郭嚴(yán)冬 周義峰 鄭玉紅 張明霞 廖恩慧 曹建國*

（1.江蘇省中國科學(xué)院植物研究所（南京中山植物園），南京 210014； 2.上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200234）

蕨類植物演化地位特殊，既是高等的孢子植物，又是低等的維管植物，同時具有孢子體和配子體2個世代，且均能獨(dú)立存活，在植物界獨(dú)有，是研究植物進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育的重要材料。中國蕨類植物資源豐富，其在食用、藥用和環(huán)境指示等多個方面均有應(yīng)用，且部分蕨類植物因其自身的特殊性具有重要的研究價值［1］。但由于自然生態(tài)環(huán)境的破壞、不合理開發(fā)利用，以及孢子自身壽命短、難萌發(fā)等問題，一些珍貴、稀有的野生蕨類植物資源已經(jīng)瀕臨滅絕［2］。加強(qiáng)相關(guān)的繁殖技術(shù)的基礎(chǔ)研究，對蕨類植物種質(zhì)資源的利用和保護(hù)具有重要價值和現(xiàn)實意義。

水蕨（Ceratopteris thalictroides）是鳳尾蕨科（Pteridaceae）水蕨屬（Ceratopteris）植物，既是蕨類模式植物又是國家二級重點保護(hù)野生植物。水蕨在濕地生態(tài)、湖泊生態(tài)和水生景觀生態(tài)中起著重要的作用，同時水蕨具有重要的觀賞價值和藥用價值［3］。已有研究結(jié)果表明，孢子本身的萌發(fā)力，培養(yǎng)基中的礦質(zhì)營養(yǎng)［4］、糖類［5］、生長介質(zhì)［6-7］和特殊化學(xué)物質(zhì)［8-9］，以及培養(yǎng)條件［10-11］等因素都會影響孢子的萌發(fā)。例如：陸鎮(zhèn)威［8］研究發(fā)現(xiàn)，納米銀顯著影響水蕨孢子的萌發(fā)率和性別分化，隨著納米銀濃度的增加，水蕨孢子的萌發(fā)率和雌雄同體配子體所占配子體的比例顯著降低，而雄配子體沒有受到顯著影響。由此可見，在培養(yǎng)基中添加不同種類的外源物質(zhì)會對水蕨萌發(fā)產(chǎn)生不同的影響。

多壁碳納米管作為一維納米材料，其徑向尺寸小，具有極高的強(qiáng)度和極大的韌性，同時具有優(yōu)異的電學(xué)和化學(xué)性能，被認(rèn)為是未來的“超級纖維”。近些年隨著多壁碳納米管及納米材料研究的深入，其廣闊的應(yīng)用前景也不斷地展現(xiàn)出來。鄭玉紅等［12］利用碳納米管的抗菌作用和特殊的化學(xué)性能進(jìn)行了白芨（Bletilla striata）組培快繁，降低了污染率，提高了繁殖效率，并減少組培苗對植物生長調(diào)節(jié)劑的依賴，從而縮短組培苗移栽后的緩苗期，提高移栽的成活率，縮短白芨成苗的周期。目前，碳納米管在蕨類植物中的應(yīng)用較少，研究尚不深入，石雷等［13］在桫欏（Alsophila spinulosa）孢子萌發(fā)過程中添加了多壁碳納米管，結(jié)果表明：多壁碳納米管對桫欏孢子萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用，節(jié)約了萌發(fā)時間，但研究僅至絲狀體階段，對于后續(xù)的片狀體、配子體等并未有一個完整世代的研究，且碳納米管的添加對于性器官的形成是否有影響也并未明確。這些問題均有待深入研究。本研究以蕨類模式植物水蕨為供試材料，設(shè)置不同質(zhì)量濃度的多壁碳納米管處理，觀察對水蕨配子體發(fā)育和孢子體產(chǎn)生的影響，以期明確碳納米管在蕨類植物組織培養(yǎng)中的作用，為瀕危蕨類植物的保護(hù)和繁育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為水蕨孢子，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)3%NaClO3消毒1 次，12 000 r·min-1離心2 min，雙蒸水清洗3次（12 000 r·min-1離心，每次2 min）后用雙蒸水浸泡過夜、備用。供試基本培養(yǎng)基為1/2MS+6.5 g·L-1瓊脂。供試多壁碳納米管為1 mg·mL-1多壁碳納米管母液（實驗室自配），供試1/2MS 培養(yǎng)基（不含糖和瓊脂）購自青島捷世康生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配置

