王兆旭,郭亮,孫躍,張俊婷,張潔

(石河子大學化學化工學院/新疆兵團化工綠色過程重點實驗室,新疆 石河子 832003)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織2020年的統(tǒng)計,癌癥仍是近年來阻礙我國以至世界人口平均壽命提高的重要因素。目前,全球癌癥患者基數(shù)龐大且死亡率高,我國的癌癥病例和癌癥死亡率均占全球的四分之一左右,受到的影響尤為顯著[1]。目前,化療是癌癥治療的主要措施之一,但已知藥物仍存在副作用大,療效不理想等問題,尤其是多耐藥腫瘤細胞株的出現(xiàn)加劇了癌癥治療難度,急需開發(fā)新型抗腫瘤藥物。天然產(chǎn)物是抗腫瘤以及其它藥物先導化合物的主要來源之一,多種生物堿類化合物具有良好的抗腫瘤潛力[2-3]。

β-咔啉生物堿是吲哚類生物堿的重要分支,其母體結(jié)構(gòu)具有廣泛的生物活性[4-9],是一種良好的藥物骨架。多種天然β-咔啉生物堿具有良好的抗腫瘤活性[10-12],由于β-咔啉修飾位點的多樣性,通過結(jié)構(gòu)修飾已獲得多種活性優(yōu)異的抗腫瘤先導化合物[13-15]。目前的報道中,對β-咔啉環(huán)的修飾多集中于C1、N2、C3、N9位點,對C5、C6、C7、C8位點的報道較少。天然β-咔啉生物堿Eudistomidins (B-D, J)(圖1)對多種腫瘤細胞系具有良好抑制活性,其C6位取代基對該系列化合物抗腫瘤活性具有潛在貢獻。近期,有報道稱C6、C7和C8取代的β-咔啉具有細胞毒性[16]。本課題組前期對β-咔啉類化合物進行了大量的合成及生物活性研究[17-22],曾在β-咔啉的C6位引入N-芳基取代基,并獲得了具有較強抗腫瘤活性的化合物單體[23]。在此基礎上,本文設想在β-咔啉的C6位引入取代芳基,以期得到具有良好抗腫瘤活性的先導化合物。

圖1 天然產(chǎn)物Eudistomidins (B-D, J) 的結(jié)構(gòu)

為了設計一系列新型C6位取代的β-咔啉化合物,本文以1-甲基-β-咔啉為母核結(jié)構(gòu),通過溴原子為媒介,借助Suzuki反應在β-咔啉的C6位引入多種取代苯基,合成了21個新型6-取代-β-咔啉衍生物,合成路線見圖2,圖3。并評估了它們對A549、BGC-823、CT-26、Bel-7402 和MCF-7的體外抗腫瘤活性。

圖2 中間體4,5a, 5b的合成路線

圖3 目標化合物6a-6u的合成路線

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

L-色氨酸、二氧化錳、N-溴代丁二酰亞胺(NBS)、四-(三苯基膦)-鈀、苯硼酸、4-甲氧基苯硼酸、4-氟苯硼酸、4-(三氟甲氧基)苯硼酸、4-(三氟甲基)苯硼酸、3,4,5-三氟苯硼酸、4-氰基苯硼酸、磷酸鉀、碳酸鉀、碳酸銫、氟化鉀、氫化鈉、鈀/碳、醋酸鈀、無水乙醇、乙酸乙酯(分析純,上海泰坦科技股份有限公司);乙醛、二氯甲烷、石油醚、甲醇(分析純,上海麥克林生化科技有限公司);N,N-二甲基甲酰胺(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);RPMI-1640培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液雙抗(索萊寶(北京)科技有限公司);胎牛血清、四甲基偶氮唑藍(Bio-Rad公司)。

儀器:ADVANCE 400型核磁共振波譜儀(瑞士Brucker公司);LTQ Orbitrap XL型質(zhì)譜儀(賽默飛世爾科技公司);FA2004型電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司);X-5型顯微熔點測定儀(北京泰克儀器有限公司);WS70-1型紅外快速干燥箱(鞏義市予華儀器有限公司);IKA RV8型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國IKA公司);IKA VACSTAR digital 真空泵(德國IKA公司);IKA RCT basic 磁力加熱攪拌器(德國IKA公司);ZF-I型三用紫外分析儀(上海寶山顧村電光儀器廠);Bio-Rad 全自動酶標儀(美國伯樂公司)。

