史紅安,王燕翎,仇小艷*,李夢波,張志林

(1.湖北工程學院 特色果蔬質量安全控制湖北省重點實驗室,湖北 孝感 432000;2.湖北工程學院 生命科學技術學院,湖北 孝感 432000;3.湖北工程學院新技術學院,湖北 孝感 432000)

白腐真菌(Phaeophlebiopsissp.)屬于擔子菌門多孔菌目的真菌,能產生降解木質素的木質纖維素降解酶[1],破壞植物細胞組織,從而造成樹木木質部組織腐爛,使得木材結構遭到破壞[2-4],導致其硬度、強度、可使用性降低甚至喪失。木材的腐朽大多數是由真菌引起的,木材成白色腐朽的稱為白腐菌。不同的木材腐朽菌生理特性存在差異,分泌的酶及其活性也具有差異,從而導致其分解木材的相對速度不相同[5]。目前防治木材腐爛的最佳方法是化學防治,利用季銨銅(ACQ)、銅鉻砷(CCA)進行防腐,以及利用廣譜型農藥殺菌劑進行抑菌[6-7],但由于化學防治方法引起的負面生態(tài)影響越來越受到大眾關注,因此,尋找一種綠色、有效、科學的防治方法對白腐真菌的防治具有重要意義。

萜類化合物是天然植物化學物質中的最大類別,廣泛存在于自然界,具有揮發(fā)性和較強的香氣,還具有抗氧化、抗菌、抗炎等生理活性,是醫(yī)藥、食品和化妝品工業(yè)的重要原料[8-9]。近年來,其被廣泛應用于植物病原菌抑菌中,具有較好的抑菌效果。本文實驗研究白腐真菌的生物學特性,篩選能抑制白腐真菌的萜類化合物,以期為白腐真菌的生物防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

白腐真菌(Phaeophlebiopsissp.)由特色果蔬質量安全控制湖北省重點實驗室提供。

1.2 主要試劑及儀器

瓊脂、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、木糖、可溶性淀粉、葡萄糖、D-半乳糖、蛋白胨、甘氨酸、牛肉膏、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨等均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。儀錐形瓶、培養(yǎng)皿、移液槍、打孔器(6 mm),智能霉菌培養(yǎng)箱(武漢-恒蘇凈科學儀器有限公司)、立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器(合肥華泰醫(yī)療設備有限公司)、電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)、EL204電子天平(梅特勒-托利多儀器)、雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)。

1.3 白腐真菌的生物學特性

1.3.1 培養(yǎng)基對白腐真菌落生長的影響

將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后的白腐真菌菌餅(6 mm),分別接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)、燕麥片瓊膠培養(yǎng)基(OA)、沙氏瓊脂培養(yǎng)基(SDA)、瓊脂培養(yǎng)基(WA)及查氏培養(yǎng)(Czapek)培養(yǎng)基上,每個處理3次重復,置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后,采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.3.2 不同碳源對白腐真菌落生長的影響

以Czapek培養(yǎng)基為基礎,按相同比例分別加入等質量的甘露醇、木糖、可溶性淀粉、葡萄糖、D-半乳糖和乳糖代替葡萄糖作為碳源,以Czapek培養(yǎng)基為對照,將菌餅(6 mm)接種于培養(yǎng)基平板上,每個處理3次重復,置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后,采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.3.3 不同氮源對白腐真菌落生長的影響

以Czapek培養(yǎng)基為基礎,按相同比例分別加入等質量蛋白胨、甘氨酸、牛肉膏、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨等6種碳源代替NaNO3,將菌餅(6 mm)接種于培養(yǎng)基平板上,每個處理重復3次,置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后,采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.3.4 不同溫度對白腐真菌落生長的影響

將菌餅(6 mm)接種至PDA培養(yǎng)基后,分別置于5、10、15、20、30、35、40 ℃溫度下培養(yǎng)5 d后,采用十字交叉法測量菌落直徑,每個處理3次重復。

1.3.5 不同pH值對白腐真菌落生長的影響

將PDA培養(yǎng)基的pH分別設置為6、7、8、9、10、11,將菌餅(6 mm)接種至不同pH值的PDA培養(yǎng)基上后,置于28 ℃培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d,測量菌落直徑,每個處理重復3次。

