婁瑞鑫，吳蘇悅，王思佳，趙保龍，程偉偉

（河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471000）

蛋清蛋白不僅富含人體所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還具有許多的功能特性，如溶解性、凝膠作用等，是一種重要的食品加工原料，作為添加劑和品質(zhì)改良劑廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)中[1]。蛋清是禽蛋的主要成分，雞蛋中蛋清占禽蛋60%~63%，鴨蛋中蛋清占57%。但是蛋清中蛋白質(zhì)含量較低，占13%~15%。蛋清中的蛋白質(zhì)是混合蛋白質(zhì)，其中卵白蛋白占54%，其次為卵傳鐵蛋白等，豐富的蛋白質(zhì)類(lèi)型和含量為凝膠形成提供了基礎(chǔ)[2-3]。這些蛋白質(zhì)含量較高，使蛋清具有很好的凝膠特性，這種特性使得添加蛋清后的食品經(jīng)凝膠化后持水性和膠黏性顯著提高[4]。在蛋清中脂肪、膽固醇等雜質(zhì)少，也有利于形成凝膠[5]。

凝膠在食品中比較常見(jiàn)，是指膠體粒子或高分子溶質(zhì)在連續(xù)相中形成整體的結(jié)構(gòu)而失去流動(dòng)性，或膠體中雖然含有大量液體的介質(zhì)但處于固化的狀態(tài)[6]。而蛋白質(zhì)凝膠的形成是蛋白質(zhì)分子通過(guò)共價(jià)或者非共價(jià)交聯(lián)的聚合，排斥力和吸引力兩力平衡后，形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[2]，其凝膠特性由于是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可以吸附水分、其他物質(zhì)來(lái)改善食品的品質(zhì)和性能，如在加熱形成凝膠的過(guò)程中，可以使水分較多地留存在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，可以提高產(chǎn)品的持水性。凝膠的形成不僅可以改進(jìn)食品品質(zhì)，而且在提高食品的增稠等方面有很多應(yīng)用[7]，如添加到臘腸等肉類(lèi)制品中。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)蛋清蛋白凝膠的研究主要集中在熱誘導(dǎo)和堿誘導(dǎo)方式上，且對(duì)于蛋清蛋白凝膠的研究多是提高其性能，而對(duì)于不同誘導(dǎo)機(jī)制下蛋清蛋白的凝膠化機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。

1 蛋清蛋白凝膠的形成類(lèi)型及誘導(dǎo)方式

根據(jù)蛋清蛋白凝膠外形分類(lèi)，依據(jù)預(yù)凝膠中蛋白質(zhì)分子的變性率和聚集率的關(guān)系，所形成的蛋白質(zhì)的凝膠型可以分為隨機(jī)不透明或透明度低的冷凝物（變性率低于聚集率） 和非常有序的透明度高的透明凝膠（變性率高于聚集率）[8-9]。根據(jù)蛋清蛋白凝膠的不同誘導(dǎo)方式，凝膠可分為熱誘導(dǎo)蛋清蛋白凝膠、堿誘導(dǎo)蛋清蛋白凝膠、乙醇誘導(dǎo)蛋清蛋白凝膠等，不同的誘導(dǎo)方式會(huì)使蛋白質(zhì)形成不同的形態(tài)類(lèi)型和功能特性的凝膠結(jié)構(gòu)，對(duì)于食品生產(chǎn)也有不同的意義。如今，國(guó)內(nèi)外對(duì)蛋清蛋白凝膠的研究主要集中在熱誘導(dǎo)和堿誘導(dǎo)方式上，并且對(duì)于蛋清蛋白凝膠的研究多是提高其凝膠性能，而對(duì)于在不同誘導(dǎo)機(jī)制下蛋清蛋白的凝膠化機(jī)理研究尚未有進(jìn)一步的研究。

1.1 熱誘導(dǎo)蛋清蛋白凝膠的形成過(guò)程

目前，對(duì)熱誘導(dǎo)蛋清蛋白凝膠化機(jī)理的研究相對(duì)成熟，其機(jī)理已在食品加工行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用[10]。熱處理時(shí)立體網(wǎng)絡(luò)凝膠結(jié)構(gòu)的形成要經(jīng)過(guò)預(yù)凝膠、凝膠點(diǎn)、后凝膠3 種狀態(tài)[4]。在溫度大約60 ℃下蛋清蛋白進(jìn)入預(yù)凝膠狀態(tài)[11]，在加熱過(guò)程中其多肽鏈會(huì)展開(kāi)，疏水基團(tuán)和巰基等功能基團(tuán)暴露出來(lái)，基團(tuán)間的疏水作用促使蛋白質(zhì)聚集為質(zhì)量較小的聚集體[12]。到達(dá)凝膠點(diǎn)狀態(tài)時(shí)，在疏水相互作用及靜電作用下質(zhì)量較小的聚集體會(huì)形成較大的聚集體，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度比臨界的凝膠點(diǎn)高時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致凝膠結(jié)構(gòu)的形成[13]。當(dāng)?shù)扒宓鞍滋幱诤竽z狀態(tài)時(shí)，聚集體之間通過(guò)進(jìn)一步反應(yīng)，使凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，同時(shí)能夠穩(wěn)定凝膠中的水分[14]。