1.2 6-芳基-β-咔啉衍生物的合成

1.2.1 中間產(chǎn)物的合成

中間體2-4的合成方法:根據(jù)文獻報道方法[23-24]合成中間體2-4合成路線見圖2。中間體4為棕色固體,mp 180.2-182.8 ℃。

中間體5a,5b的合成方法:稱取中間體4(1 mmol),NaH (2 mmol),于250 mL單口瓶中,加入DMF混合攪拌,混合物室溫攪拌2 min后加入碘甲烷或五氟溴芐 (1.2-2 mmol) 室溫反應,待反應完全后將反應液倒入冰水中猝滅反應,乙酸乙酯萃取 (300 mL×3),合并有機相,飽和食鹽水洗滌,有機相加入乙醇(450 mL)、濃鹽酸 (0.5 mL),減壓濃縮后加入少量丙酮在-10 ℃下冷藏過夜,抽濾,少量丙酮洗滌,濾餅溶于水中,碳酸氫鈉調(diào)pH值大于8,加入乙酸乙酯(300 mL×3)萃取,合并有機相用飽和食鹽水洗滌,無水Na2SO4干燥,減壓濃縮,得到關鍵中間體5a,5b。

1.2.2 目標化合物(6a-6u)的合成

以Suzuki反應常用條件為基礎,以6-溴-1-甲基-β-咔啉(4)和苯硼酸為原料,以Pd(PPh3)4為催化劑,對溶劑、堿等條件進行了優(yōu)化(表1)。使用氮氣保護時,即使置換多次(8-10次)仍會產(chǎn)生部分較難的副產(chǎn)物,改用氬氣保護時,此類副產(chǎn)物幾乎不產(chǎn)生。并且,在常用劑量催化劑(5 mmol%)、堿(0.4 mmol)的下原料無法反應完全,增加劑量至催化劑(10 mmol%)、堿(0.6 mmol)時原料可反應完全。在乙二醇二甲醚(DMA)為溶劑的條件下,對該反應常用堿的種類進行了篩選,其中在K3PO4下的產(chǎn)率最優(yōu),在K2CO3的條件下無法反應完全,在Cs2CO3、CsF的條件下有不同程度的副產(chǎn)物產(chǎn)生。之后對溶劑進行了篩選,常用溶劑中,以乙二醇二甲醚為溶劑產(chǎn)率最優(yōu)。其在乙腈中產(chǎn)率有所降低,在DMF中有大量副產(chǎn)物生成。有文獻報道稱體系中加入一定量的水對Suzuki反應有積極影響。因此,嘗試了乙二醇二甲醚/水、乙腈/水兩種溶劑體系,加入水后反應的速率和產(chǎn)率都有一定程度的提升,其中乙二醇二甲醚/水體系產(chǎn)率最優(yōu)為94%。此外,我們還嘗試了Pd(OAc)2和Pd/C兩種無配體催化體系,其中Pd(OAc)2為催化劑時反應不能發(fā)生。以Pd/C為催化劑時,在空氣氣氛下反應,雖能以良好產(chǎn)率得到目標化合物,但不能達到條目5產(chǎn)率。

表1 反應條件優(yōu)化

以6-苯基-1-甲基-β-咔啉(6a)的合成為例,稱取中間體6-溴-1-甲基-β-咔啉(4) (261 mg, 1 mmol),苯硼酸(145 mg, 1.2 mmol),K3PO4(690 mg, 4 mmol)和Pd(PPh3)4(114 mg, 10% mmol)于反應管中,通氬氣置換3次,用注射器加入乙二醇二甲醚(4 mL)和水(4 mL),80 ℃反應10 h,TLC監(jiān)測反應進程。反應完畢后,將反應液倒入水中,乙酸乙酯萃取(100 mL×3),飽和食鹽水洗滌,無水Na2SO4干燥,減壓濃縮,柱層析純化獲得目標產(chǎn)物6a。以相同方法制備其余目標產(chǎn)物。為了研究各類取代基對抗腫瘤活性的影響,我們選擇了無取代、具有吸電子取代基和供電子取代基的苯基結(jié)構(gòu),以研究取代基電子效用的影響。此外,由于氟原子在藥物領域具有重要地位,已上市藥物中含氟藥物占較大比例。因此,我們選擇了具有單氟、多氟以及三氟甲基取代基的苯基結(jié)構(gòu),以研究氟原子的引入以及引入氟原子的數(shù)目及集中度對其抗腫瘤活性的影響。