稱取4.94 g 1/2MS和13.00 g瓊脂粉溶于水中，加入2 mL 植物組培抗菌劑（Plant Preservative Mixture，PPM，購自美國Plant Cell Technology 公司），定容至2 L。設(shè)置多壁碳納米管質(zhì)量濃度分別為0（對照）、0.5、1.0、2.5、5.0 mg·L-15 個處理組。取1 mg·mL-1多壁碳納米管母液分別按照設(shè)置的梯度加入上述配置好的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH 至5.8，加熱溶解至無顆粒。每個處理組5個培養(yǎng)瓶，放于高壓蒸汽滅菌鍋滅菌，冷卻后備用。

1.2.2 接種和發(fā)育情況觀察

將上述孢子懸浮液接種至添加了不同質(zhì)量濃度多壁碳納米管的培養(yǎng)基，每個處理組接種5瓶。置于25 ℃、光照時間18 h·d-1、光照強(qiáng)度100～300 μmol·m-2·s-1條件下培養(yǎng)，每天觀察孢子萌發(fā)情況，使用Mshot 生物顯微鏡（MS60，廣州）和明美體式顯微鏡（MZ62，廣州）拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 對水蕨配子體發(fā)育及孢子體產(chǎn)生的影響

在多壁碳納米管對照組中，培養(yǎng)15 d 后觀察到大部分孢子還未萌發(fā)（圖版Ⅰ：A1），僅少量孢子的外壁開裂，或有數(shù)個細(xì)胞和假根伸出孢子壁（圖版Ⅰ：A2）；培養(yǎng)19 d后產(chǎn)生片狀體，片狀體上有精子器（圖版Ⅰ：A3）；培養(yǎng)32 d后片狀體發(fā)育為原葉體，且原葉體上有頸卵器產(chǎn)生（圖版Ⅰ：A4）；培養(yǎng)至41 d，部分原葉體上已經(jīng)完成有性生殖，產(chǎn)生孢子體（圖版Ⅰ：A5），進(jìn)入孢子體世代。

在0.5 mg·L-1多壁碳納米管處理組中，培養(yǎng)7 d后觀察到孢子已發(fā)育為片狀體（圖版Ⅰ：B1）；培養(yǎng)15 d 后片狀體上產(chǎn)生精子器（圖版Ⅰ：B2）；培養(yǎng)19 d 后片狀體發(fā)育為原葉體，且原葉體上有頸卵器產(chǎn)生（圖版Ⅰ：B3）；培養(yǎng)至32 d，頸卵器數(shù)量增多（圖版Ⅰ：B4），部分原葉體上已經(jīng)完成有性生殖，產(chǎn)生孢子體（圖版Ⅰ：B5），進(jìn)入孢子體世代。

在1.0 mg·L-1多壁碳納米管處理組中，培養(yǎng)7 d后觀察到孢子已發(fā)育為片狀體（圖版Ⅰ：C1）；培養(yǎng)15 d 后片狀體上產(chǎn)生精子器（圖版Ⅰ：C2）；培養(yǎng)19 d 后片狀體發(fā)育為原葉體，且原葉體上有頸卵器產(chǎn)生（圖版Ⅰ：C3）；培養(yǎng)至32 d，頸卵器數(shù)量增多，部分原葉體在生長點附近發(fā)生營養(yǎng)生長，產(chǎn)生小的片狀體（圖版Ⅰ：C4）；培養(yǎng)至41 d原葉體上產(chǎn)生孢子體，進(jìn)入孢子體世代（圖版Ⅰ：C5）。