在預(yù)凝膠過(guò)程中肽鏈的展開(kāi)程度會(huì)影響凝膠的性狀，當(dāng)肽鏈在蛋白質(zhì)聚集前部分展開(kāi)時(shí)，凝膠表現(xiàn)出硬度低、強(qiáng)度差等特性[4]；當(dāng)完全展開(kāi)時(shí)，由于疏水基團(tuán)和巰基等功能基團(tuán)充分暴露，使得分子間引力更大，從而導(dǎo)致凝集體的結(jié)構(gòu)致密，凝膠表現(xiàn)出強(qiáng)度高等特性。在凝膠點(diǎn)時(shí)，二硫鍵的大量生成使凝膠基質(zhì)更加有序，有利于保持三維凝膠網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定[15]。在后凝膠階段，氫鍵的大量生成對(duì)維持凝膠基質(zhì)的穩(wěn)定至關(guān)重要[2]。

1.2 堿誘導(dǎo)蛋清蛋白凝膠的形成過(guò)程

蛋清在一定的pH 值條件下會(huì)凝固，有學(xué)者對(duì)蛋清蛋白質(zhì)在酸堿條件下凝膠化現(xiàn)象進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)環(huán)境pH 值低于2.3 或高于12.0 時(shí)能夠形成凝膠，當(dāng)pH 值為2.3~12.0 時(shí)不發(fā)生凝膠化現(xiàn)象[16]。張勝善[17]在專(zhuān)著中論述了蛋清蛋白中能在強(qiáng)堿溶液的作用下發(fā)生凝固的是卵清蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，其他組分的蛋白質(zhì)沒(méi)有此性能。我國(guó)傳統(tǒng)蛋制品皮蛋的加工原理正是強(qiáng)堿誘導(dǎo)，所以在研究堿誘導(dǎo)蛋清蛋白凝膠的作用機(jī)制時(shí)一般選擇皮蛋作為研究對(duì)象。

皮蛋在加工過(guò)程中蛋白凝膠的形成要經(jīng)歷化清、凝固、轉(zhuǎn)色、后熟4 個(gè)階段。據(jù)推測(cè)，化清階段，蛋清蛋白在強(qiáng)堿條件下發(fā)生變性，結(jié)合水轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤鞍讖臐夂駹顟B(tài)變?yōu)橄∪芤?，但此時(shí)蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的排列順序、α - 螺旋、β - 折疊等結(jié)構(gòu)未遭到破壞；凝固階段，隨著堿的持續(xù)作用，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞，氫鍵斷裂，形成大量二硫鍵，親水基團(tuán)增加，此時(shí)自由水又轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)合水；轉(zhuǎn)色階段，蛋白質(zhì)氨基酸殘基的排列順序遭到破壞，導(dǎo)致單個(gè)蛋白質(zhì)分子的相對(duì)分子量減少，同時(shí)發(fā)生美拉德反應(yīng)，此階段如果料液中的堿濃度過(guò)大，當(dāng)強(qiáng)堿持續(xù)作用時(shí)二硫鍵易被破壞，導(dǎo)致皮蛋“液化”；后熟階段，全部的蛋清蛋白轉(zhuǎn)變成褐色的半透明凝膠體[8，18]。

現(xiàn)階段關(guān)于堿誘導(dǎo)蛋清蛋白凝膠形成機(jī)制的研究仍然沒(méi)有形成完整的體系，后續(xù)研究仍需對(duì)其形成機(jī)制進(jìn)行完善，為改善食品工業(yè)中利用堿誘導(dǎo)凝膠的工藝提供理論依據(jù)。

1.3 其他因素對(duì)蛋清蛋白凝膠形成的影響

D·惠特福德[19]在專(zhuān)著中表明了超高壓處理對(duì)蛋白質(zhì)氨基酸殘基的排列順序沒(méi)有影響，但對(duì)α - 螺旋、β 折疊結(jié)構(gòu)，以及離子鍵、氫鍵等化學(xué)鍵產(chǎn)生了不同程度的影響，導(dǎo)致蛋清蛋白原始的展開(kāi)狀態(tài)，氫鍵結(jié)合、疏水結(jié)合等非共有結(jié)合變性，最終使蛋清蛋白凝膠的性能發(fā)生改變。Stone A P 等人[20]在研究中發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)添加金屬離子，蛋白質(zhì)的凝膠性和保水性有明顯的提高。乙醇也能對(duì)蛋清蛋白凝膠產(chǎn)生影響。