1.2.3 目標化合物(6a-6u)結(jié)構(gòu)表征

6-苯基-1-甲基-β-咔啉(6a):合成路線見圖3,白色固體,收率94.0%,mp>280 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 11.76 (s, 1H), 8.56 (d,J=2.0 Hz, 1H), 8.24 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.08 (d,J=5.2 Hz, 1H), 7.88 (dd,J=8.4, 1.6 Hz, 1H), 7.80 (d,J=7.6 Hz, 2H), 7.72 (d,J=8.4 Hz, 1H), 7.52 (t,J=7.6 Hz, 2H), 7.36 (t,J=7.2 Hz, 1H), 2.80 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 142.40, 141.26, 140.58, 137.26, 135.39, 132.31, 129.38, 128.06, 127.76, 127.20, 127.13, 122.14, 120.37, 113.60, 112.86, 20.51; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C18H15N2[M+H]+259.122 9, found 259.123 0。

6-(4-甲氧基苯基)-1-甲基-β-咔啉(6b):白色固體,收率78.0%,mp>280 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 11.56 (s, 1H), 8.48 (d,J=2.0 Hz, 1H), 8.20 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.00 (d,J=5.2 Hz, 1H), 7.80 (dd,J=8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.76～7.68 (m, 2H), 7.64 (d,J=8.4 Hz, 1H), 7.12～7.00 (m, 2H), 3.80 (s, 3H), 2.76 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 158.80, 142.62, 139.94, 137.95, 135.42, 133.80, 131.93, 128.22, 127.58, 127.17, 122.22, 119.57, 114.81, 113.33, 112.70, 55.63, 20.88; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C19H17N2O [M+H]+289.133 5, found 289.133 8。

6-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1-甲基-β-咔啉(6c):白色固體,收率87.9%,mp 241.6～243.1 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 11.92 (s, 1H), 8.60 (s, 1H), 8.28 (d,J=5.6 Hz, 1H), 8.16 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.00～7.84 (m, 3H), 7.72 (d,J=8.4 Hz, 1H), 7.48 (d,J=8.0 Hz, 2H), 2.84 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 147.82, 142.15, 141.02, 140.56, 136.46, 135.35, 131.00, 128.96, 128.52, 128.10, 122.01, 121.95, 120.86, 119.37 (q,J= 254.6 Hz), 113.87, 113.06, 20.06; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C19H14F3N2O [M+H]+343.105 2, found 343.105 5。

6-(4-氟苯基)-1-甲基-1-甲基-β-咔啉(6d):白色固體,收率89.1%,mp 264.0～265.3 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 11.64 (s, 1H), 8.52 (d,J=2.0 Hz, 1H), 8.24 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.00 (d,J=5.2 Hz, 1H), 7.84～7.78 (m, 3H), 7.68 (d,J=8.8 Hz, 1H), 7.32 (t,J=8.8 Hz, 2H), 2.78 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 160.69 (d,J=241.8 Hz), 142.73, 140.24, 138.12, 137.84 (d,J=2.9 Hz), 135.46, 131.11, 129.07 (d,J=7.9 Hz), 127.54, 127.36, 122.24, 120.24, 116.20 (d,J=21.1 Hz), 113.34, 112.79, 20.91; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C18H14FN2[M+H]+277.113 5, found 277.113 6。

6-(4-(三氟甲基)苯基)-1-甲基-β-咔啉(6e):白色固體,收率86.7%,mp 258.0～259.7 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 11.76 (s, 1H), 8.68 (d,J=2.0 Hz, 1H), 8.24 (d,J=5.6 Hz, 1H), 8.08 (d,J=5.6 Hz, 1H), 8.02 (d,J=8.0 Hz, 2H), 7.92 (dd,J=8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.84 (d,J=8.0 Hz, 2H), 7.72 (d,J=8.4 Hz, 1H), 2.80 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 145.29 (q,J=1.0 Hz), 142.72, 140.94, 137.96, 135.48, 130.38, 127.76, 127.61, 127.27 (q,J=31.8 Hz), 126.23 (q,J=3.8 Hz), 124.99 (q,J=270.1 Hz), 122.28, 120.98, 113.49, 113.03, 20.75; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C19H14F3N2[M+H]+327.110 3, found 327.110 4。

6-(3,4,5-三氟苯基)-1-甲基-β-咔啉(6f):白色固體,收率96.0%,mp 259.7～261.1 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 11.72 (s, 1H), 8.64 (d,J=2.0 Hz, 1H), 8.28 (d,J=5.6 Hz, 1H), 8.00 (d,J=5.2 Hz, 1H), 7.92 (dd,J=8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.80 (d,J=6.4 Hz, 1H), 7.76 (d,J=6.8 Hz, 1H), 7.64 (d,J=8.8 Hz, 1H), 2.76 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 152.39 (m), 142.83, 140.82, 139.36 (dd,J=246.5, 15.4 Hz), 138.23, 135.51, 131.89 (dd,J=272.4, 9.8 Hz), 128.63, 127.60, 127.18, 122.22, 120.83, 113.35, 112.82, 111.39(m), 20.85; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C18H12F3N2[M+H]+313.094 7, found 313.094 5。

