許 嶸 歐陽超群 丁小明 張文州 陳琳琳 謝志新 林陽君 唐生安 潘 杰

①泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院 ②福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院急診外科 ③泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部 ④天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ⑤南加州大學(xué) 凱克醫(yī)學(xué)中心 諾里斯綜合癌癥中心

目的：研究DNA去甲基化藥物地西他濱與Zeste基因增強(qiáng)子同源物2（Enhancer of Zeste Homolog 2，EZH2）抑制劑GSK126聯(lián)合應(yīng)用對調(diào)節(jié)結(jié)腸癌EZH2-p16信號的抗腫瘤作用。方法：將結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620分為4組,對照組、地西他濱單藥組、GSK126單藥組、地西他濱與GSK126聯(lián)合用藥組。用細(xì)胞增殖率測定SW620細(xì)胞的增殖能力，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測p16基因的表達(dá)。結(jié)果：地西他濱藥物聯(lián)合應(yīng)用對SW620細(xì)胞有顯著的抑制作用（P＜0.05），p16基因表達(dá)上調(diào)。結(jié)論：地西他濱聯(lián)合GSK126對結(jié)腸癌SW620細(xì)胞有強(qiáng)大抑制作用，其機(jī)制可能與調(diào)控p16基因有關(guān)。

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，在癌癥中排名第3位，其五年生存率為 65%[1]。異常表觀基因組是結(jié)腸癌和其他癌癥的關(guān)鍵特征[2-3]。結(jié)腸癌不僅是表觀遺傳效應(yīng)物，而且是攜帶異常DNA甲基化（5-甲基胞嘧啶或5mC），目前在臨床是有發(fā)現(xiàn)突變存在于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a基因（DNMT3A）以及Zeste基因增強(qiáng)子同源物2（EZH2）。p16基因是腫瘤抑制基因，作用于細(xì)胞周期，誘導(dǎo)凋亡，反映結(jié)腸癌分化和浸潤程度。之前，已開展的研究已經(jīng)全面觀察到了抑癌基因啟動子等在腫瘤中DNA甲基化的增加，基因表達(dá)降低[4-7]，在胰腺癌中也發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶-1（DNMT-1）去甲基化，并試圖使沉默p16基因再表達(dá)[8]。因此，結(jié)合前期已有研究以及目前研究新方法，我們可以得出，結(jié)合表觀遺傳治療，結(jié)腸癌實(shí)質(zhì)上是一種可治療成功的疾病。

美國FDA目前是批準(zhǔn)地西他濱（5-氮雜-2'-脫氧胞苷）進(jìn)入市場并確定可以將其用于骨髓增生異常綜合征（MDS）的治療[9]，但是，實(shí)質(zhì)上因?yàn)獒t(yī)學(xué)知識的普及和進(jìn)入市場的種種限制因素，目前其實(shí)只有少數(shù)患者從中受益[10]。從這一個(gè)角度出發(fā)，盡力且快速尋找合理組合來增強(qiáng)抗腫瘤治療反應(yīng)的是十分迫切的。有報(bào)道下調(diào)H3K27me3-p16途徑，降低EZH2表達(dá)，促進(jìn)p16基因表達(dá)上調(diào)[11]，同時(shí)GSK126作為EZH2的抑制劑，也進(jìn)入了目前的臨床試驗(yàn)的階段[12]。觀察地西他濱緊密聯(lián)合GSK126對于EZH2-p16的信號的調(diào)節(jié)作用，從而試圖激活p16基因轉(zhuǎn)錄和后期的抗腫瘤作用，進(jìn)而嘗試提供參考的治療新方法與新路徑。

1 材料

實(shí)驗(yàn)者將來自于美國Norris的癌癥中心的人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620置于RPMI-1640的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱設(shè)置37℃、5% CO2，靜待與觀察細(xì)胞長至70%-80%，進(jìn)行傳代用DPBS和胰酶。地西他濱采購源于Sigma公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞增殖能力測定