在2.5 mg·L-1多壁碳納米管處理組中，培養(yǎng)7 d后觀察到孢子萌發(fā)，產(chǎn)生由數(shù)個細(xì)胞組成的絲狀體（圖版Ⅰ：D1）；培養(yǎng)12 d 后絲狀體發(fā)育為片狀體，且片狀體上產(chǎn)生數(shù)量較多的精子器（圖版Ⅰ：D2）；培養(yǎng)15 d 后片狀體發(fā)育為原葉體（圖版Ⅰ：D3）；培養(yǎng)19 d 后原葉體上產(chǎn)生頸卵器，體積較大（圖版Ⅰ：D4）；培養(yǎng)至32 d，頸卵器數(shù)量增多，部分原葉體在生長點附近發(fā)生營養(yǎng)生長，產(chǎn)生小的片狀體（圖版Ⅰ：D5）；培養(yǎng)至41 d原葉體上產(chǎn)生孢子體，進(jìn)入孢子體世代（圖版Ⅰ：D6）。

在5.0 mg·L-1多壁碳納米管處理組中，培養(yǎng)9 d后觀察到有少量孢子出現(xiàn)假根伸出孢子壁（圖版Ⅰ：E1）；培養(yǎng)16 d 后產(chǎn)生片狀體（圖版Ⅰ：E2）；培養(yǎng)18 d后片狀體上有精子器（圖版Ⅰ：E3）；培養(yǎng)至28 d，大部分配子體仍處于片狀體階段（圖版Ⅰ：E4），偶有部分原葉體上已經(jīng)完成有性生殖，產(chǎn)生孢子體（圖版Ⅰ：E5），進(jìn)入孢子體世代。

此外，總體上看，多壁碳納米管的質(zhì)量濃度越高，精子器產(chǎn)生的時期越早，在幼片狀體時期就產(chǎn)生數(shù)量較多精子器的配子體為雄配子體，后期不會出現(xiàn)雌雄同株的現(xiàn)象；且高質(zhì)量濃度多壁碳納米管處理會導(dǎo)致部分配子體在片狀體階段就出現(xiàn)衰退現(xiàn)象，精子器退化，細(xì)胞中葉綠體出現(xiàn)失綠現(xiàn)象（圖版Ⅰ：E4），部分發(fā)育出的孢子體上的細(xì)胞也出現(xiàn)失綠等衰退現(xiàn)象（圖版Ⅰ：E5）。

2.2 對水蕨配子體發(fā)育及孢子體產(chǎn)生的影響效果

對多壁碳納米管對水蕨的整體影響效果進(jìn)行進(jìn)一步總結(jié)，結(jié)果如表1 所示：與對照組相比，0.5 mg·L-1多壁碳納米管對水蕨孢子萌發(fā)的促進(jìn)效果最好，1.0～2.5 mg·L-1多壁碳納米管的促進(jìn)效果次之，5.0 mg·L-1多壁碳納米管的促進(jìn)效果較弱。0.5～1.5 mg·L-1多壁碳納米管對絲狀體和片狀體產(chǎn)生的促進(jìn)效果最好，2.5 mg·L-1多壁碳納米管的促進(jìn)效果次之，5.0 mg·L-1多壁碳納米管的促進(jìn)效果較弱。2.5 mg·L-1多壁碳納米管對原葉體和孢子體產(chǎn)生的促進(jìn)效果最好，0.5～1.5 mg·L-1多壁碳納米管的促進(jìn)效果次之，而5.0 mg·L-1多壁碳納米管對原葉體和孢子體產(chǎn)生有一定的抑制作用。間［14］。本研究中，對照組水蕨孢子培養(yǎng)至15 d 時，大部分孢子仍未萌發(fā)。造成這種差異的原因除了培養(yǎng)條件有差異以外，主要原因可能是使用的培養(yǎng)基不同，戴錫玲等［14］使用的是改良Knop’s 培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基在MS 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入了Ca、K、