6-(4-(甲腈基)苯基)-1-甲基-β-咔啉(6g):白色固體,收率90.5%,mp>280 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 11.80 (s, 1H), 8.72 (d,J=2.0 Hz, 1H), 8.28 (d,J=5.6 Hz, 1H), 8.08 (d,J=5.6 Hz, 1H), 8.04～8.00 (m, 2H), 7.96～7.92 (m, 3H), 7.72 (d,J=8.4 Hz, 1H), 2.80 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 145.76, 142.70, 141.15, 137.87, 135.48, 133.27, 130.01, 127.88, 127.79, 127.61, 122.29, 121.19, 119.55, 113.55, 113.08, 109.47, 20.67; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C19H14N3[M+H]+284.118 2, found 284.118 2。

6-苯基-1,9-二甲基-β-咔啉(6h):白色固體,收率91.0%,mp 154.1～155.3 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.56 (d,J=2.0 Hz, 1H), 8.24 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.08 (d,J=5.2 Hz, 1H), 7.92 (dd,J=8.8, 2.0 Hz, 1H), 7.84～7.76 (m, 3H), 7.52 (t,J=7.6 Hz, 2H), 7.36～7.32 (m, 1H), 4.16 (s, 3H), 3.04 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 142.54, 141.63, 141.07, 137.97, 136.17, 132.14, 129.38, 128.38, 127.53, 127.18, 127.15, 121.41, 119.88, 113.60, 111.07, 32.63, 23.68; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C19H17N2[M+H]+273.138 6, found 273.138 7。

6-(4-甲氧基苯基)-1,9-二甲基-β-咔啉(6i):白色固體,收率75.5%,mp 189.6～190.6 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.48 (s, 1H), 8.20 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.08 (d,J=5.2 Hz, 1H), 7.88 (d,J=8.8 Hz, 1H), 7.76～7.68 (m, 3H), 7.08 (d,J=8.8 Hz, 2H), 4.16 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.04 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 158.85, 142.49, 141.27, 137.87, 136.14, 133.52, 131.97, 128.34, 128.22, 127.25, 121.39, 119.21, 114.82, 113.58, 110.99, 55.64, 32.62, 23.68; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C20H19N2O [M+H]+303.149 1, found 303.149 2。

6-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1,9-二甲基-β-咔啉(6j):白色固體,收率80.5%,mp 146.7～147.9 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.60 (d,J=2.0 Hz, 1H), 8.24 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.08 (d,J=5.2 Hz, 1H), 7.96～7.88 (m, 3H), 7.80 (d,J=8.8 Hz, 1H), 7.48 (d,J=8.0 Hz, 2H), 4.20 (s, 3H), 3.04 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 147.79, 147.77, 142.63, 141.79, 140.47, 138.06, 136.20, 130.62, 128.92, 128.34, 127.53, 121.94, 121.42, 120.21, 119.38 (q,J= 254.7 Hz), 113.60, 111.20, 32.66, 23.67; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C20H16F3N2O [M+H]+357.120 9, found 357.120 6。

6-(4-氟苯基)-1-甲基-1,9-二甲基-β-咔啉(6k):白色固體,收率86.9%,mp 146.1～147.3 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.56 (d,J=1.2 Hz, 1H), 8.24 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.08 (d,J=5.2 Hz, 1H), 7.92 (dd,J=8.8, 2.0 Hz, 1H), 7.88～7.80 (m, 2H), 7.76 (d,J=8.4 Hz, 1H), 7.36～7.28 (m, 2H), 4.16 (s, 3H), 3.04 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 160.73 (d,J=241.9 Hz), 142.58, 141.56, 137.99 (d,J=3.0 Hz), 137.58, 136.18, 131.13, 129.08 (d,J=7.9 Hz), 128.33, 127.46, 121.39, 119.87, 116.22 (d,J=21.1 Hz), 113.59, 111.10, 32.64, 23.69; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C19H16FN2[M+H]+291.129 2, found 291.129 2。

6-(4-(三氟甲基)苯基)1,9-二甲基-β-咔啉(6l):白色固體,收率83.2%,mp 139.2～141.1 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.68 (d,J=1.6 Hz, 1H), 8.24 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.12 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.04～7.96 (m, 3H), 7.84 (dd,J=8.4, 5.2 Hz, 3H), 4.20 (s, 3H), 3.04 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 145.04, 142.67, 142.12, 138.09, 136.22, 130.31, 128.40, 127.74, 127.62, 127.31 (q,J=31.7 Hz), 126.21 (q,J=3.9 Hz), 123.64 (q,J=270.1 Hz), 121.46, 120.55, 113.65, 111.31, 32.68, 23.62; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C20H16F3N2[M+H]+341.126 0, found 341.126 0。