SW620對數(shù)生長期細(xì)胞的取出后，同樣是按照梯度，依次把含地西他濱的培養(yǎng)液通過2、1、0.3、0.05μmol/L濃度細(xì)致加入，24小時(shí)之后操作者將統(tǒng)一棄除含藥培養(yǎng)液,并重新再加入新鮮培養(yǎng)液并繼續(xù)培養(yǎng)。共孵育7 d，最后再細(xì)致測定其細(xì)胞增殖率（給藥組細(xì)胞數(shù)量/對照組細(xì)胞數(shù)量）；按照以下濃度梯度再次細(xì)致依次10、2、0.5μmol/L加入含GSK126的培養(yǎng)液，并注意GSK126必須每24小時(shí)更換含藥培養(yǎng)液，余下的實(shí)驗(yàn)同上進(jìn)行。SW620對數(shù)生長期的細(xì)胞分為4組，其中包含1個(gè)對照組和3個(gè)給藥組（地西他濱組、GSK126組、地西他濱+GSK126聯(lián)合組）來作為對比。接著地西他濱組加入濃度為300 nmol/L地西他濱培養(yǎng)液，24小時(shí)后，細(xì)致棄除含藥培養(yǎng)液，進(jìn)而再加入新鮮的培養(yǎng)液后；GSK126組繼續(xù)加入濃度為500 nmol/L GSK126的培養(yǎng)液，切記必須每24小時(shí)更換含藥的培養(yǎng)液；聯(lián)合組同時(shí)加入地西他濱和GSK126，方法和上面的方法相同，周期是一共孵育4周。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測相關(guān)基因表達(dá)

操作者細(xì)致取對數(shù)生長期SW620細(xì)胞后，方法和上述實(shí)驗(yàn)方法一樣，收集每組2×106細(xì)胞，并使用RNeasy試劑盒來細(xì)致提取RNA，從而可以作為模板合成cDNA得第1鏈。使用Bio-RadCFX96 Real-Time PCR 對cDNA樣品來進(jìn)行實(shí)時(shí)的定量聚合酶鏈反應(yīng)，引物序列如下方的表1，每個(gè)反應(yīng)都設(shè)置了3個(gè)重復(fù)。體系為：TaqMan Mix 10μl，F(xiàn)/R引物各0.4μl，p16探針0.8μl，cDNA模板2μl，加ddH2O至20μl；條件如下：50℃ 2分鐘，94℃ 9分鐘，然后按94℃ 15秒，60℃ 1分鐘來進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。同時(shí)使用GAPDH來作內(nèi)參，通過比較2-ΔΔCt值來進(jìn)行相對定量的細(xì)致分析。

表1 基因引物序列

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

通過GraphPad Prism 5.0的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，數(shù)據(jù)用來表示；緊接著數(shù)據(jù)的比較是運(yùn)用雙因素方差來進(jìn)行差異比較的方法來完成的。

3 結(jié)果

3.1 地西他濱以及GSK126的聯(lián)合作用共同對結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的增殖的影響

地西他濱含藥量的藥濃度的梯度增加，按照下圖顯而易見，它們對SW620細(xì)胞生長的抑制也是一直在增強(qiáng)。值得注意的是，當(dāng)?shù)匚魉麨I的濃度大于0.3μmol/L，其對SW620細(xì)胞生長抑制作用就開始慢慢趨向平緩（圖1A）。但是在GSK126干預(yù)下，濃度由0增加到10μmol/L的時(shí)候，對SW620細(xì)胞抑制影響并不大（圖1B）。

圖1 地西他濱（A）和GSK126（B）對SW620細(xì)胞增殖的影響

3.2 地西他濱以及GSK126的聯(lián)合作用共同對結(jié)腸癌SW620細(xì)胞有強(qiáng)大抑制作用

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，在地西他濱聯(lián)合GSK126的合作干預(yù)下，在7d的時(shí)候，聯(lián)合作用對SW620細(xì)胞增殖的達(dá)到了最大的抑制作用（見圖2），而細(xì)胞增殖率此時(shí)的值為14.86%（P＜0.05），并且可以顯而易見地發(fā)現(xiàn)抑制作用持續(xù)至21d，就開始會慢慢逐漸減弱。因此我們可以得出結(jié)論，地西他濱以及GSK126的聯(lián)合作用的治療方案從數(shù)據(jù)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的意義上是可以判定為對結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖有者非常強(qiáng)大的抑制作用的。