2 乙醇誘導(dǎo)蛋清蛋白凝膠的作用機(jī)制及影響因素

乙醇誘導(dǎo)蛋清蛋白凝膠的形成與乙醇濃度、溶液pH 值等條件有關(guān)。其中，對(duì)其凝膠形成機(jī)理的研究尚不深入，目前的研究表明，蛋白凝膠的形成主要是分子間二硫鍵、離子鍵、氫鍵及疏水作用的結(jié)果[21-23]。Yu L 等人[24]在對(duì)乙醇誘導(dǎo)蛋清蛋白凝膠形成機(jī)理的研究中，將凝膠樣品溶解于分別代表二硫鍵、離子鍵、氫鍵和疏水作用的4 種變性溶劑中，發(fā)現(xiàn)凝膠在前兩者溶劑中溶解度均最高，約為45%，后兩者溶解度低，分別為5%和4%，從而得出，凝膠形成過(guò)程中，二硫鍵、離子鍵在凝膠形成過(guò)程中起主要作用，二者地位相當(dāng)，氫鍵和疏水作用貢獻(xiàn)較小，但也在過(guò)程中發(fā)揮著不容忽視的作用。

2.1 作用機(jī)制

2.1.1 二硫鍵

卵清蛋白是禽蛋蛋清蛋白中含量最多的一種蛋白質(zhì)，其分子結(jié)構(gòu)中包含一個(gè)二硫鍵和4 個(gè)游離的巰基，這些巰基埋藏在分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)中[2]。為二硫鍵的形成提供了必要條件。Matsudomi N 等人[25]認(rèn)為，卵清蛋白中的游離巰基會(huì)與另一個(gè)二硫鍵發(fā)生反應(yīng)，形成新的二硫鍵。這些新的二硫鍵可能有利于蛋白分子間形成交聯(lián)，從而促使凝膠結(jié)構(gòu)的形成。Zhao Y 等人[26]也在進(jìn)行強(qiáng)堿誘導(dǎo)卵清蛋白凝膠的研究中得出，卵清蛋白中的游離巰基通過(guò)二硫鍵的氧化和交換，在分子間形成二硫鍵，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子的聚集。Yin L 等人[27]發(fā)現(xiàn)凝膠形成的預(yù)凝膠階段中，凝膠黏度逐漸增大，其原因是二硫鍵的形成促進(jìn)凝膠化的進(jìn)程，從而提升凝膠黏度，促進(jìn)凝膠的形成。余琳[28]在對(duì)乙醇誘導(dǎo)蛋清蛋白凝膠分子作用力的研究中，得出二硫鍵在凝膠形成過(guò)程中起主導(dǎo)作用，且其與凝膠的強(qiáng)度密切相關(guān)。

2.1.2 離子鍵

有學(xué)者認(rèn)為，乙醇能夠誘導(dǎo)蛋清蛋白形成凝膠的原因之一是陰陽(yáng)離子靜電吸引，乙醇分子是一種強(qiáng)極性分子，其羥基中的氫原子和氧原子分別帶正電和負(fù)電，分別與蛋白分子中的相反電荷作用，有利于形成更加有序的分子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[22]。現(xiàn)有研究表明，乙醇誘導(dǎo)蛋清蛋白凝膠的形成過(guò)程中，離子鍵同樣在其中起重要作用，促使蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)，從而形成凝膠[24]。

2.1.3 氫鍵

陳復(fù)生等人[22]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，在相同pH 值條件下，乙醇處理的蛋白凝膠樣品相較于無(wú)醇處理的蛋白凝膠樣品，蛋白分子有序結(jié)構(gòu)（α - 螺旋和β - 折疊結(jié)構(gòu)） 比例升高，無(wú)序結(jié)構(gòu)（自然卷曲） 比例降低，其認(rèn)為，乙醇分子中的羥基與蛋白質(zhì)分子形成氫鍵，從而提高了凝膠分子結(jié)構(gòu)的有序性。而Ledward D A[29]認(rèn)為氫鍵主要維持凝膠的形成的因素，且其過(guò)程可逆。Yu L 等人[24]在更進(jìn)一步的研究中，對(duì)乙醇誘導(dǎo)蛋清蛋白凝膠樣品進(jìn)行傅里葉紅外分析，得出氫鍵在凝膠過(guò)程中具有一定的作用，但更長(zhǎng)時(shí)間的乙醇處理后，凝膠的α - 螺旋強(qiáng)度減弱，即氫鍵含量減少；分子內(nèi)β - 折疊強(qiáng)度增強(qiáng)，分子間β -折疊強(qiáng)度減弱，即表明在乙醇作用下，蛋清蛋白質(zhì)分子內(nèi)部折疊更加緊密。即一方面乙醇誘導(dǎo)蛋清凝膠過(guò)程中形成了少量的氫鍵，以維系凝膠結(jié)構(gòu)；另一方面，乙醇也會(huì)使蛋白質(zhì)分子變性聚集，疏水基團(tuán)難以暴露，氫鍵含量減少。