6-(3,4,5-三氟苯基)-1,9-二甲基-β-咔啉(6m):白色固體,收率94.2%,mp 160.4～161.1 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 8.40～8.16 (m, 2H), 7.92 (d,J=4.8 Hz, 1H), 7.76 (d,J=8.4 Hz, 1H), 7.52 (d,J=8.6 Hz, 1H), 7.36～7.20 (m, 3H), 4.20 (s, 3H), 3.12 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 152.79, 150.35 (m), 142.04 (d,J=19.9 Hz), 137.78, 136.40, 130.26, 129.10, 127.43, 121.62, 119.86, 113.24, 111.04 (dd,J=15.9, 5.9 Hz), 110.16, 32.55, 23.11; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C19H14F3N2[M+H]+327.110 3, found 327.110 2。

6-(4-(甲腈基)苯基)-1,9-二甲基-β-咔啉(6n):白色固體,收率89.9%,mp 213.3～214.6 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.72 (d,J=1.6 Hz, 1H), 8.24 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.08 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.04～8.00 (m, 3H), 7.96～7.92 (m, 2H), 7.80 (d,J=8.4 Hz, 1H), 4.16 (s, 3H), 3.04 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 145.51, 142.71, 142.25, 138.19, 136.23, 133.26, 129.87, 128.40, 127.75, 127.54, 121.49, 120.71, 119.56, 113.65, 111.35, 109.48, 32.69, 23.63; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C20H16N3[M+H]+298.133 8, found 298.133 8。

6-苯基-1-甲基-9-(2,3,4,5,6-五氟芐基)-β-咔啉(6o):白色固體,收率92.8%,mp 156.2～156.8 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.60 (d,J=1.6 Hz, 1H), 8.28 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.12 (d,J=4.8 Hz, 1H), 7.92 (dd,J=8.8, 2.0 Hz, 1H), 7.80～7.76 (m, 2H), 7.68 (d,J=8.8 Hz, 1H), 7.52～7.48 (m, 2H), 7.40～7.32 (m, 1H), 6.12 (s, 2H), 2.96 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 146.30 (m), 143.88 (m), 142.20, 141.07, 140.84, 138.87, 136.35 (m), 135.88, 133.12, 129.39, 129.22, 127.90, 127.32, 127.24, 122.13, 120.12, 113.81, 112.29 (m), 111.04, 38.89, 23.56; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C25H16F5N2[M+H]+439.122 8, found 439.122 9。

6-(4-甲氧基苯基)-1-甲基-9-(2,3,4,5,6-五氟芐基)-β-咔啉(6p):白色固體,收率81.3%,mp 154.5～155.3 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.52 (d,J=1.6 Hz, 1H), 8.28 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.12 (d,J=5.2 Hz, 1H), 7.88 (dd,J=8.8, 2.0 Hz, 1H), 7.72 (d,J=8.8 Hz, 2H), 7.64 (d,J=8.8 Hz, 1H), 7.04 (d,J= 8.8 Hz, 2H), 6.12 (s, 2H), 3.80 (s, 3H), 2.96 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 172.46, 158.97, 146.34 (m), 143.83 (m), 142.15, 140.65, 138.77, 136.29 (m), 135.86, 133.25, 132.91, 131.94, 129.17, 128.27, 127.58, 122.11, 119.43, 114.83, 113.77, 112.30 (m), 110.93, 55.63, 23.57, 21.52; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C26H18F5N2O [M+H]+469.133 3, found 469.133 4。

6-(4-(三氟甲氧基)苯基)-1-甲基-9-(2,3,4,5,6-五氟芐基)-β-咔啉(6q):白色固體,收率87.8%,mp 162.8～163.7 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.64 (d,J=2.0 Hz, 1H), 8.32 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.16 (d,J=5.2 Hz, 1H), 7.96～7.88 (m, 3H), 7.72 (d,J=8.8 Hz, 1H), 7.48 (d,J=8.4 Hz, 2H), 6.12 (s, 2H), 2.96 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 147.91, 146.22 (m), 143.85 (m), 142.26, 141.28, 140.23, 138.90, 136.35 (m), 135.90, 131.62, 129.20, 129.02, 127.93, 122.12, 121.95, 120.46, 119.36 (q,J=254.6 Hz), 113.81, 112.23 (m), 111.16, 38.92, 23.51; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C26H15F8N2O [M+H]+523.105 1, found 523.105 5。