1.3.6 致死溫度對白腐真菌落生長的影響

將菌餅(6 mm)移至無菌EP管中,加入2 mL無菌水后分別置于溫度為44、45、46、47、48、49、50、51、52 ℃的水浴鍋中水浴10 min后,即刻放入冰水中冷卻,后將其移至PDA培養(yǎng)基上,置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)觀察菌落生長狀況,每個處理3次重復。

1.4 萜類化合物對白腐真菌的抑菌活性

1.4.1 萜類化合物的篩選

采用菌絲生長速率法測定單萜類化合物對白腐真菌的抑菌活性,在冷卻至50 ℃左右的PDA培養(yǎng)基(100 mL)中分別加入100 μL化合物(葑酮(Fenchone)、月桂烯(Myrcene)、1,8-桉葉素(1,8-Cineole)、異丙基甲苯(p-Cymene)、β-香茅醇(β-citronellol)、乙酸橙花酯(Neryl acetate)混勻后,倒入培養(yǎng)皿中,配成濃度為1 μL/mL的含藥平板。將菌餅(6 mm)接種至含藥平板上,以未加精油的PDA為空白對照,3次重復。在28 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng),待對照長滿后,采用十字交叉法測量菌落直徑,計算萜類化合物對白腐真菌的抑菌率。

抑制率(%)=(D1-D2)/(D1-D)×100%

式中:D1=對照菌落直徑(mm),D2=處理菌落直徑(mm),D=菌餅直徑(mm)。

1.4.2 對篩選出的萜類化合物進行不同濃度梯度活性測定

將1.4.1測定的抑菌率大于50%的化合物進行不同濃度梯度活性測定,濃度梯度根據抑菌效果決定,實驗方法同1.4.1。

1.5 數據分析

本文實驗數據均采用SPSS 19.0軟件進行數據分析,差異顯著性分析采用Duncan’s檢驗(P< 0.05)。

2 結果與分析

2.1 病原菌生物學特性

2.1.1 培養(yǎng)基對白腐真菌菌落生長的影響

不同培養(yǎng)基對白腐真菌菌落生長影響測定結果表明,白腐真菌在6種培養(yǎng)基上均能正常生長,其中PDA培養(yǎng)基生長速度最快,72 h后明顯高于其他培養(yǎng)基,其次為PSA、OA和Czapek培養(yǎng)基,生長最慢的為SDA和WA培養(yǎng)基(見圖1)。

2.1.2 不同碳源對白腐真菌落生長的影響

不同碳源對白腐真菌落生長的影響測定結果表明,白腐真菌在7種碳源上均能生長,以甘露醇為碳源生長最快,生長速率可達8.28 mm/d,其次為木糖醇、可溶性淀粉、葡萄糖、D-半乳糖,以乳糖為碳源生長最慢,生長速率僅為1.34 mm/d(見圖2)。

2.1.3 不同氮源對白腐真菌落生長的影響

不同氮源對白腐真菌落生長的影響測定結果表明,不同氮源對白腐真菌落生長影響差異較為顯著,以牛肉膏為氮源時生長最快,生長速率可達13.70 mm/d,蛋白胨和甘氨酸次之,在以氯化銨、硫酸銨和硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基上不生長,表明氯化銨、硫酸銨和硝酸銨不適合白腐真菌菌落生長(見圖3)。

圖3 不同氮源對白腐真菌落生長的影響

2.1.4 不同溫度對白腐真菌落生長的影響

溫度為5 ℃時,白腐真菌菌落不能正常生長,溫度為10 ～ 35 ℃時菌落能正常生長,當溫度達到40 ℃,白腐真菌停止生長。該病原菌在35 ℃時菌落直徑最大、菌絲最厚,在25 ～ 35 ℃能比較好地生長,菌落生長直徑差距很大,當溫度上升到20 ℃以上時,該病原菌的生長速度顯著增加(見圖4)。

圖4 不同溫度下菌落的生長狀況

2.1.5 致死溫度對白腐真菌落生長的影響

由表1可知,白腐真菌絲在44、45、46、47、48、49、50 ℃水浴處理10 min后菌落皆能生長,但在51 ℃以上水浴處理10 min后不生長,因此該菌的致死溫度為51 ℃處理10 min。