表1 不同質(zhì)量濃度多壁碳納米管對水蕨配子體發(fā)育及孢子體產(chǎn)生的影響Table 1 Comparison of gametophyte development and sporophyte production in water fern with different mass concentrations of multi-walled carbon nanotubes

圖版Ⅰ 多壁碳納米管對水蕨配子體發(fā)育及孢子體產(chǎn)生的影響A1～A5.分別是對照組水蕨孢子培養(yǎng)15、15、19、32、41 d 的萌發(fā)情況；B1～B5.分別是0.5 mg·L-1多壁碳納米管處理組水蕨孢子培養(yǎng)7、15、19、32、32 d 的萌發(fā)情況；C1～C5.分別是1.0 mg·L-1多壁碳納米管處理組水蕨孢子培養(yǎng)7、15、19、32、41 d 的萌發(fā)情況；D1～D6.分別是2.5 mg·L-1多壁碳納米管處理組水蕨孢子培養(yǎng)7、12、15、19、32、41 d的萌發(fā)情況；E1～E5.分別是5.0 mg·L-1多壁碳納米管處理組水蕨孢子培養(yǎng)9、16、18、28、28 d的萌發(fā)情況；An.精子器；Ar.頸卵器；Sp.孢子體；PV.營養(yǎng)生殖產(chǎn)生的片狀體。PlateⅠ Effects of multi-walled carbon nanotubes on gametophyte development and sporophyte production of C. thalictroide（sL.） Brongn A1-A5.The spore germination of the control group was cultured for 15，15，19，32 and 41 d，respectively；B1-B5.The spore germination of 0.5 mg·L-1 multi-walled carbon nanotube treated group was cultured for 7，15，19，32 and 32 d，respectively；C1-C5.The spore germination of 1.0 mg·L-1 multi-walled carbon nanotube treated group was cultured for 7，15，19，32 and 41 d，respectively；D1-D6.The spore germination of 2.5 mg·L-1 multi-walled carbon nanotube treated group was cultured for 7，12，15，19，32 and 41 d，respectively；E1-E5.The spore germination of 5.0 mg·L-1 multi-walled carbon nanotube treated group was cultured for 9，16，18，28 and 28 d，respectively；An.Antheridium；Ar.Archegonium；Sp.Sporophyte；PV.Plate produced by vegetative reproduction.

3 討論

早期在對水蕨配子體發(fā)育的研究中發(fā)現(xiàn)，水蕨在4～5 d 可以萌發(fā)，6～7 d 形成絲狀體，2～3 周出現(xiàn)性器官，但未提及片狀體和原葉體出現(xiàn)的時Mg和Fe等營養(yǎng)元素，有利于蕨類孢子發(fā)育。但本研究中0.5～1.0 mg·L-1多壁碳納米管處理組中的孢子萌發(fā)較快，絲狀體階段很短，培養(yǎng)7 d 就可以發(fā)育至片狀體階段，比對照組孢子萌發(fā)提前約15 d，且性器官出現(xiàn)的時間也較早，培養(yǎng)15 d 后就出現(xiàn)數(shù)量較多的精子器，培養(yǎng)19 d 頸卵器出現(xiàn)，說明多壁碳納米管處理可以有效促進(jìn)水蕨孢子萌發(fā)和配子體發(fā)育。同時也側(cè)面說明，與培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件相比，添加外源物質(zhì)對水蕨配子體發(fā)育影響更大。這可能依賴于碳納米管自身較大的比表面積及碳管之間較強(qiáng)的作用力等優(yōu)良性能［15］。