6-(4-氟苯基)-1-甲基-9-(2,3,4,5,6-五氟芐基)-β-咔啉(6r):白色固體,收率90.4%,mp 164.4～165.8 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.60 (d,J=2.0 Hz, 1H), 8.28 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.12 (d,J=5.2 Hz, 1H), 7.88 (dd,J=8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.84～7.80 (m, 2H), 7.72 (d,J=8.8 Hz, 1H), 7.64～7.60 (m, 1H), 7.36～7.28 (m, 2H), 6.12 (s, 2H), 2.96 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 160.83 (d,J=242.2 Hz), 146.30 (m), 143.86 (m), 142.21, 141.01, 138.85, 137.31 (d,J=3.2 Hz), 136.34 (m), 135.88, 132.10, 131.99, 131.89, 129.20 (d,J=6.7 Hz), 129.15, 129.07, 127.84, 122.11, 120.11, 116.03 (d,J=21.1 Hz), 113.80, 112.24 (m), 111.05, 38.88, 23.52; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C25H15F6N2[M+H]+457.113 3, found 457.113 3。

6-(4-(三氟甲基)苯基)-1-甲基-9-(2,3,4,5,6-五氟芐基)-β-咔啉(6s):白色固體,收率89.7%,mp 150.6～152.1 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.72 (d,J=2.0 Hz, 1H), 8.32 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.16 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.96 (dd,J=8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.84 (d,J=8.2 Hz, 2H), 7.72～7.64 (m, 1H), 7.60～7.52 (m, 1H), 6.12 (s, 2H), 2.96 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 146.27 (m), 144.81, 143.84 (m), 142.33, 141.60, 139.04, 138.83 (m), 136.35 (m), 135.93, 131.99, 131.89, 131.30, 129.20, 127.98, 127.82, 127.50 (q,J=31.6 Hz), 126.23 (q,J=3.7 Hz), 123.60 (q,J=270 Hz), 122.19, 120.75, 113.83, 112.22 (m), 111.27, 38.93, 23.52; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C26H15F8N2[M+H]+507.110 2, found 507.110 0。

6-(3,4,5-三氟苯基)-1-甲基-9-(2,3,4,5,6-五氟芐基)-β-咔啉(6t):白色固體,收率93.7%,mp 190.8～191.7 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.72 (s, 1H), 8.32 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.12 (d,J=5.2 Hz, 1H), 7.96 (d,J=8.8 Hz, 1H), 7.84～7.80 (m, 2H), 7.72 (d,J=8.8 Hz, 1H), 6.12 (s, 2H), 2.96 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 152.36 (dd,J=9.8, 4.2 Hz), 149.86 (dd,J=9.9, 4.3 Hz), 146.25 (m), 143.80 (m), 142.36, 141.62, 139.07, 137.66 (m), 137.05, 136.35 (m), 135.94, 133.72, 132.70, 132.49 (d,J=2.8 Hz), 131.99 (d,J=9.6 Hz), 129.56, 129.27 (d,J=11.6 Hz), 129.20, 129.15, 127.65, 122.08, 120.62, 113.77, 112.24 (m), 111.45 (dd,J=16.0, 5.4 Hz), 111.16, 38.95, 23.46; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C25H13F8N2[M+H]+493.094 5, found 493.094 7。

6-(4-(甲腈基)苯基)-1-甲基-9-(2,3,4,5,6-五氟芐基)-β-咔啉(6u):白色固體,收率91.6%,mp 235.1～236.7 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.76 (d,J=2.0 Hz, 1H), 8.32 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.16 (d,J=5.2 Hz, 1H), 8.04～8.00 (m, 2H), 7.96～7.92 (m, 2H), 7.72 (d,J=8.8 Hz, 1H), 7.64～7.60 (m, 1H), 6.16 (s, 2H), 2.96 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 145.30, 142.36, 141.80, 139.08, 135.94, 133.30, 132.49 (d,J=2.7 Hz), 131.94 (d,J=9.8 Hz), 130.92, 129.26 (d,J=3.0 Hz), 129.16, 127.98, 127.88, 122.21, 120.95, 119.50, 113.87, 111.36, 109.74, 61.20, 29.67, 23.49; HRMS (ESI),m/Zcalcd for C26H15F5N3[M+H]+464.118 0, found 464.118 2。

