張力凡,朱俊義

(通化師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 吉林省長(zhǎng)白山生物種質(zhì)資源評(píng)價(jià)及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 通化 134002)

在動(dòng)物生產(chǎn)中,日糧能量過(guò)剩會(huì)造成動(dòng)物體內(nèi)脂肪沉積,導(dǎo)致肥胖以及相關(guān)疾病的發(fā)生,進(jìn)而降低動(dòng)物的生產(chǎn)性能。先前的研究已經(jīng)表明,日糧脂肪攝入是機(jī)體脂肪沉積的重要因素,而動(dòng)物日常飲食中高脂肪日糧攝入增加會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)[1]。氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致疾病的出現(xiàn),從而對(duì)動(dòng)物的生產(chǎn)性能產(chǎn)生負(fù)面作用。近年來(lái),中草藥中所含的豐富的多糖、多酚和黃酮等生物活性物質(zhì)受到越來(lái)越多的關(guān)注[2]。車前草具有清肝明目、清熱解毒和抗菌抗炎等功效。此外,車前草還具有免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用,其發(fā)揮作用的主要成分是多糖、黃酮、萜類和皂苷等活性成分[3]。研究表明,車前草多糖(Plantain polysaccharide,PLP)能夠清除體內(nèi)自由基,降低氧化應(yīng)激反應(yīng),同時(shí)能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Toll樣受體通路,提高機(jī)體免疫能力[4,5]。關(guān)于PLP是否可改善高脂日糧飼喂導(dǎo)致的機(jī)體脂代謝異常和氧化應(yīng)激的研究較少。因此,本試驗(yàn)通過(guò)在高脂日糧中添加不同劑量PLP,探究PLP對(duì)高脂誘導(dǎo)小鼠的脂代謝和氧化應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物制備 車前草,購(gòu)自吉林大藥房;PLP,由吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院動(dòng)物生理教研室使用水提醇沉法提取、分離制備得到,提取步驟參照李官浩等[6]方法進(jìn)行,得率1.63%,純度>97%。

1.2 主要試劑 天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase,AST)檢測(cè)試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase,ALT)檢測(cè)試劑盒、過(guò)氧化氫酶(Catalase,CAT)檢測(cè)試劑盒、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)檢測(cè)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(High-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)檢測(cè)試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(Low-density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)檢測(cè)試劑盒、甘油三酯(Triglycerides,TG)檢測(cè)試劑盒、總膽固醇(Total cholesterol,TC)檢測(cè)試劑盒和葡萄糖(Glucose,GLU)檢測(cè)試劑盒,均購(gòu)自南京建成生物工程有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)所需的150只SPF級(jí)雄性健康昆明小鼠由吉林省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(吉)2021—0001],初始體重為(21.36±1.08) g。試驗(yàn)小鼠在(23±3) ℃,光照黑暗時(shí)間為12 h/12 h的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。將小鼠隨機(jī)分成5個(gè)組,分別為對(duì)照(Control,CK)組、高脂日糧(High fat,HF)組、HF+100 mg/(kg·bw)PLP組、HF+200 mg/(kg·bw)PLP組和HF+400 mg/(kg·bw)PLP組,每組30只。CK組小鼠自由采食基礎(chǔ)日糧,每天灌胃0.5 mL純凈水;HF組小鼠自由采食高脂日糧,每天灌胃0.5 mL純凈水;HF+PLP組小鼠自由采食高脂日糧,每天灌胃0.5 mL PLP,每2天對(duì)各組小鼠進(jìn)行1次稱重,根據(jù)小鼠的平均體重配置PLP溶液,連續(xù)灌胃4周。每天記錄小鼠的采食量和飲水量。試驗(yàn)期間日糧配方設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表1。

表1 日糧配方設(shè)計(jì)方案Table 1 Diet formula design plan

1.4 樣品采集 試驗(yàn)結(jié)束前1天,對(duì)小鼠進(jìn)行禁食不禁水12 h,使用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,每組分別選取6只小鼠進(jìn)行采血,將血液樣本于4 ℃、3 000 r/min離心10 min,分離血清,置于4 ℃保存?zhèn)溆谩o(wú)菌采集小鼠肝臟,置于液氮中迅速冷凍,然后置于-80 ℃保存,用于后續(xù)相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

1.5 指標(biāo)的測(cè)定

1.5.1 小鼠血液生化指標(biāo)的測(cè)定 使用檢測(cè)試劑盒對(duì)小鼠血清中ALT和AST活性以及TG、TC、HDL-C和LDL-C含量進(jìn)行測(cè)定,具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。GLU采用己糖激酶法進(jìn)行測(cè)定,操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5.2 小鼠肝臟中TC和TG含量的測(cè)定 將小鼠肝臟組織勻漿,4 ℃、3 500 r/min離心15 min,取上清液,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作測(cè)定小鼠肝臟中TC和TG含量。

