于洪敏,單春喬,梁方印,李 娟,王 巖,劉 艷

(1. 大連三儀動物藥品有限公司,遼寧 大連 116000 ; 2. 濮陽縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,河南 濮陽 457000)

急性腹瀉引起的豬群胃腸道感染是十分棘手的問題,也是導(dǎo)致仔豬死亡的重要原因之一,該病的傳播嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。該病可由病毒、細(xì)菌和寄生蟲引起,而在這幾種病原體中,豬輪狀病毒(Rotavirus,RV)被認(rèn)為最重要且最常見[1]。豬輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科、輪狀病毒屬,在我國生豬養(yǎng)殖業(yè)中廣泛存在,特別是密集型商業(yè)養(yǎng)豬場尤為易感,且該病毒引起的豬場大規(guī)模感染和腹瀉不分年齡階段[2],因此研發(fā)有效防治該病毒的藥物或疫苗至關(guān)重要。本文簡述了豬輪狀病毒的特點(diǎn)及其抗原蛋白的特性,以期獲得一些基線信息,制定未來的防疫策略,保護(hù)養(yǎng)豬業(yè)免受這一重要病原體的影響。

1 豬輪狀病毒感染的臨床癥狀

豬輪狀病毒感染發(fā)生于10～60日齡仔豬,發(fā)病率高達(dá)80%,新生仔豬感染該病毒后的死亡率可達(dá)100%。該病毒感染引起的主要癥狀是精神萎靡、厭食、不愿走動,仔豬患嚴(yán)重的胃腸炎和小腸病變,出現(xiàn)脫水性腹瀉,同時該病毒還可破壞機(jī)體的酸堿平衡,致使仔豬生長緩慢,嚴(yán)重制約了我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展,給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。近年來,不僅越來越多的仔豬由于感染豬輪狀病毒而發(fā)生死亡,大豬和種豬往往也呈隱性感染,而且一旦感染豬輪狀病毒,會嚴(yán)重影響機(jī)體的生長發(fā)育,即使恢復(fù)健康的成年豬也會停止生長,豬場淘汰率明顯升高。

2 豬輪狀病毒的病原學(xué)特征

豬輪狀病毒的外形似車輪,無囊膜,呈二十面體對稱,中央為核酸構(gòu)成的芯髓,呈致密的六角形(圖1)[6],該病毒核酸中富含大量的A/T堿基對,含量大約在65%,這也是其與大多數(shù)病毒的不同之處。豬輪狀病毒是分節(jié)的雙鏈RNA(Double-stranded RNA,dsRNA)病毒,由11個片段編碼6個結(jié)構(gòu)蛋白和6個非結(jié)構(gòu)蛋白,結(jié)構(gòu)蛋白包括VP1、VP2、VP3、VP4、VP6和VP7,非結(jié)構(gòu)蛋白包括NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5和NSP6[7],各種蛋白的電泳遷移情況如圖2所示[8]。病毒粒子由3層衣殼蛋白構(gòu)成,最內(nèi)層由VP2及少量VP1和VP3蛋白組成,三者共同包裹病毒基因組RNA,形成病毒基因組的核心封裝和復(fù)制復(fù)合體,是病毒基因轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中不可缺少的蛋白;中間層由VP6 蛋白組成,呈輻條狀;最外一層由VP7和VP4兩種蛋白質(zhì)組成,其中VP7蛋白形成病毒的光滑表面,VP4蛋白形成病毒顆粒的尖峰,二者是病毒血清型的主要決定因素[9,10]。

圖1 豬輪狀病毒的病毒粒子結(jié)構(gòu)示意圖[6]Fig.1 Schematic diagram of the viral particlestructure of porcine rotavirus[6]

圖2 豬輪狀病毒雙鏈RNA及其編碼蛋白的電泳遷移譜[8]Fig.2 Electrophoretic migration profiles of viral dsRNA and encoded proteins[8]