1.3 生物活性測試

采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測試了目標化合物對腫瘤細胞株的抑制活性。為增加目標化合物的水溶性,在測試前將化合物制備為鹽酸鹽形式。實驗方法:分別將細胞株以1×104mL-1的濃度接種于96孔板,置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,使其處于對數(shù)生長期。換新鮮培養(yǎng)液,加入滅菌處理的不同濃度梯度的待測樣品,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,每個梯度平行測試3次。以等體積的樣品試劑作為空白對照。每孔加入含5 mg·mL-1MTT的RPMI-1640培養(yǎng)液20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心除去上清液,每孔加入DMSO為100 μL,振蕩溶解沉淀,大約10 min后,用酶標儀檢測OD值,波長490 nm。重復實驗兩次,計算出各濃度測試樣品的細胞存活率,以細胞存活率對藥物濃度對數(shù)作圖,按作圖法求出每個樣品的IC50值[25]。

細胞存活率的計算公式如下:

細胞存活率 (%)=(樣品組平均OD值)×(對照組平均OD值)-1×100%。

1.4 分子對接

采用Open Eye軟件進行分子對接模擬。使用的蛋白晶體結(jié)構(gòu)為VEGFR-2蛋白(ID: 4AGD)、PDGFR-α蛋白(ID: 6JOK)和KIT激酶蛋白(ID: 7KHG),對晶體結(jié)構(gòu)進行去水分、加氫、添加部分電荷及能量最小化處理,并根據(jù)參照配體位置和目標化合物性質(zhì)選定活性口袋位置及大小;采用ChemBioDraw Ultra 14.0 畫出目標化合物的結(jié)構(gòu),使用MMFF94力場進行優(yōu)化,并輸出為mol2格式,隨后使用Omega組件進行構(gòu)象優(yōu)化,Rocs組件進行形狀相似性虛擬篩選,使用Oedcocking組件進行分子對接,并用Vida組件觀察其對接情況,進行結(jié)果分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的合成

將L-色氨酸與乙醛在稀硫酸水溶液中發(fā)生Pictet-Spengler環(huán)化反應得到化合物2,之后通過活性MnO2氧化得到1-甲基-β-咔啉(3)。以N-溴代丁二酰亞胺(NBS)為溴化試劑在其C6位引入溴原子得到中間體4。之后,在無水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中與碘甲烷或2,3,4,5,6-五氟溴芐發(fā)生N9-烷基化反應,獲得關鍵中間體5a、5b。最后將中間體4、5a和5b與7種苯硼酸化合物發(fā)生Suzuki偶聯(lián)得到21種新型6-取代-β-咔啉衍生物(6a-6u),產(chǎn)率為75%～96%。目標化合物均經(jīng)1H NMR、13C NMR和HRMS確證結(jié)構(gòu)。

2.2 體外抗腫瘤活性測定

為了初步評價目標化合物6a-6u的體外抗腫瘤活性,以肺癌細胞A549、胃癌細胞BGC-823、結(jié)腸癌細胞CT-26、肝癌細胞Bel-7402、乳腺癌細胞MCF-7等5種腫瘤細胞為研究對象,采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法對合成的21個目標化合物進行了體外抗腫瘤活性研究,并選取順鉑(DDP)作為陽性對照藥。結(jié)果如表2所示。

表2 目標化合物對5種腫瘤細胞株的抑制活性

體外活性實驗表明,大部分目標化合物均表現(xiàn)出中等程度體外抗腫瘤活性,其中化合物6c、6l-6n對A549細胞系表現(xiàn)出較好的體外抑制活性,其IC50值分別為6.6±0.4 μmol·L-1、9.4±0.4 μmol·L-1、7.7±0.3 μmol·L-1和8.2±0.4 μmol·L-1。化合物6m、6t對BGC-823具有較好的體外抑制活性,其IC50值均低于10 μmol·L-1,且優(yōu)于陽性對照藥物順鉑。對于CT-26,化合物6d具有最優(yōu)的體外抑制活性,其IC50值為4.9±0.1 μmol·L-1,略優(yōu)于順鉑的5.4±0.1 μmol·L-1。而6c、6h和6k等5個化合物的IC50值也低于10 μmol·L-1,顯示出較好的體外抑制活性。對于Bel-7402和MCF-7,整個系列化合物大多顯示出較低的體外抑制活性,所有化合物中只有4個化合物的IC50值低于20 μmol·L-1,其中化合物6t對Bel-7402細胞系的體外抑制活性最優(yōu)為3.9±0.1 μmol·L-1,而化合物6n對MCF-7細胞系的體外抑制活性最優(yōu)為3.4±0.1 μmol·L-1,均優(yōu)于陽性對照藥物。