1.5.3 小鼠肝臟抗氧化能力的測(cè)定 取小鼠肝臟組織勻漿離心獲得的上清液,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定小鼠肝臟中SOD、GSH-Px和CAT活性以及MDA含量,肝臟中活性氧自由基(Reactive oxygen free species,ROS)含量使用熒光染料2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯并參考Kumar等[7]方法進(jìn)行測(cè)定,以相對(duì)熒光強(qiáng)度反映ROS含量。

1.5.4 小鼠肝臟中抗氧化和脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè) 將小鼠肝臟在液氮中進(jìn)行研磨,隨后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取小鼠肝臟中總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA樣品。運(yùn)用 Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的引物,引物序列見(jiàn)表2,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,目標(biāo)基因 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平使用2-ΔΔCt方法計(jì)算并以β-actin為內(nèi)參基因進(jìn)行校正。

表2 引物信息Table 2 Primer information

1.6 數(shù)據(jù)分析 使用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,數(shù)值表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 PLP對(duì)小鼠體重和血液生化指標(biāo)的影響 由表3可知,與CK組相比,HF組和HF+PLP組小鼠末體重均顯著升高(P<0.05),血清中TC、TG、LDL-C 和GLU含量以及ALT和AST活性均顯著升高(P<0.05)。與HF組相比,HF+200 mg/(kg·bw)PLP組和HF+400 mg/(kg·bw)PLP組小鼠末體重顯著降低(P<0.05),血清中TC、TG、LDL-C和GLU含量以及AST和ALT活性均顯著降低(P<0.05),HDL-C含量顯著升高(P<0.05);而HF+100 mg/(kg·bw)PLP組小鼠末體重、HDL-C和TG含量以及ALT活性差異不顯著(P>0.05)。

表3 車前草多糖對(duì)小鼠體重和血液生化指標(biāo)的影響Table 3 Effects of plantain polysaccharides on body weight and blood biochemical indexes in mice

2.2 PLP對(duì)小鼠肝臟中TC和TG含量的影響 由圖1可知,與CK組相比,HF組小鼠肝臟中TC和TG含量均顯著升高(P<0.05)。與HF組相比,添加不同濃度PLP均可降低小鼠肝臟中TC和TG含量,且該作用呈劑量依賴性,HF+200 mg/(kg·bw)PLP組和HF+400 mg/(kg·bw)PLP組均差異顯著(P<0.05)。

圖1 車前草多糖對(duì)小鼠肝臟中TC(A)和TG(B)含量的影響Fig.1 Effects of plantain polysaccharides on TC (A) and TG (B) contents in mouse liver不同小寫(xiě)字母表示組間差異顯著,P<0.05Different lowercase letters mean significant difference among groups,P<0.05

2.3 PLP對(duì)小鼠肝臟氧化應(yīng)激的影響 由表4可知,與CK組相比,HF組小鼠肝臟中SOD、CAT和GSH-Px活性顯著降低(P<0.05),而ROS和MDA含量顯著升高(P<0.05)。與HF組相比,添加200 mg/(kg·bw)和400 mg/(kg·bw)PLP顯著提高了高脂飲食小鼠肝臟中SOD、CAT和GSH-Px活性(P<0.05),而顯著降低了ROS和MDA含量(P<0.05);HF+100 mg/(kg·bw)PLP組小鼠肝臟中ROS含量顯著降低(P<0.05),SOD活性顯著升高(P<0.05),而CAT和GSH-Px活性以及MDA含量差異不顯著(P>0.05)。

表4 車前草多糖對(duì)小鼠肝臟氧化應(yīng)激的影響Table 4 Effects of plantain polysaccharides on oxidative stress in mouse liver

2.4 PLP對(duì)小鼠肝臟中抗氧化和脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響 如圖2所示,與CK組相比,HF組小鼠肝臟中抗氧化相關(guān)基因Nrf2和HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05);日糧中添加PLP則顯著提高了Nrf2和HO-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。與CK組相比,HF組小鼠肝臟中脂代謝相關(guān)基因Lpl和Scd1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05),而Cyp7αl mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。與HF組相比,日糧中添加PLP則顯著提高了CyP7αl mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05),顯著降低了Lpl和Scd1 mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。

圖2 車前草多糖對(duì)小鼠肝臟中抗氧化和脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.2 Effects of plantain polysaccharides on expressions of antioxidant and lipid metabolism related genes in mouse liverA:Nrf2; B:HO-1; C:Lpl; D:Cyp7αl; E:Scd1

3 討論

肥胖癥被認(rèn)為是一個(gè)重要的健康問(wèn)題,主要是因?yàn)樗c危及生命的慢性疾病密切相關(guān)[8]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,HF飲食飼喂的小鼠出現(xiàn)了血糖異常、高脂血癥和脂肪肝,這些是代謝綜合征的主要參數(shù)。而這些由HF飲食引起的小鼠異常病理生理狀況通過(guò)在日糧中補(bǔ)充PLP得到改善。