圖2 地西他濱以及GSK126的聯(lián)合作用共同對SW620細(xì)胞增殖的影響（±s,n=3）

3.3 地西他濱和GSK126聯(lián)合激發(fā)p16基因的潛力

地西他濱上調(diào)p16基因表達(dá)，可以看出是依賴于DNA去甲基化。地西他濱聯(lián)合GSK126的綜合應(yīng)用相比地西他濱的單藥組，顯而易見地增強(qiáng)p16基因轉(zhuǎn)錄（見圖3）。這可以說明，地西他濱聯(lián)合GSK126的治療方案，通過EZH2-p16信號，從而誘導(dǎo)p16上調(diào)對結(jié)腸癌來進(jìn)行增殖的抑制。

圖3 在地西他濱和GSK126聯(lián)合作用對SW620細(xì)胞p16基因表達(dá)的影響（±s,n=3）

4 討論

從表觀遺傳的可塑性出發(fā)來看，其實(shí)質(zhì)是包括組蛋白修飾和DNA甲基化的[13-15]，其也涉及兩者（兩者指的是功能性增強(qiáng)子和啟動子元件）之間的平衡[16-17]。雖說DNA去甲基化藥物對基因表達(dá)的改變是有限的，但是值得一提的是，同時(shí)也說明其在結(jié)腸癌和其他癌癥的臨床試驗(yàn)中的有限的抗腫瘤作用[18]。抑制因子復(fù)合物PRC2核心亞單位是EZH2[19]，甲基化H3K27成為H3K27me3，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄沉默[20]，大多數(shù)去甲基化啟動子的基因?qū)嵸|(zhì)依然是保持沉默，一方面PRC2占據(jù)H3K27m3結(jié)構(gòu)域[21-22]，另一方面PRC2占據(jù)H3K4m3結(jié)構(gòu)域[23-24]?；谝陨辖Y(jié)果，實(shí)驗(yàn)者期望EZH2抑制劑來激活由于PRC2占據(jù)且保持沉默的大多數(shù)去甲基化基因，并且協(xié)同作用于與DNA去甲基化藥物，則可增強(qiáng)治療結(jié)腸癌的抗腫瘤活性。通過實(shí)驗(yàn)研究，本研究證實(shí)了地西他濱和GSK126共同作用下的介導(dǎo)EZH2-p16信號，從而達(dá)到誘導(dǎo)p16上調(diào)的結(jié)果。

基于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表觀遺傳可塑性實(shí)質(zhì)上可以歸納為基本是通過表觀遺傳并針對其進(jìn)行調(diào)控，而通過關(guān)鍵驅(qū)動因子基因突變后再導(dǎo)致癌癥侵襲性顯然是不成立的[25]。這些效應(yīng)實(shí)質(zhì)在消化系統(tǒng)腫瘤模型中，是可以做到部分逆轉(zhuǎn)的，我們可以很明顯看到，在地西他濱和GSK126的共同作用下，是可以做到減緩結(jié)腸癌增殖作用的，并且在治療后期也發(fā)現(xiàn)其可以增強(qiáng)治療反應(yīng)的，從而由此可為表觀遺傳學(xué)治療的概念提供基礎(chǔ)。組蛋白修飾以及DNA甲基化雙重表觀遺傳調(diào)節(jié)，以及增強(qiáng)EZH2-p16信號作用[26]，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果上來看，也大大助力于靶向表觀遺傳的可塑性來進(jìn)行深入研究的可能性和可行性，并將其作為阻礙結(jié)腸癌抵抗以及后續(xù)進(jìn)展的潛在可行手段。