100A9啟動子區(qū)進行分析。結果顯示,S100A8和S100A9基因啟動子區(qū)分別存在10個、7個NFATc3的結合位點(圖4D)。

A.SMMC7721 N3-KO和N3-WT細胞株的S100A8和S100A9 mRNA水平。B.Huh7細胞中敲減NFATc3后S100A8和S100A9 mRNA水平。C.HepG2細胞過表達NFATc3后S100A8和S100A9 mRNA水平。D.S100A8和S100A9啟動子區(qū)上NFATc3的結合位點。E.雙熒光報告基因實驗檢測過表達NFATc3對S100A8或S100A9啟動子區(qū)活性影響。T test,**表示P<0.01;***表示P<0.001;****表示P<0.000 1。圖4 NFATc3可能的靶基因S100A8/S100A9的驗證

進一步在HepG2中分別轉染含有S100A8或S100A9啟動子區(qū)序列的熒光素酶報告質(zhì)粒(PGL3-S100A8或PGL3-S100A9)及PCDH-vector或PCDH-NFATc3過表達質(zhì)粒,以Actin-Renilla作為內(nèi)參。雙熒光素酶報告基因結果顯示,過表達NFATc3后S100A8和S100A9啟動子區(qū)熒光素酶活性均下調(diào)且有統(tǒng)計學差異,提示轉錄因子NFATc3可能通過直接結合S100A8和S100A9的啟動子區(qū)從而負向調(diào)控S100A8和S100A9表達。

2.4 S100A8/S100A9異常表達促進肝癌的進展

為了探究S100A8/S100A9在肝癌發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮的作用,我們利用TCGA數(shù)據(jù)庫,分析了S100A8/S100A9在肝癌組織中的表達。結果表明,肝癌組織和癌旁組織中S100A8(P<0.000 1)和S100A9(P=0.012 8)均存在顯著差異(圖5A)。此外,利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫進一步分析后發(fā)現(xiàn),S100A8(P=0.032)、S100A9(P=0.000 13)和S100A8+S100A9(P=0.000 023 )高表達與肝癌患者的不良預后有關(圖5B)。上述結果提示,S100A8和S100A9在肝癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促癌作用[12-17]。

A.TCGA數(shù)據(jù)庫中S100A8/S100A9 mRNA表達水平。B.基于Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫中S100A8、S100A9或S100A8+S100A9 mRNA水平繪制的肝癌患者總生存曲線。T test,*表示P<0.05;****表示P<0.0001。圖5 肝癌中S100A8/S100A9的表達水平及預后

3 討論

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,但其發(fā)生發(fā)展的分子機制目前尚未完全闡明。我們前期研究發(fā)現(xiàn),NFATc3可以上調(diào)肝細胞中IFNβ1和IFNλ1表達從而發(fā)揮抑制HBV復制和抗肝癌雙重作用,且NFATc3低表達與肝癌患者不良預后有關,提示NFATc3發(fā)揮抑癌作用[5]。作為一種轉錄因子,NFATc3蛋白活化入核后往往需要以同源或異源二聚體的形式與其它轉錄因子結合,協(xié)同發(fā)揮轉錄調(diào)控作用。在免疫細胞中,NFATc3主要轉錄激活IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ等細胞因子。但在其他組織細胞中,已經(jīng)確定的NFATc3靶基因較少。本研究首次采用RNA-seq技術,對敲除NFATc3基因的SMMC7721細胞進行了轉錄組分析,并發(fā)現(xiàn)S100A8和S100A9可能是受NFATc3負調(diào)控的下游靶基因。

研究發(fā)現(xiàn),NFATc3的缺失或低表達與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關[18-19]。NFATc3可通過負調(diào)控Ras-JNK1/2-AP-1通路抑制小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3的增殖活性[20],而且在Nfatc3基因敲除的小鼠中更易發(fā)生淋巴腫瘤與乳腺腫瘤。我們前期研究也發(fā)現(xiàn),NFATc3在肝癌組織中呈顯著低表達,體外實驗表明NFATc3可抑制肝癌細胞的增殖和遷移能力。已有文獻報道,NFAT家族蛋白具有調(diào)節(jié)細胞周期、免疫應答、細胞凋亡及血管生成等功能[2,21],但NFATc3異常表達對肝癌細胞的功能影響目前尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn),在肝癌細胞中敲除NFATc3基因后,其影響的宿主基因功能主要富集在發(fā)育、代謝、細胞外基質(zhì)和血管生成等GO通路以及細胞外基質(zhì)、代謝、病毒感染、腫瘤和PI3K-Akt等KEGG通路中。上述GO以及KEGG通路都與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關,提示NFATc3基因敲除可能通過影響肝癌細胞的發(fā)育、代謝、腫瘤與免疫等通路相關基因,進而發(fā)揮抗腫瘤作用。