3 豬輪狀病毒的分群依據(jù)和各群差異

豬輪狀病毒VP6蛋白既是核衣殼蛋白也是該病毒的群抗原,根據(jù)VP6的抗原特性,將該病毒分為A～J共10個基因群,其中與豬的臨床和經(jīng)濟(jì)密切相關(guān)的常見群體是A、B和C基因群,而家畜育種中常診斷出A群輪狀病毒感染,因此,A群輪狀病毒被認(rèn)為是引起豬腹瀉的主要基因群[11]。根據(jù)糖蛋白VP7(G型)和外衣殼蛋白VP4(P型)的抗原特性,可將輪狀病毒分為G型和P型,A群豬輪狀病毒的12個G基因型和16個P基因型都與豬相關(guān),G3、G4、G5、G9和G11是豬最常見的G基因型,最常見的基因型組合為G9P[23]、G4P[6]和G9P[32];C群豬輪狀病毒有G1、G3、G5～G10基因型,而與之相組合的P基因型是由不同毒株間基因的親緣關(guān)系決定的[12,13]。為了評估豬輪狀病毒之間的遺傳差異,不少學(xué)者使用這種雙重遺傳分類方法,目前該方法已被廣泛接受并應(yīng)用于基因型的鑒定,基于雙重分型系統(tǒng),國內(nèi)外已經(jīng)發(fā)表了多篇基于雙重分型系統(tǒng)的豬基因型研究相關(guān)文獻(xiàn)。

4 豬輪狀病毒抗原蛋白的致病機(jī)理

豬輪狀病毒的病毒粒子表面有3種抗原蛋白:中和抗原、群抗原和血凝素抗原。中和抗原主要由第9節(jié)段編碼的外殼糖蛋白VP7所決定;群抗原與多種結(jié)構(gòu)蛋白相關(guān),主要是由第6節(jié)段編碼的內(nèi)衣殼蛋白VP6所決定;血凝素抗原由第4節(jié)段編碼的外衣殼蛋白VP4所決定。感染早期,豬輪狀病毒經(jīng)黏膜感染引起消化道病變,最嚴(yán)重的部位是小腸,病毒粒子主要集中在小腸絨毛頂部表面的成熟吸收上皮細(xì)胞中,導(dǎo)致小腸從上部到下部均發(fā)生病變。感染后期,該病毒破壞成熟的腸細(xì)胞,導(dǎo)致腸道吸收不良或發(fā)生滲透性腹瀉,在感染動物的血液和全身器官中可以檢測到病毒抗原、基因組RNA和感染性顆粒[14,15]。

4.1 抗原蛋白VP4致病機(jī)理 VP4蛋白具有血凝作用,能夠促進(jìn)病毒入侵、融合細(xì)胞膜,與病毒粘附、侵入和血凝性相關(guān),此外,VP4蛋白還決定病毒毒力,是病毒的主要識別因子之一,其可介導(dǎo)血清型特異性,在病原檢測和中和抗體產(chǎn)生以及免疫性保護(hù)過程中都具有重要意義[16,17]。病毒感染后,VP4蛋白與宿主細(xì)胞相互作用,參與受體結(jié)合和細(xì)胞滲透,VP4蛋白可被蛋白酶水解,被切割成C端VP5和N端VP8兩條長度不等的片段,裂解后增強(qiáng)了病毒的感染能力。酶解后的VP5在最初被靶細(xì)胞攝取后穿過包圍它的囊泡膜的脂質(zhì)雙分子層,使細(xì)胞膜的滲透性增加,從而促進(jìn)病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi);VP8含有能粘附唾液酸的部位,可將病毒附著在其細(xì)胞受體上,改變上皮細(xì)胞的分子結(jié)構(gòu)和功能,對上皮細(xì)胞造成破壞,導(dǎo)致小腸絨毛長度變短、密度降低,來自腸隱窩的未成熟細(xì)胞代替成熟細(xì)胞,從而引起吸收障礙、消化不良和滲透性腹瀉[18,19]。

