張 涵,華文靜,李文潔,閆 滿,沙萬里

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院,吉林 吉林 132109)

近年來,關(guān)于氣球菌致病的報道日益增多,該類菌屬廣泛存在于土壤、空氣、植物和醫(yī)療環(huán)境中。目前,已確定的氣球菌屬包括綠色氣球菌(Aerococcusviridans)、脲氣球菌(Aerococcusurinae)、人脲氣球菌(Aerococcusurinaehominis)、血?dú)馇蚓?Aerococcussanguinicola)、柯氏氣球菌(Aerococcuschristensenii)、豬氣球菌(Aerococcussuis)、馬脲氣球菌(Aerococcusurinaeequi)和陰道氣球菌(Aerococcusvaginalis)共8個不同菌種[1]。其中,綠色氣球菌可感染人類和動物[2,3];人脲氣球菌和脲氣球菌在老年人的尿道中被證實(shí)與尿路感染有關(guān)[4,5];柯氏氣球菌在人血中被證實(shí)與人類心肌內(nèi)膜炎有關(guān)[6];血?dú)馇蚓谌岁幍乐斜蛔C實(shí)與人類陰道炎有關(guān)[7];豬氣球菌在豬腦中被證實(shí)與豬腦膜炎有關(guān)[8];陰道氣球菌在奶牛陰道中被證實(shí)與奶牛陰道炎有關(guān)[9]。

根據(jù)目前的國內(nèi)外報道,馬脲氣球菌曾經(jīng)在患足趾炎的蛋雞、牛的凍乳和豬的尿液中被發(fā)現(xiàn)[10-12]。2016年,Zhou等[13]在1名慢性腎病患者的腹水中分離出馬脲氣球菌,確定了該菌對人類具有致病性。目前尚未見犬感染馬脲氣球菌的研究報道。本試驗(yàn)從臨床患尿道感染的母犬尿道中分離到1株馬脲氣球菌,并對其生物學(xué)特性和藥物敏感性進(jìn)行初步研究,以期對馬脲氣球菌病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源 吉林省某犬舍患有尿道炎母犬的尿道拭子,母犬表現(xiàn)為尿頻,尿道出現(xiàn)白色膿性分泌物,精神沉郁。

1.2 主要試劑 腦心浸出液瓊脂(Brain heart infusion agar,BHIA)培養(yǎng)基、水解酪蛋白瓊脂(Mueller hinton,MH)培養(yǎng)基和腦心浸出液肉湯(Brian heart infusion,BHI)培養(yǎng)基,均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和50×TAE緩沖液,均購自生工生物工程(上海)股份有限公司;PremixTaq(ExTaqVersion),購自TaKaRa Biotechnology;微量生化管和藥敏紙片,均購自杭州微生物試劑有限公司;核酸染料和革蘭染色試劑,均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 主要儀器 超凈工作臺和PCR儀,均購自賽默飛世爾科技公司;恒溫氣浴振蕩器,購自上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司;高速離心機(jī),購自鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;凝膠成像儀,購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司。

1.4 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 將采集的尿道拭子接種于BHIA培養(yǎng)基,37 ℃需氧培養(yǎng)12 h后進(jìn)行分離純化培養(yǎng),鏡檢至細(xì)菌形態(tài)單一后命名為ZH-4,將ZH-4接種于BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h,備用。

1.5 染色鏡檢 載玻片用酒精擦拭后,挑取單菌落用無菌生理鹽水稀釋,在酒精燈外焰加熱固定,革蘭染色法染色,油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.6 生化試驗(yàn) 挑取純化培養(yǎng)后的ZH-4接種于微量生化管,37 ℃培養(yǎng)18 h,操作過程和結(jié)果判定參照微量生化管說明書和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》第8版。

1.7 16S rRNA基因序列測定 使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取ZH-4的DNA,PCR擴(kuò)增引物為細(xì)菌16S rRNA通用引物[14],引物序列為:16S rRNA-F:5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,16S rRNA-R:5′-AG-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3′,引物由庫美生物科技有限公司合成。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,其切膠純化產(chǎn)物送往生工生物工程(長春)股份有限公司測序。

1.8 系統(tǒng)進(jìn)化分析 分離菌株ZH-4的16S rRNA基因測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的不同種的細(xì)菌基因核苷酸序列進(jìn)行BLAST比對分析,并用DNASTRA 11.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.9 藥敏試驗(yàn) 采用常規(guī)紙片法檢測ZH-4對頭孢噻肟(Cefotaxime)、克林霉素(Clindamycin)、氯霉素(Chloroamphenicol)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin)、阿奇霉素(Azithromycin)、紅霉素(Erythromycin)、磺胺異噁唑(Sulfaisoxazole)、復(fù)方新諾明(Trimethoprim)、慶大霉素(Gentamicin)、青霉素(Penicillin)、苯唑西林(Oxacillin)、萬古霉素(Vancomycin)、多西環(huán)素(Deoxytetracycline)、四環(huán)素(Tetracycline)和阿莫西林(Amoxicillin)共15種抗菌藥物的藥物敏感性。結(jié)果判定參照藥敏紙片說明書。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)和染色鏡檢 將菌液涂布于BHIA培養(yǎng)基上,37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后進(jìn)行觀察,可見菌落特征為白色的圓形突起,并且表面光滑。革蘭染色結(jié)果顯示,分離菌株為革蘭陽性菌,形態(tài)為成對、四聯(lián)狀球菌(圖1)。