為了篩選受NFATc3轉錄調(diào)控的潛在靶基因,我們將有無SeV感染的兩組RNA-seq篩選到的DEGs做了交集分析,這部分基因代表的是受NFATc3調(diào)控且在SeV感染下仍然發(fā)生表達差異的宿主基因。鑒于NFATc3具有抗HBV感染和抗肝癌細胞增殖的作用,二者均與宿主細胞的免疫功能有關,我們選取了DEGs交集中的30個免疫相關基因,進行了PPI蛋白互作分析。我們發(fā)現(xiàn)S100A8、S100A9位于網(wǎng)絡互作圖的核心位置,且敲減或過表達實驗均證實NFATc3可以下調(diào)肝癌細胞中S100A8、S100A9的表達。S100A8/S100A9屬于S100蛋白家族成員,二者通常以異二聚體的形式存在。S100A8/S100A9不僅參與炎癥反應,而且還在多種自身免疫病以及癌癥發(fā)展中發(fā)揮重要作用[10]。在食管鱗狀細胞癌中,S100A8/A9在腫瘤細胞和腫瘤浸潤免疫細胞中均呈高表達[13,22],并可通過激活Akt和p38 MAPK信號通路促進腫瘤的進展[23]。在DEN誘導的小鼠肝癌模型中,S100A9基因敲除小鼠的腫瘤細胞增殖減少[17]。外源性表達S100A9可激活MAPK/c-Jun信號通路,促進肝癌細胞的體外增殖和侵襲[24]。上述結果提示,S100A8/A9二聚體可能通過影響肝臟腫瘤微環(huán)境,增強腫瘤細胞的增殖和遷移/侵襲等能力,從而促進肝臟腫瘤發(fā)生[12]。通過qRT-PCR實驗我們發(fā)現(xiàn)NFATc3可以負調(diào)控S100A8和S100A9的mRNA水平,同時S100A8和S100A9啟動子區(qū)均存在多個NFATc3的潛在結合位點([T]GGAAA),且雙熒光素酶報告基因實驗證實NFATc3能下調(diào)S100A8和S100A9的啟動子區(qū)活性,提示NFATc3可通過影響S100A8和S100A9的啟動子區(qū)活性從而負向調(diào)控S100A8和S100A9的表達。但是,NFATc3是否通過與S100A8和S100A9的啟動子區(qū)結合還需通過ChIP實驗加以驗證。此外,已有文獻報道NFATc3可以與多個轉錄因子如AP1、GATA4和FOXP3等結合,協(xié)同發(fā)揮轉錄調(diào)控作用[25]。因此,NFATc3是否結合并協(xié)同負向調(diào)控S100A8和S100A9基因啟動子的轉錄因子,進而抑制S100A8和S100A9表達也需未來深入探究?，F(xiàn)有S100A8/A9特異性抑制劑帕奎莫德(Paquinimod),可通過結合S100A9并抑制其與TLR4/MD2和RAGE的相互作用[26]。但S100A8/A9抑制劑在肝癌中的作用尚未見文獻報道,其是否可以用于肝癌治療的靶向藥物尚需更多的基礎及臨床探究。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)肝癌細胞中敲除NFATc3基因主要影響發(fā)育、代謝、病毒感染、血管生成和PI3K-Akt等通路,且S100A8和S100A9可能作為NFATc3負調(diào)控的下游靶基因參與NFATc3的抗HBV和抗肝癌作用。本研究不僅為明確NFATc3的功能及調(diào)控靶基因提供理論依據(jù),也將為開發(fā)新的肝癌治療藥物提供潛在靶點。