本研究中，水蕨培養(yǎng)適宜的多壁碳納米管質(zhì)量濃度為0.5～2.5 mg·L-1。而在多壁碳納米管對中華桫欏（Alsophila costularis）和椒樣薄荷（Mentha×piperita）離體培養(yǎng)的研究中，發(fā)現(xiàn)100 mg·L-1質(zhì)量濃度以下的多壁碳納米管處理后，中華桫欏孢子萌發(fā)縮短了4 d，75 mg·L-1以上質(zhì)量濃度的處理會導(dǎo)致假根扭曲和膨大，50 mg·L-1多壁碳納米管是促進(jìn)中華桫欏孢子在離體條件下萌發(fā)的最適質(zhì)量濃度，而椒樣薄荷最佳培養(yǎng)基中多壁碳納米管的質(zhì)量濃度為100 mg·L-1［16］。上述研究結(jié)果表明不同物種適宜的多壁碳納米管濃度存在差異，這種種間差異也反映了植物對環(huán)境的適應(yīng)性［17-18］。但不同物種均會出現(xiàn)“高濃度抑制”的現(xiàn)象，5.0 mg·L-1多壁碳納米管處理會使部分水蕨配子體在發(fā)育過程中出現(xiàn)衰退現(xiàn)象，這在植物中是普遍現(xiàn)象，這是因為過高濃度外源物質(zhì)的添加對植物的酶活性和細(xì)胞結(jié)構(gòu)等產(chǎn)生了復(fù)雜的影響［19-20］。李佳慧［21］的研究發(fā)現(xiàn)，25 mg·L-1碳納米管對幼苗生長具有較好的促進(jìn)效果，而50 mg·L-1的碳納米管對幼苗生根的促進(jìn)作用明顯。本研究中0.5～1.0 mg·L-1多壁碳納米管處理在水蕨片狀體階段前促進(jìn)效果最為明顯，2.5 mg·L-1多壁碳納米管處理在片狀體階段以后促進(jìn)效果較為明顯。說明在實際應(yīng)用過程中應(yīng)根據(jù)具體的需要選擇相應(yīng)的添加量。

相關(guān)研究［22］表明，水蕨配子體有雌雄同株和雌雄異株之分，戴錫玲等［14］在水蕨常規(guī)培養(yǎng)中未觀察到雄配子體。本研究觀察到，在各處理組的片狀體階段就產(chǎn)生較多精子器的配子體一般后期會發(fā)育為雄配子體，且質(zhì)量濃度較高的多壁碳納米管處理會使片狀體發(fā)生畸形，通常這類配子體上的精子器數(shù)量較多。這可能是由于多壁碳納米管的加入使細(xì)胞的導(dǎo)水、導(dǎo)熱等能力發(fā)生改變，部分孢子在有限資源環(huán)境中會為了增加生殖行為成功的幾率，形成雄配子體，促進(jìn)配子體之間的雜交，保證遺傳的多樣性［23］。

綜上所述，0.5～2.5 mg·L-1多壁碳納米管處理可以明顯促進(jìn)水蕨配子體發(fā)育和孢子體的產(chǎn)生，且精子器數(shù)量明顯增多。0.5～2.5 mg·L-1多壁碳納米管處理可使水蕨孢子萌發(fā)提前約15 d，其中，0.5～1.0 mg·L-1多壁碳納米管處理在片狀體階段前促進(jìn)效果最為明顯，2.5 mg·L-1多壁碳納米管處理在片狀體階段以后促進(jìn)效果較為明顯。高質(zhì)量濃度（5.0 mg·L-1）多壁碳納米管處理會使水蕨配子體發(fā)育出現(xiàn)“高濃度抑制”現(xiàn)象。建議根據(jù)實際研究目的或生產(chǎn)需要選擇多壁碳納米管質(zhì)量濃度。