2.1.4 疏水作用

現(xiàn)有研究表明，疏水作用是熱誘導(dǎo)蛋清蛋白凝膠形成過(guò)程中的重要作用之一[26，29]。Mine Y[30]在對(duì)熱誘導(dǎo)蛋清蛋白凝膠的研究中得出，蛋白凝膠的形成主要是由于熱變性導(dǎo)致的蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)暴露，蛋白質(zhì)分子間β - 折疊導(dǎo)致的分子交聯(lián)增多，表現(xiàn)為分子間疏水作用增加。而在對(duì)乙醇誘導(dǎo)蛋清蛋白凝膠的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，疏水作用對(duì)凝膠形成的貢獻(xiàn)較少。Yu L 等人[24]在對(duì)乙醇處理的蛋清蛋白形成的凝膠進(jìn)行Zeta 電位和表面疏水性測(cè)定中得出，隨著處理時(shí)間的增長(zhǎng)，凝膠硬度逐漸增大，Zeta 電位逐漸降低，表面疏水性也呈上升趨勢(shì)，故其認(rèn)為，乙醇的加入有利于降低水介質(zhì)的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)分子內(nèi)部與分子間的靜電排斥增大，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子充分展開(kāi)，促使更多疏水氨基酸暴露，從而有利于凝膠的形成。

2.2 影響因素

2.2.1 體積分?jǐn)?shù)

普遍認(rèn)為，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，蛋清凝膠的穩(wěn)定性逐漸提高。Li Y 等人[31]在試驗(yàn)中，對(duì)體積分?jǐn)?shù)0~45 mL/100 mL 的乙醇誘導(dǎo)蛋清蛋白凝膠的凝膠形態(tài)進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，溶液由膠體轉(zhuǎn)變?yōu)閼腋∫?，?dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增加到35~45 mL/100 mL 時(shí)，蛋白質(zhì)分子聚合形成凝膠，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)持續(xù)增大后，溶液出現(xiàn)沉淀。

2.2.2 pH 值

蛋白質(zhì)形成凝膠過(guò)程中，pH 值的變化會(huì)影響蛋白質(zhì)分子的離子化作用與靜電荷值，而改變分子間的吸引力與排斥力和蛋白質(zhì)分子水合能力，從而影響凝膠的穩(wěn)定性[32]。目前普遍認(rèn)為，在一定范圍內(nèi)，溶液pH 值越高，凝膠穩(wěn)定性也越好。Heertje I[33]認(rèn)為，在溶液pH 值遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子間的靜電排斥力增強(qiáng)，從而使凝膠更加穩(wěn)定。李俐鑫等人[34]通過(guò)分別測(cè)定溶液pH 值3~12 時(shí)蛋清蛋白凝膠硬度的變化，得出pH 值接近7 是凝膠硬度最小，pH 值遠(yuǎn)離7 時(shí)硬度呈增大趨勢(shì)，即遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pH 環(huán)境有利于凝膠的穩(wěn)定。

3 結(jié)語(yǔ)

與堿誘導(dǎo)、熱誘導(dǎo)蛋清蛋白凝膠類(lèi)似，乙醇處理蛋清蛋白形成凝膠的機(jī)理也主要為二硫鍵、離子鍵、氫鍵和疏水作用等分子間作用力導(dǎo)致的蛋白質(zhì)分子交聯(lián)，有序二級(jí)結(jié)構(gòu)增多，從而形成較為穩(wěn)定的蛋白凝膠。與前兩者不同的是，乙醇誘導(dǎo)凝膠形成的過(guò)程中，二硫鍵和離子鍵在其中占主導(dǎo)作用，氫鍵和疏水作用參與較少。目前，關(guān)于乙醇誘導(dǎo)蛋清蛋白凝膠機(jī)制的研究方法仍較單一，其更深層次的作用機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。后續(xù)可在完善乙醇誘導(dǎo)蛋清凝膠形成機(jī)理的基礎(chǔ)上，采用更多樣的試驗(yàn)方法，進(jìn)一步探究二硫鍵、離子鍵等作用力在維持凝膠形成過(guò)程中所發(fā)揮的作用，或?qū)⒛z機(jī)理的理論研究與產(chǎn)品生產(chǎn)相結(jié)合，以期為相關(guān)食品生產(chǎn)工藝改良提供理論依據(jù)。