4.2 抗原蛋白VP6致病機(jī)理 結(jié)構(gòu)蛋白VP6具有抗原特異性、免疫原性和轉(zhuǎn)錄活性,能夠參與病毒轉(zhuǎn)錄,并與其他蛋白發(fā)生相互作用,指導(dǎo)結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的合成,對于病毒感染細(xì)胞、病毒復(fù)制和發(fā)揮致病功能都十分重要。在病毒感染早期,VP6蛋白主動誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)并產(chǎn)生免疫球蛋白A(Immunoglobulin A,IgA),聚合型IgA能夠使輪狀病毒從腸上皮細(xì)胞的基底外側(cè)膜經(jīng)胞漿作用進(jìn)入腸腔,并使產(chǎn)生IFN-γ的T細(xì)胞顯著增多,誘導(dǎo)多種促炎細(xì)胞因子和趨化因子的分泌[20]。

4.3 抗原蛋白VP7致病機(jī)理 糖蛋白VP7是病毒外衣殼中含量最高的蛋白,其高度保守,是病毒的主要識別因子,能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫,并產(chǎn)生特異性抗體IgA和IgG[21,22]。VP7蛋白作為最外層的衣殼蛋白,可介導(dǎo)病毒粒子的吸附,并通過與細(xì)胞表面的整合素受體α2β1和α4β1結(jié)合,使豬輪狀病毒粘附并進(jìn)入細(xì)胞[22]。VP7蛋白的結(jié)構(gòu)是可維持鈣離子穩(wěn)定的三聚體,因此能幫助VP4蛋白錨定在病毒粒子感染的細(xì)胞表面,通過鈣離子依賴性結(jié)合鈣離子,從而應(yīng)對感染早期鈣離子的損失,具有穩(wěn)定VP4蛋白結(jié)構(gòu)和保障VP4蛋白發(fā)揮功能的作用[23,24]。

5 豬輪狀病毒抗原蛋白的免疫學(xué)特性

目前,臨床中尚無針對豬輪狀病毒的特效藥物,盡管接種疫苗是防控該病毒感染的主要方法,但仔豬因感染該病毒而引起的嚴(yán)重腹瀉仍未完全解決。豬輪狀病毒多經(jīng)黏膜感染機(jī)體,所以口服免疫可能是較為理想的預(yù)防途徑?？诜庖呖捎行Т碳ゐつっ庖呒?xì)胞產(chǎn)生分泌型免疫球蛋白A(Secretory immunoglobulin A,sIgA),并進(jìn)一步引起全身免疫反應(yīng),由此一些學(xué)者便試圖從豬輪狀病毒抗原蛋白免疫學(xué)特性的相關(guān)研究中找到能有效控制該病的方法,研究內(nèi)容見表1。

表1 豬輪狀病毒抗原蛋白的免疫學(xué)特性相關(guān)研究Table 1 Study on immunogenic characteristics of porcine rotavirus antigenic protein

6 小結(jié)

豬輪狀病毒病是生豬養(yǎng)殖過程中的一種常見疾病,尤其是由其導(dǎo)致的仔豬腹瀉頻繁暴發(fā),給養(yǎng)豬場帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。VP4、VP6和VP7蛋白是豬輪狀病毒主要的抗原蛋白,也是導(dǎo)致腹瀉的重要毒力因子,最近有文獻(xiàn)報道除上述3種蛋白外,腸毒素NSP4蛋白也是該病毒的主要毒力因子之一,與該病毒引起的腹瀉密切相關(guān)[34],雖然尚沒有研究顯示NSP4屬于豬輪狀病毒的抗原蛋白,但該蛋白在病毒粒子的裝配和感染過程中也起到了重要作用,且對與其共免疫的抗原具有增強(qiáng)免疫原性的佐劑作用,可作為重要的抗原免疫刺激劑[35,36]。豬輪狀病毒抗原蛋白相關(guān)特性的深入研究對亞單位疫苗的研制至關(guān)重要,其應(yīng)用前景十分廣闊,尤其在無特效治療藥物和理想疫苗的情況下,對豬群腹瀉的防治和人類公共衛(wèi)生的提升均具有重要意義,有望使豬輪狀病毒病得到有效的防控。