初步分析化合物對腫瘤細胞體外抑制活性構(gòu)效關系發(fā)現(xiàn),在β-咔啉的C6位引入具有吸電子取代基的苯基(如3,4,5-三氟苯基,6-氰基苯基)有助于提高其抗腫瘤活性;而在β-咔啉N9位引入取代基替代原位的氫原子可增強其對多種癌細胞的抑制活性。

2.3 分子對接研究

為進一步探尋目標化合物各部分結(jié)構(gòu)對抗腫瘤活性的影響,我們對目標化合物進行了分子對接研究。經(jīng)文獻檢索發(fā)現(xiàn)β-咔啉化合物抗腫瘤活性與血管內(nèi)皮生長因子受體VEGFR-2,血小板源性生長因子受體α (PDGFR-α)和KIT絡氨酸激酶[26]有關。采用Open Eye模擬軟件的Docking組件實現(xiàn)了目標化合物與VEGFR-2,PDGFR-α等蛋白的分子對接。所需的VEGFR-2蛋白(ID: 4AGD)、PDGFR-α蛋白(ID: 6JOK)和KIT激酶蛋白(ID: 7KHG)等從RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫獲得。使用默認參數(shù)設置,對目標化合物進行了分子對接研究,對接結(jié)果如表3所示。

表3 目標化合物對3種靶點的分子對接打分

通過化合物與蛋白分子對接研究,獲得了目標化合物與6JOK、7KHG等蛋白的結(jié)合特征。對接結(jié)果顯示多數(shù)化合物對7KHG靶點蛋白表現(xiàn)出良好的結(jié)合能力(對接評分<-10)且優(yōu)于4AGD、6JOK。我們以在活性實驗及分子對接中均表現(xiàn)較為優(yōu)異的化合物6n為例分析其與靶點6JOK、7KHG的結(jié)合情況。如圖4所示?；衔?n位于一個由Val-607、Val-658、Lys-627、Asp-681和Asn-684等氨基酸殘基所組成的疏水性腔袋中,形成較為強烈的疏水性相互作用;化合物6n的苯環(huán)可以與Phe-837的苯環(huán)形成 π-π 相互作用。此相互作用使得6n與6JOK的結(jié)合具有一定的穩(wěn)定性,但化合物分子沒有被很好的包裹于空腔中。

圖4 化合物6n與6JOK的分子對接模擬圖

化合物6n與7KHG的結(jié)合模式如圖5所示?；衔?n位于由Gly-676、Cys-674、Glu-671、Thr-670、Ile-669和Val-668等組成的疏水性腔袋中,能夠形成強烈的疏水相互作用。6n的吲哚苯環(huán)可以與氨基酸殘基Phe-811的苯環(huán)形成 π-π 相互作用,且整個分子可完美的包裹于空腔中。

圖5 化合物6n與7KHG的分子對接模擬圖

對比化合物6n在兩種蛋白中的結(jié)合情況,我們發(fā)現(xiàn)在C6位引入芳基可增強其與靶點蛋白的結(jié)合,從而在抗腫瘤活性中發(fā)揮積極作用。

3 結(jié)論

為了尋找具有良好活性的抗腫瘤先導化合物,本文對1-甲基-β-咔啉的C6位進行結(jié)構(gòu)修飾共得到21個新型6-取代-β-咔啉衍生物,采用MTT法測試了目標化合物 (6a-6u) 對A549、BGC-823、CT-26、Bel-7402和MCF-7的抗腫瘤活性?；钚詳?shù)據(jù)分析表明:大部分化合物對所測試腫瘤細胞系表現(xiàn)出一定的體外抗腫瘤活性(IC50<40 μmol·L-1),其中化合物6c、6l-6n和6t分別對兩種腫瘤細胞系顯示出良好活性,IC50值均小于10 μmol·L-1。同時,我們對目標化合物進行了分子對接,測試了它們對VEGFR-2,PDGFR-α等蛋白的結(jié)合能力,分子對接結(jié)果表明:目標化合物對7KHG靶點具有較優(yōu)的綜合評分,且結(jié)合趨勢與體外抗腫瘤活性實驗結(jié)果相印證,在其C6位引入芳基可增強其與靶點蛋白的結(jié)合,在抗腫瘤活性中發(fā)揮積極作用。構(gòu)效關系結(jié)果表明:在β-咔啉的C6位引入具有吸電子取代基的芳基(如3, 4, 5-三氟苯基, 6-氰基苯基)表現(xiàn)出較高抗胃癌細胞活性;β-咔啉N9位引入取代基替代原位的氫原子對多種癌細胞表現(xiàn)出較高抗腫瘤活性。