臨床中常用TC、TG、LDL-C和HDL-C指標(biāo)來(lái)診斷高脂血癥,本試驗(yàn)結(jié)果表明,HF日糧可引起小鼠高脂血癥的發(fā)生,這與其他研究的結(jié)果一致[9,10];給小鼠飼喂HF飲食可導(dǎo)致小鼠血清中TC、TG和LDL-C含量升高,在小鼠日糧中添加PLP后,小鼠血清中TC、TG和LDL-C含量顯著降低,HDL-C含量顯著升高,小鼠脂代謝異常得到改善。有研究表明,肥胖引起的小鼠脂代謝異常往往伴隨著機(jī)體糖代謝異常[11]。Miah等[12]研究表明,HF飲食喂養(yǎng)的大鼠出現(xiàn)了葡萄糖耐受不良。張利娜等[13]研究也指出,給小鼠飼喂高脂飲食后,小鼠GLU顯著升高,與本試驗(yàn)結(jié)果一致;而日糧中添加PLP降低了HF日糧引起的小鼠GLU升高。研究表明,多糖可通過(guò)改善機(jī)體胰島素敏感性、調(diào)節(jié)糖代謝過(guò)程中關(guān)鍵酶α-葡萄糖苷酶的活性和改變腸道菌群等方式改善肥胖引起的機(jī)體糖代謝異常[14]。血清中ALT和AST活性增高提示肝臟中線粒體被破壞,細(xì)胞膜通透性增加,機(jī)體出現(xiàn)肝損傷[15]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,飼喂小鼠HF日糧會(huì)引起小鼠血清中ALT和AST活性以顯著升高,而日糧中添加PLP降低了小鼠血清中ALT和AST活性,表明PLP改善了小鼠高脂飲食引起的肝損傷。

肥胖與日糧中脂肪的攝入密切相關(guān),且高脂日糧會(huì)增加哺乳動(dòng)物的氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激反應(yīng)增加可導(dǎo)致體內(nèi)ROS增加,而ROS增多可引起抗氧化酶活性的變化[16]。研究表明,高脂日糧攝入會(huì)導(dǎo)致腎臟中的ROS含量和肝臟中的MDA含量顯著升高,腎臟中SOD和CAT活性顯著降低[17]。陳麗梅等[18]研究發(fā)現(xiàn),高脂飼喂小鼠能夠顯著提高肝臟中ALT和AST活性,對(duì)肝臟功能有一定損傷,此外,該研究還發(fā)現(xiàn),小鼠肝臟中MDA含量顯著升高,SOD活性和總抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)顯著降低,這些結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果一致,HF飲食顯著降低肝臟中SOD、CAT和GSH-Px活性,而顯著提高ROS和MDA含量。研究表明,在HF飲食中添加植物多糖能夠提高動(dòng)物體內(nèi)抗氧化酶(如SOD和CAT等)活性[19,20]。本試驗(yàn)結(jié)果也顯示,日糧中添加PLP提高了HF飲食導(dǎo)致的小鼠肝臟中SOD、CAT和GSH-Px活性的降低,并降低了ROS和MDA含量。在本試驗(yàn)中,日糧中添加PLP顯著上調(diào)了HF飲食小鼠肝臟中Nrf2和HO-1的表達(dá),表明PLP可能通過(guò)激活Nrf2-HO-1通路和提高抗氧化酶活性來(lái)緩解HF飲食導(dǎo)致的氧化應(yīng)激。

此外,本試驗(yàn)還測(cè)定了脂代謝相關(guān)基因Lpl、Cyp7αl和Scd1的表達(dá)。Cyp7αl是膽汁酸合成經(jīng)典途徑的限速酶,催化膽固醇在肝臟分解為膽汁酸;Scd1是催化肝細(xì)胞中飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為單不飽和脂肪酸的限速酶;Lpl是影響乳糜微粒(Chylomicron,CM)和極低密度脂蛋白(Very low density lipoprotein,V-LDL)等脂蛋白代謝的關(guān)鍵因子,Lpl基因表達(dá)異?？稍斐蓢?yán)重的以甘油三酯水平升高為主要特征的高乳糜微粒血癥,并出現(xiàn)一系列臨床癥狀[21,22]。研究表明,HF飲食導(dǎo)致小鼠肝臟中Cyp7αl mRNA的表達(dá)下調(diào),Lpl和Scd1 mRNA的表達(dá)顯著上調(diào);而類蟲(chóng)草多糖巨寡糖的添加顯著上調(diào)HF飲食小鼠肝臟中Cyp7αl mRNA的表達(dá),顯著下調(diào)了Lpl和Scd1 mRNA的表達(dá)[22]。本試驗(yàn)結(jié)果與此一致,日糧中添加PLP顯著上調(diào)HF飲食小鼠肝臟中Cyp7αl基因的表達(dá),顯著下調(diào)Lpl和Scd1基因的表達(dá),表明PLP可通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠肝臟中脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)而改善HF飲食導(dǎo)致的小鼠肝臟脂代謝異常。

綜上所述,本試驗(yàn)結(jié)果表明,飼喂小鼠HF飲食會(huì)引起其脂代謝異常和氧化應(yīng)激,并導(dǎo)致小鼠高脂血癥。而PLP能夠改善HF飲食小鼠脂代謝相關(guān)指標(biāo),提高肝臟中抗氧化酶的活性,并改善HF飲食引起的小鼠氧化應(yīng)激。