圖1 菌株ZH-4的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strain ZH-4A:菌落形態(tài)觀察; B:革蘭染色(1 000×)A:Colony morphology observation; B: Gram staining (1 000×)

2.2 生化試驗(yàn) 結(jié)果如表1所示,ZH-4對木糖、乳糖和蔗糖呈陰性,對海藻糖呈陽性,這與其他馬脲氣球菌的生化特性相同,但卻可以發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖和甘露醇,與其他馬脲氣球菌生化特性不同。

表1 菌株ZH-4生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Biochemical test results of strain ZH-4

2.3 16S rRNA基因序列測定 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示,可得到1條大小為1 468 bp的條帶,與目的條帶大小相符。測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對,該分離菌株與馬脲氣球菌相似性為97.99%,證實(shí)其為馬脲氣球菌。

圖2 馬脲氣球菌16S rRNA基因PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of 16S rRNA gene in Aerococcus urinaeequiM:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1:馬脲氣球菌 16S rRNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M:DNA molecular weight Marker; 1:PCR product of Aerococcus urinaeequi 16S rRNA

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析 系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖3所示,分離菌株ZH-4與其他同屬的6株馬脲氣球菌親緣關(guān)系較低,可能由于其他6株馬脲氣球菌均為人源(圖3)。

圖3 ZH-4菌株與其他馬脲氣球菌16S rRNA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA genes of ZH-4 strain and other Aerococcus urinaeequi▲:本試驗(yàn)所得分離菌株▲:The strain isolated in this study

2.5 藥敏試驗(yàn) 結(jié)果如表2所示,ZH-4對頭孢噻肟、克林霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星、阿奇霉素、紅霉素、磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明、慶大霉素、青霉素、苯唑西林和萬古霉素均耐藥,對多西環(huán)素和四環(huán)素敏感。

表2 ZH-4菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Drug sensitivity test results of strain ZH-4

3 討論

氣球菌病是一種常見的人獸共患病,其病原氣球菌作為一種條件致病菌,在開放性外傷、免疫功能低下的情況下,可能會引起菌血癥、敗血癥、敗血型關(guān)節(jié)炎和心內(nèi)膜炎等疾病。氣球菌中綠色氣球菌較為常見,易引發(fā)多種動物發(fā)生疾病,也出現(xiàn)過人畜相互傳染的報道。對于馬脲氣球菌,雖然尚未有人畜間傳播的病例,但仍需警惕該病菌的傳播。此外,由于目前對馬脲氣球菌的了解較少,對其可能導(dǎo)致患病的部位也難以確定。Heidemann等[10]曾在患有足趾炎的蛋雞中分離出1株馬脲氣球菌;Júnior等[11]曾在冷凍生乳中發(fā)現(xiàn)過馬脲氣球菌。由此可見,需要盡早對馬脲氣球菌采取有效的防治措施。

本試驗(yàn)從采集的犬尿道拭子中分離得到菌株ZH-4,通過對菌落進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)、生化試驗(yàn)、16S rRNA序列測定和系統(tǒng)進(jìn)化分析,鑒定分離菌株ZH-4為馬脲氣球菌;藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,ZH-4對四環(huán)素和多西環(huán)素敏感。但Yang 等[12]在2021年分離獲得的馬脲氣球菌對四環(huán)素表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性,并通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)其有2個新的四環(huán)素抗性基因——tet(58)和tet(61)。本藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,馬脲氣球菌ZH-4對萬古霉素和紅霉素耐藥,這與Zhou等[13]在1名慢性腎病患者的腹水中分離獲得的馬脲氣球菌的耐藥情況相同。此外,ZH-4作為首次在犬尿道拭子中發(fā)現(xiàn)的馬脲氣球菌,其在藥敏試驗(yàn)中也表現(xiàn)出了對頭孢噻肟、克林霉素和氯霉素等多達(dá)12種抗菌藥物具有較強(qiáng)的耐藥性,對四環(huán)素和多西環(huán)素表現(xiàn)敏感。本試驗(yàn)首次從犬尿道分離到馬脲氣球菌,并對其進(jìn)行基本生物學(xué)特性分析,為該細(xì)菌所致犬尿道炎的臨床診療提供理論依據(jù)。