表1 不同濃度梯度抑菌結果

2.1.6 不同pH值對白腐真菌落生長的影響

菌落在pH為6 ～ 11時均能正常生長,在pH為6時菌落生長優(yōu)于其他,當pH升高時對菌落生長具有一定影響,菌落直徑隨著pH的升高而減小,當pH為11時菌落直徑為42.79 mm,表明白腐真菌對pH偏堿的環(huán)境較為敏感(見圖5)。

圖5 不同pH值對白腐真菌落生長的影響

2.2 萜類化合物的抑菌活性測定

2.2.1 萜類化合物的抑菌活性篩選

以菌絲生長速率法測定6種萜類化合物對白腐真菌的抑制作用,結果表明β-香茅醇和乙酸橙花酯對白腐真菌具有較好的抑菌效果,葑酮、月桂烯、1,8-桉葉素和異丙基甲苯對白腐真菌不具有抑菌效果(見圖6)。

A:對照;B:葑酮;C:月桂烯;D:1,8-桉葉素;E:對-聚傘花素;F:β-香茅醇;G:乙酸橙花酯

2.2.2 不同用量萜類化合物對白腐真菌的防治效果

由表2可知,β-香茅醇、乙酸橙花酯隨著濃度逐漸增加,對白腐真菌的抑菌效果增強,β-香茅醇濃度為45 μL/mL時,對白腐真菌的抑菌率已達84.10%;乙酸橙花酯的濃度為90 μL/mL時,抑菌率達82.00%。

表2 不同用量萜類化合物對白腐真菌的防治效果

3 結果與討論

實驗結果表明,白腐真菌在PDA培養(yǎng)基上菌落生長最佳,菌絲最厚,菌落顏色較深;碳源以甘露醇,氮源以牛肉膏最適合菌落生長。病原菌能利用硝酸鈉,但無法利用氯化銨、硫酸銨、硝酸銨,大部分真菌菌能利用氯化銨、硫酸銨和硝酸銨,而氯化銨、硫酸銨和硝酸銨能有效抑制白腐真菌的生長。這與朱意潔[10]對楊樹濕心材致病菌生物學特性的研究結果相似,木材病原菌均不能利用硫酸銨和硝酸銨生長。而董文統(tǒng)[11]發(fā)現降香黃檀炭疽病病原菌能以酵母膏、蛋白陳、尿素、組氨酸、甘氨酸、氯化銨、硝酸鉀作為氮源。其原因與病原菌危害木材主要部位不同有關,白腐真菌與楊樹濕心材致病菌直接危害木材主干部位,而炭疽病病原菌主要危害降香黃檀樹葉、枝條等部位。白腐真菌生長最適溫度為35 ℃,與大部分真菌最適生長溫度不同,大部分真菌最適生長溫度為28 ℃[12],本文研究結果與張雨[13]對木材藍變菌中桔綠木霉菌的研究結果相似,桔綠木霉菌在35 ℃ 時生長迅速,產孢量較高,表明白腐真菌能適應高溫,在高溫季節(jié)更易生長發(fā)病,危害木材生長。

萜類化合物被廣泛應用于病原菌抑菌中[14-15],且抑菌效果顯著。β-香茅醇、乙酸橙花酯對白腐真菌均具有良好的抑菌活性,β-香茅醇濃度為45 μL/mL時,對白腐真菌的抑菌率已達84.1%,而乙酸橙花酯的濃度為90 μL/mL時對白腐真菌的抑菌率達82%。楊冬梅等[16]利用肉桂醛及其衍生物對白腐真菌進行抑菌效果研究,結果表明,肉桂酸濃度為10 g/L、肉桂醛在20 g/L時可達到Ⅱ級耐腐,均表現出較強的抑菌性能,肉桂醛及其衍生物表現出對木材很好的保護作用,且環(huán)境友好,可廣泛應用。胡拉等[17]選用了19種植物精油6種木材霉變菌進行抑菌,結果表明,肉桂、丁香花和百里香精油的綜合抑菌效力最高,抑菌效力均達到100%。

白腐真菌能產生降解木質素的木質纖維素降解酶,可用于降解特殊生物質中的木質纖維素,而萜類化合物廣泛存在于天然植物中,在利用白腐真菌進行木質素降解時,要考慮萜類化合物的存在對白腐真菌的影響。本文試驗對白腐真菌的生物學特性及防治應用進行初步研究,目的是利用生物手段對木材腐朽進行防治,以減少化學物質的使用,擴大了萜類化合物的使用范圍,為白腐真菌的生物防治提供了理論依據。